蜱是一种常见吸血节肢动物，广泛分布于我国，能够携带细菌、螺旋体、立克次体和病毒等多种病原体^[1]，是多种人兽共患传染病的重要传播媒介^[2]，如森林脑炎、莱姆病、克里米亚-刚果出血热和发热伴血小板减少综合征等 ^[3-5]。人粒细胞无形体病（human granulocytic anaplasmosis，HGA）是一类新发蜱传人兽共患疾病，其病原体为嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum，AP）。从1994年美国发现首例HGA患者以来，我国湖北、河南、山东、黑龙江省等地也先后报道过多例HGA感染或疑似病例^[6]。烟台市自2010年莱州市发现1例HGA病例后，其他地区又相继报道了多个病例，发病患者均存在蜱叮咬史或接触史^[7-9]。硬蜱是导致AP在人、家畜和野生动物等宿主间传播的主要媒介，在我国广泛分布的多种硬蜱均可携带AP，如全沟硬蜱（Ixodes persulcatus）、微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）、森林革蜱（Dermacentor silvarum）和长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）等^[10]。硬蜱具有广阔的宿主范围，包括牛、羊、犬等家畜和鼠、兔、刺猬等野生动物，动物宿主的不间断感染是导致该病原体能够不断传播和循环的条件^[11-12]。烟台市地处胶东半岛丘陵地带，气候温和，植被茂盛且生境类型多样，为长角血蜱和宿主动物的繁衍及蜱传病原体的传播提供了适宜条件。

为进一步了解烟台市长角血蜱携带AP的情况，本研究采用巢式PCR法对烟台市采集的部分寄生蜱和游离蜱进行AP检测，分析长角血蜱中AP感染率和分布特征，从而为烟台市HGA防控及风险评估提供参考依据。

2021年4－10月选取烟台市牟平区、蓬莱区、海阳市、栖霞市、招远市、莱州市、开发区等7个市（区）按照《全国病媒生物监测实施方案》^[13]开展蜱监测工作。

寄生蜱：体表检蜱法收集犬、羊携带寄生蜱，重点检查动物的耳朵、眼周、口鼻、脖子、腋窝、肛周、会阴、尾根等部位。对采集到的蜱根据采集地点、来源分管分装并编号标记。

游离蜱：在农村外环境和城镇景区、绿化带等地采用布旗法采集。每一样地的蜱放入同一管内或做一致编号，带回实验室进行相应的分类鉴定、计数和检测。

将所采集的蜱送至军事科学院军事医学研究院进行形态学鉴定和分子生物学鉴定，在体视显微镜下依据蜱假头基、须肢、盾板、气门板和生殖孔等部位的形态特征对蜱种进行鉴定分类^[14]。根据随机和代表性原则，选取913只蜱按照不同宿主来源和不同发育周期进行分组，吸血蜱1只为一组，未吸血蜱3~5只为一组进行分装，最终共获得413份样本，其中，寄生蜱样本386份，游离蜱样本27份。将每组样本放在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿内清洗2次，晾干。后置于含有300 μl PBS的研磨管内进行研磨。研磨后按照核酸提取试剂盒（QIAamp MinElute Virus Spin Kit，QIAGEN公司）说明书提取DNA，并用巢式PCR方法对蜱样本进行AP检测，根据参考文献[15-16]合成无形体16S rRNA基因引物，引物和序列信息见表 1。第1轮反应体系：2 μl 10×缓冲液、2.5 mmol/L dNTPs 1 μl、10 μmol/L正、反向游引物各1 μl、2 U Taq DNA聚合酶，2 μl DNA模板，无菌去离子水补充体积至20 μl。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，循环40次；72 ℃延伸5 min。第2轮反应继续使用上述扩增条件，引物使用Eh-gsl、Eh-gs2，第1轮PCR产物2 μl为模板。第2轮PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。反应设阴性空白对照及阳性对照，阳性对照模板为AP的阳性质粒。蜱的感染现状采用最小感染率（minimum infection rate，MIR）表示，MIR=阳性样本组数/检测的蜱数量。

表 1 巢式PCR法检测嗜吞噬细胞无形体引物序列信息 Table 1 Nested PCR primer sequences for Anaplasma phagocytophilum detection

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运用Excel 2019软件进行数据汇总，运用SPSS 22.0软件对不同来源、不同发育阶段和不同市（区）的蜱样本阳性检出率进行χ²检验分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2021年在烟台市7个区（市）内共采集1 698只长角血蜱，其中，采集数量最多的是招远市，其次为莱州市和蓬莱区。招远市、莱州市和蓬莱区采集最多的均是寄生蜱，见图 1；羊体表捕获蜱最多，共847只，其次为游离蜱。寄生蜱中若蜱79只，成蜱1 018只，共1 097只；游离蜱中幼蜱21只、若蜱25只和成蜱555只，共601只。见表 2。

图 1 2021年山东省烟台市不同市（区）采获蜱情况 Figure 1 Data on tick catches in different districts/cities of Yantai, Shandong Province, 2021

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表 2 2021年山东省烟台市不同来源、不同发育阶段蜱分布情况 Table 2 The distributions of ticks by source and developmental stage in Yantai, Shandong Province, 2021

