三江源地区作为澜沧江、黄河、长江的发源地，包括玉树藏族自治州（玉树州）、果洛藏族自治州（果洛州）、海南藏族自治州（海南州）和黄南藏族自治州（黄南州）的16个县和格尔木市的唐古拉乡，也是青海省生物多样性较为集中的地区之一^[1]。随着人类活动范围不断扩大，带入了更多生物种群，使该地区敏感的生态系统和鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）种群结构受到影响，也使该地区的鼠疫菌株种群结构呈现多样化^[2]。近20年，三江源地区喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）鼠疫自然疫源地动物流处于活跃状态^[3]，截至2007年在三江源地区证实共存在8科12属15种染疫动物^[4]。自1954年证实该地区为鼠疫自然疫源地后，该地区发生了多起人间鼠疫，玉树州人间鼠疫最为严重^[5]，是鼠疫防控的重点地区。自2009年开始对玉树州鼠疫菌生物特性与地理分布及生物群落密切相关研究不断深入，基因分型及分布相关研究也有报导^[6]，2013年Cui等^[7]通过对全球133株鼠疫菌筛选的2 298个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点进行分析，并绘制了全球鼠疫菌系统发育树，其中包含部分青海省三江源地区菌株，但尚不能全面反映该地区鼠疫菌SNP多样性特征；2022年熊浩明等^[8]对藏系绵羊相关鼠疫菌结合流行病学和相应SNP研究，证实了藏系绵羊鼠疫流行特点，也发现SNP有明显的地域性特征。基因组SNP分析方法同差异区段（different region，DFR）、可变数目串联重复（variable number of tandem repeat，VNTR）、多位点串联重复序列分析（multi-locus VNTR analysis，MLVA）、规律成簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs）、插入序列（insertion sequence，IS）等基因分型技术相比，具有重复性好和容易查筛等特点^[9]。因此，本文筛选了三江源地区81株有代表性的鼠疫菌，通过对代表菌株做全基因组SNP分析，了解该地区鼠疫自然疫源地鼠疫菌种群结构特点，为鼠疫快速溯源及流行病学调查，制订有效的鼠疫防治策略和科学防控提供理论依据。

三江源地区自1954年以来分离的81株鼠疫菌，其中从人、喜马拉雅旱獭、蚤类、田鼠和犬类分离到的菌株分别有41、31、1、1和4株，其他宿主分离到3株。菌株由青海省地方病预防控制所提供。

在青海省地方病预防控制所生物安全三级实验室（已取得CNAS认证和鼠疫菌实验活动资格），鼠疫菌用赫氏琼脂培养基28 ℃培养24 h，采用苯酚-氯仿混合提取法进行DNA提取。

对81株代表性鼠疫菌利用Illumina HiSeq 2000平台（Illumina，SanDiego，CA）进行全基因组测序，构建片段长度平均为500和3 000 bp的双端测序文库。用FastQC过滤原始测序数据，然后将过滤的数据用SPAdes v3.9.1组装。

根据文献[7]中鼠疫菌全基因组SNPs分析方法，以美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中保存的鼠疫菌及假结核耶尔森菌（Y. pseudotuberculosis）IP32953的全基因组序列为参考，比对2 298个SNP位点，用MEGA 6.0软件对81株三江源地区鼠疫菌构建系统发育关系，参照Cui等 ^[7]的系统发育树谱系命名，确定三江源地区鼠疫菌的种群结构。

应用Excel 2010软件对收集到的数据进行整理与分析。

对81株代表性鼠疫菌菌株中的2 298个SNPs位点进行系统发育树分析，81株菌分布在3个分支，1.IN支群包含77株（95.06%），2.ANT支群包含1株，0.PE支群包含3株（其中2株为0.PE4A分支，1株为0.PE4C分支）。仅0.PE4C支群菌株（1株）来源于青海田鼠鼠疫自然疫源地，其他支群及分支菌株均来自喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地。见表 1、图 1。

表 1 青海省三江源地区不同疫源地鼠疫菌单核苷酸多态性分布特征 Table 1 Distribution characteristics of Yersinia pestis single nucleotide polymorphisms in different plague foci in the Sanjiangyuan region, Qinghai Province

表选项

注：MH喜马拉雅旱獭；others其他分离宿主；CD称多县；HN河南县；MD玛多县；MQ玛沁县；NQ囊谦县；QML曲麻莱县；TD同德县；XH兴海县；YS玉树市；ZAD杂多县；ZD治多县；ZK泽库县。 图 1 青海省三江源地区81株代表性鼠疫菌株系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree of 81 representative Yersinia pestis strains in the Sanjiangyuan region, Qinghai Province

