鼠疫是广泛流行于野生啮齿类动物间的一种古老自然疫源性疾病，其病原体为鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）。鼠疫菌可能由肠道致病菌假结核耶尔森菌（Y. pseudotuberculosis）进化而来^[1-2]，存在着遗传稳定性与遗传变异性^[3]。鼠疫自然疫源地内鼠疫菌从外界环境获取新的基因，产生相应的新生物学功能，并且能够适应这些基因所带来的生物学性状及功能的改变^[4]。目前实验室所使用的鼠疫诊断噬菌体对鼠疫菌高度特异，28 ℃和37 ℃培养条件下均能裂解鼠疫菌^[5]。本实验室在菌株鉴定过程中发现1株分离自内蒙古自治区（内蒙古）布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）体内的田鼠型鼠疫菌90017对鼠疫诊断噬菌体不完全裂解。本研究通过动物实验和鼠疫噬菌体裂解试验描述固体琼脂培养基上生长的鼠疫菌90017表型特征，为探究细菌抵抗噬菌体机制、鼠疫疫源地鼠疫菌长期保存机制和传染病进化流行病学研究提供理论依据。

菌株90017分离自20世纪70年代内蒙古布氏田鼠鼠疫疫源地布氏田鼠。对照鼠疫菌141分离自20世纪50年代青海省喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）鼠疫疫源地喜马拉雅旱獭。菌株由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。

由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室制备，批号：2023-1，效价为10^-9。

1%溶血赫氏培养基由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室培养基室提供。

健康雌性BALB/c小鼠购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，体质量18~20 g，饲养条件为21~23 ℃。

恒温培养箱、小鼠隔离笼具由青海省地方病预防控制所鼠疫菌专业实验室提供。中国细菌浊度标准国家标准品购自中国食品药品检定研究院（批号：230021-202364）。

分别勾取90017和141菌苔，采用三段划线法在1%溶血赫氏培养基上三区划线，使鼠疫菌90017和141在琼脂平板表面充分散开，分别置于28 ℃和37 ℃培养24~72 h。

上述培养结束后以密集划线的方式涂布于另一个1%溶血赫氏培养基表面，于划线区域一侧滴加鼠疫诊断噬菌体20 μl，倾斜平板使其垂直流过划线区域，置于28 ℃培养。

分别勾取90017 28 ℃ 24 h培养物和37 ℃ 24 h培养物，用灭菌生理盐水制成菌悬液，采用目测法比浊，稀释为2×10⁹、1×10⁶、1×10⁵个/ml菌悬液，按照表 1中的注射剂量、动物只数，皮下注射于BALB/c小鼠鼠鼷部，小鼠于隔离笼中分笼饲养观察，取死亡动物肝、脾、肺、心组织在1%溶血赫氏培养基上压印，进行细菌培养，以分离出鼠疫菌为特异性死亡。

表 1 鼠疫菌90017动物实验攻击剂量和细菌培养结果 Table 1 Phage titer and lysis of Yersinia pestis 90017 in animal experiments

表选项

菌株90017经28 ℃培养24 h后，细菌生长缓慢，菌落呈碎玻璃状，经28 ℃培养72 h后，菌落中央呈不规则“煎蛋”样外观，边缘整齐，见图 1。对照鼠疫菌141经28 ℃培养48 h后，呈现典型的鼠疫菌形态，即菌落中央隆起，中心发暗，有黄褐色粗糙颗粒。

图 1 鼠疫菌90017经28 ℃培养24 h和72 h后的菌落形态（×4） Figure 1 Colony morphology of Yersinia pestis 90017 cultured at 28 ℃ after 24 h and 72 h (×4)

图选项

鼠疫菌90017经鼠疫诊断噬菌体28 ℃裂解24 h后，划线区域有稀疏菌苔，噬菌带中央残留碎玻璃状、不典型菌落碎片，经28 ℃培养48~100 h后，鼠疫诊断噬菌体滴下及流过的区域除了受侵蚀的残余鼠疫菌落，还有个别较完整的鼠疫菌落生长。对照鼠疫菌141划线区域有明显菌苔，鼠疫诊断噬菌体滴下及流过的区域无细菌生长，形成的噬菌带宽于噬菌体流过的痕迹。见图 2。

图 2 鼠疫菌90017和对照株141经28 ℃培养48 h后的鼠疫噬菌体裂解试验结果（×4） Figure 2 The result of plague phage test on Yersinia pestis 90017 and control strain 141 cultured at 28 ℃ after 48 h (×4)