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413份蜱样本中，有68份犬源蜱样本，318份羊源蜱样本和27份游离蜱样本，共检测出13份AP核酸阳性样本，阳性检出率为3.15%，总最小感染率为1.42%。阳性样本中，有2份犬源蜱样本、9份羊源蜱样本，最小感染率分别为2.27%和1.30%；有2份游离蜱样本，最小感染率为1.53%。不同来源蜱样本阳性率的差异无统计学意义（χ²=1.722，P=0.423）。见表 3。

表 3 2021年山东省烟台市不同来源蜱携带嗜吞噬细胞无形体情况 Table 3 Anaplasma phagocytophilum infection status in ticks from different sources in Yantai, Shandong Province, 2021

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在所有阳性样本中，成蜱共检出12份阳性样本，最小感染率1.42%；其中寄生蜱阳性样本均为成蜱，共11份，最小感染率1.41%，游离蜱1份，最小感染率1.54%；仅在幼蜱中检出1份游离蜱阳性样本，最小感染率为1.52%；若蜱样本未检测。不同发育阶段的蜱样本携带AP的差异无统计学意义（χ²=0.759，P=0.384）。见表 4。

表 4 2021年山东省烟台市不同发育阶段蜱携带嗜吞噬细胞无形体情况 Table 4 Anaplasma phagocytophilum infection status in ticks at different developmental stages in Yantai, Shandong Province, 2021

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不同地区的寄生蜱和游离蜱样本AP感染情况相同。寄生蜱样本中，开发区、莱州市、招远市均检测出AP阳性样本，最小感染率分别为14.29%、3.47%和0.48%；游离蜱样本中，蓬莱区和招远市也检测出阳性样本，最小感染率分别为1.52%和1.82%。不同地区间蜱样本阳性率差异有统计学意义（χ²=11.468，P=0.038）。见表 5。

表 5 2021年山东省烟台市不同地区蜱携带嗜吞噬细胞无形体情况 Table 5 Anaplasma phagocytophilum infection status in ticks in different regions of Yantai, Shandong Province, 2021

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AP是一种细胞内寄生的革兰阴性菌，蜱通过叮咬携带病原体的宿主动物而感染，后又通过叮咬行为而感染其他宿主动物或人^[17]。AP能够使人罹患人粒细胞无形体病，严重者可导致多器官功能衰竭，甚至死亡^[18]。人粒细胞无形体病自2006年在我国发现以来，感染数量呈现逐年增加趋势，给居民健康带来巨大威胁^[19]。

既往研究发现，河北省唐山、保定及秦皇岛市等地采集的长角血蜱，AP感染阳性率较高^[20-21]。湖北省随州市的一项调查结果也显示，该地区的长角血蜱携带AP，最小感染率为4.22%^[22]，提示长角血蜱可能是嗜吞噬细胞无形体的传播媒介之一。本研究发现，烟台市长角血蜱分布广泛，且AP阳性检出率为3.15%。因此，烟台市长角血蜱可能存在传播AP的风险，应重视烟台地区无形体感染情况，持续开展蜱携带AP监测工作。人粒细胞无形体病起病急，症状不典型，与莱姆病、出血热、发热伴血小板减少综合征等其他蜱传疾病症状相似；早期难以鉴别，易造成漏诊误诊，使患者错失最佳治疗时机^[23]。因此，在烟台市发热伴血小板减少综合征流行季节，若出现症状相似，但新型布尼亚病毒核酸检测阴性的患者，应考虑AP感染的可能性，为临床诊断提供参考。

AP可感染多种禽类和哺乳动物，包括家养动物和野生动物^[24-25]。本次调查结果显示，烟台市多个市（区）采集的寄生蜱体内检测出AP，表明烟台地区AP感染范围较广。结果显示，莱州市AP检出阳性样本最多，且均为寄生蜱样本，表明莱州市家畜或蜱可能存在较高的AP感染率。于强等^[26]2012年在莱州湾湿地的调查结果也显示，莱州湾农村地区长角血蜱样本AP阳性率达43.5%，提示莱州地区人粒细胞无形体病传播风险较高。牟平区、海阳市、栖霞市、开发区等地区捕获蜱数量少于其他地区，这可能与蜱监测地点的选择、监测时间和寄生宿主的选择等因素有关，进而导致检测样本数也较少，可能影响阳性样本检出率的可靠性。本研究中，游离蜱也检测出阳性样本，这提示自然生境中的蜱已存在AP感染，并可能存在经期传递。AP可利用蜱需刺叮不同宿主吸食血液来维持生长发育这一生理特性在不同动物宿主和媒介蜱群落中不断扩散，致使AP感染范围不断扩大，也不断扩大了人粒细胞无形体病的风险区域。

本研究仍存在一些不足，仅通过16S rRNA基因引物对AP进行检测，未采用其他基因引物进行检测来相互验证。16S rRNA基因引物扩增片段较短，对AP的分辨率较低，且在实验过程中易污染，从而影响病原体阳性结果和具体种属辨别结果的准确性^[27]。

综上所述，调查发现烟台市多个地区长角血蜱携带AP，增加了人群罹患人粒细胞无形体病的风险。因此，应在烟台市持续开展媒介蜱的监测工作，加强对蜱传病原体的检测，从而进一步了解烟台市AP分布和流行状况，为防控人粒细胞无形体病、降低蜱危害提供科学依据。

利益冲突  无