图选项

81株鼠疫菌中位于1.IN分支群的77株（95.06%）菌中，4株1.IN1分支菌株分布于果洛州玛多县，73株1.IN2分支菌株几乎分布于整个三江源地区；位于0.PE分支群的3株菌中，0.PE4A分支分布于玉树州的称多县和曲麻莱县，0.PE4C分支分布于玉树州称多县；位于2.ANT分支群的1株菌分布于玉树州囊谦县。见图 1、表 2。

表 2 青海省三江源地区鼠疫菌单核苷酸多态性特征的地区分布 Table 2 Regional distribution of Yersinia pestis single nucleotide polymorphisms in the Sanjiangyuan region, Qinghai Province

表选项

SNP分型方法的原理主要是利用现代生物技术手段，对细菌基因组进行高通量测序，然后对测序数据进行比对和分析，找出SNP位点的变异情况，并据此对不同细菌株之间的遗传相关性进行分析，从而了解细菌的演化历史、种群结构和毒力等特性。全基因组测序技术的快速发展极大地增强了SNP鉴定、系统发育分析能力，推动了鼠疫菌的进化和传播机制研究。2004年Achtman等^[10]首次对鼠疫菌同义SNP（sSNP）进行了全基因组分析。在3个可用的鼠疫菌基因组（CO92、KIM10+和91001）中，鉴定出3 250个同源编码序列（coding sequences，CDS）中的76个SNP。这为鼠疫菌基于sSNP系统发育的首次构建奠定了基础。该系统发育包括3个主要分支（0.、1.和2.），8个主要种群（0.PE1、0.PE2、0.PE3、0.PE4；1.ANT、1.ORI；2.ANT、2.MED）。2010年Morelli等^[11]进行了更广泛的分析，在17株鼠疫菌的全基因测序中发现了933个SNP，这些数据用于创建完全精简的最小生成树，该树显著扩展了先前基于SNP的系统发育研究，确定了更多的种群。Cui等^[7]利用不同方法把国内不同疫源地的鼠疫菌分为5大种系26个谱系，并发现了我国菌株具有明显的地理区域性和生态集聚性特征，证实了其基因组具有高度的多态性，构建了中国鼠疫菌遗传进化图，建立了一种快速高通量的鼠疫菌检测技术，这不仅为鼠疫的地理定位提供了理论支持，也为疫情的监测及诊断提供了技术支持^[12-15]；国内外学者也通过CRISPR和SNP两种基因分型方法，证实了这两种方法能对新发现的青海田鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫菌准确分型，优于DFR分型方法^[16-18]。

三江源地区总面积为30.25万km²，约占青海省总面积的43%^[18]，青海省大部分鼠疫自然疫源地分布于此。疫源地内的染疫动物及昆虫种类多，动物间鼠疫疫情连续不断，加之该地区鼠疫菌毒力强，使三江源鼠疫自然疫源地成为了青海省鼠疫流行最为严重的地区之一^{[3, 6]}。为此，我们选取该地区81株代表性菌株，比对了2 298个SNPs位点并构建了相应系统发育树，结果显示1.IN支群占喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地鼠疫菌菌株的绝大部分（77株，95.06%），其中1.IN1有4株分布于果洛州玛多县，1.IN2有73株几乎分布于整个三江源地区的县域。根据熊浩明等^[8]对青海省高原藏系绵羊鼠疫菌系统发育关系和流行特征的研究，藏系绵羊相关鼠疫菌株也在1.IN2分支上。1株分离于青海田鼠鼠疫自然疫源地（称多县）的鼠疫菌仅存在0.PE4C分支群，与目前最新研究结果^[7]一致，该研究表明，3株分离自玉树州称多县和曲麻莱县的0.PE支群菌株为三江源地区最古老菌株，其余菌株分离自三江流域分布地区，该地区位于被称为“丝绸”和“茶马”之路的古代贸易路线附近；2.ANT支群分布在玉树州囊谦县，2004年玉树州囊谦县发生鼠疫暴发，调查原因为旱獭疫蚤叮咬经皮肤感染鼠疫菌所致^[19]，但与三江源地区主流支群1.IN不同，该菌株位于2.ANT2分支。

SNP可能会发生在非编码区域，该区域单核苷酸多态性丰富，个体的表型特点不轻易改变，也能够准确地反映出鼠疫菌株群组间遗传关系，有利于鼠疫菌株的微进化研究^[13]。本研究此次筛选的菌株大多分离自喜马拉雅旱獭和人，选择的个体在该地区生存相对稳定，通过对该地区鼠疫菌的全基因组SNP研究发现，1.IN支群为该地区鼠疫自然疫源地优势种群，代表性菌株未出现太多基因突变，并且不同类型鼠疫自然疫源地的菌株有着不同特征。此次研究，从不同角度探究了鼠疫菌分型情况，丰富了三江源地区鼠疫菌全基因组多态性数据库，有助于该地区鼠疫防控和溯源。

利益冲突  无