图选项

28 ℃ 24 h和37 ℃ 24 h培养的菌株90017经目测比浊法稀释，皮下接种于BALB/c小鼠，见表 1。注射1×10⁹个鼠疫菌的小鼠于第2天全部死亡，细菌培养试验和鼠疫噬菌体裂解试验均为阴性。注射5×10⁴~5×10⁵个鼠疫菌的小鼠在注射后第4天仍存活，但精神状态较差，体毛竖立。采用颈椎断裂法处死小鼠，细菌培养试验和鼠疫噬菌体裂解试验均为阳性，但经24~72 h培养后噬菌带中央仍有未完全裂解的鼠疫菌落。见图 2、表 1。

自然界细菌和噬菌体之间进行着进化军备竞争^[6-7]。细菌与噬菌体共同进化过程中，细菌针对噬菌体生命周期各阶段演化出一系列抵御策略，包括抑制噬菌体吸附、超感染排斥、限制修饰系统、规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）（CRISPR-Cas）系统流产感染、组装干扰、群体感应对噬菌体的调控等^[8]。其中吸附抑制可能是细菌免疫噬菌体采取的最“昂贵”的机制，如改变受体、竞争性抑制、分泌细胞外基质等^[9]。国外学者研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在实验室和自然界对噬菌体的抗性时发现，在实验室环境中细菌的突变往往会导致噬菌体感染所依赖的附着受体缺陷；而在自然环境中细菌倾向于使用被称为CRISPR-Cas的免疫机制产生抵抗力，且通过CRISPR进化途径，细菌可以保持其毒性水平^[10]。本研究团队曾在实验室环境中诱导出对Yep-phi噬菌体具有抗性的鼠疫弱毒菌突变株614F-S43，其突变的waaA、ail、cmk 3个基因在噬菌体抗性中发挥不同作用，其中waaA缺失9个碱基后鼠疫菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的结构受到破坏，从而可以抑制噬菌体通过LPS吸附宿主菌；cmk 10个碱基缺失后，抗噬菌体作用能力很强。相比于cmk、waaA，ail的抗噬菌体能力最弱、且最后发生突变，同时发现ail不仅能抑制噬菌体对其吸附，而且在共生存状态下对菌株自身恢复生长有很大关系^[11]。

图 3 鼠疫菌90017经动物实验培养24 h后的鼠疫噬菌体裂解噬菌带区域残留菌落（×4） Figure 3 Residual colonies in phage lysis zone of Yersinia pestis 90017 incubated for 24 hours after animal experiment (×4)

图选项

本研究将分离自内蒙古布氏田鼠鼠疫流行末期的鼠疫菌90017经28 ℃培养观察，发现其24 h内生长缓慢，且经鼠疫噬菌体试验菌株裂解不完全。为了观察动物实验后非典型性状的鼠疫菌90017是否恢复到稳定状态，BALB/c小鼠经无菌解剖，其肝脾肺心压印划线，经28 ℃培养分离的鼠疫菌90017，通过鼠疫噬菌体裂解试验观察发现其仍裂解不完全；培养100 h后噬菌带中央部分菌落较完整，部分菌落边缘出现噬菌现象，部分出现空壳状菌落。由此可见，这种自然种群的鼠疫菌对鼠疫噬菌体具有抗性和敏感性共存的现象，可能取决于当时的生长条件及与自然界噬菌体和细菌的抗性作用相关^[12-13]。

田鼠型鼠疫菌90017分离自1970年布氏田鼠动物鼠疫第1次流行高峰期4~5月之后^[14]，此时出现非稳定性状的菌株，可能与鼠疫菌在自然界的非典型形式保存机制有关。这种混合群体的菌株体现了自然环境中微生物群落的生物复杂性^[9]，可能在维持鼠疫流行和传播过程中具有重要作用。鼠疫菌90017无论是在自然界出现噬菌体时分离的，还是以其他形式渡过其不利时期保存下来的，均体现了鼠疫菌的遗传多样性特征促进噬菌体抗性的定向进化^[15]。本研究中不完全耐受鼠疫诊断噬菌体田鼠型鼠疫菌株新生长特点的发现，对鼠疫菌进化研究、致病机制及其在自然环境中长期保存机制等研究具有重要的科研价值，也是后续田鼠型鼠疫菌进化驱动力和动态特征研究中深入挖掘的关键问题。

利益冲突  无