家蝇（Musca domestica）是一种重要的公共卫生和畜牧业病媒昆虫，可机械性传播200多种人畜病原体^[1]，侵扰畜禽导致产品产量和质量的降低^[2]。家蝇的防治长期以来主要依赖有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯等化学杀虫剂，导致抗药性问题日益突出^[3-5]。研究表明，家蝇的抗药性与羧酸酯酶MdαE7和乙酰胆碱酯酶（AChE）某些位点的氨基酸突变有着密切关系。已知羧酸酯酶MdαE7的G137D和W251L/S位点突变与家蝇对有机磷或拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关^{[3, 6]}，AChE的V260L、G342A/V、F407Y和G445A位点突变或突变组合可以导致家蝇产生对有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性^[7-8]。

及时了解抗药性相关基因突变的频率和动态，能为家蝇的有效防治提供科学依据。Qiu等^[9]已建立了家蝇MdαE7 251L/S/W和AChE342G/V/A核酸检测方法，但至今未见有对其他抗性突变位点检测方法的报道。本研究中，我们建立了基于聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术的基因分型方法，可用于家蝇羧酸酯酶MdαE7 G137D和AChE V260L、F407Y突变的检测。

2022年6－7月，在四川省内江市资中、威远、隆昌、市中和东兴5个县（市、区），按照东、南、西、北、中不同方位选择家禽养殖场作为采样点，采用诱蝇笼或捕虫网从现场采集家蝇成虫，存放于无水乙醇溶液中，4 ℃条件下进行短期保存，于-20 ℃条件下进行长期保存。

参照Rinkevich等^[10]的方法提取家蝇基因组DNA，步骤如下：（1）取单只家蝇，用无菌水冲洗数次，洗去表面残留的乙醇溶液，去掉腹部后，放入1.5 ml离心管中，加入50 μl裂解液充分研磨后再加裂解液400 μl（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，1% SDS）以及5 μl蛋白酶K（Protease K）（20 mg/ml，天根生化科技有限公司），混匀后在56 ℃水浴锅中水浴1 h。（2）再加入50 μl 8 mol/L醋酸钾（KAc）溶液，混匀后冰上放置10 min，之后14 000×g离心30 min。（3）取出样品，吸取400 μl上清于新离心管中，加入800 μl冰无水乙醇，颠倒混匀，室温静置20 min。（4）14 000×g离心10 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇溶液清洗。（5）8 000×g离心10 min，弃尽上清，沉淀干燥后，加入50 μl无核酸酶水溶解。制备的DNA样品可直接用于后续的PCR，也可以将样品保存在4 ℃下备用，或在-20 ℃条件下长期保存。

采用基因特异性引物，设置3个不同的PCR反应以分别扩增包含抗药性相关突变位点的基因片段，对应的PCR产物分别命名为MdαE7-137、AChE-260和AChE-407，见表 1。PCR反应体系（总体积20 μl）包含10 μl 2× ES Taq MasterMix（康为世纪生物科技股份有限公司），正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μl，ddH₂O 8.4 μl，模板DNA 0.6 μl。扩增MdαE7-137和AChE-260基因片段时，PCR程序设置为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增AChE-407基因片段采用的PCR程序为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应结束后，取5 μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上样，140 V电泳30 min后在凝胶成像仪观测。

表 1 用于家蝇羧酸酯酶MdαE7 G137D和AChE V260L与F407Y基因分型的引物和限制性内切酶 Table 1 Primers and restriction endonucleases used for genotyping carboxylesterase MdαE7 G137D, AChE V260L and AChE F407Y in Musca domestica

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为对家蝇抗药性相关的位点进行基因分型，将1.3中获得PCR产物进一步做酶切反应，所用的限制性内切酶及其酶切识别位点见表 1。MdαE7-137酶切反应体系（20 μl）：Bst XI（10 U/μl）1 μl，10× NEB Buffer r3.1 2 μl，PCR产物2 μl，ddH₂O15 μl。AChE-260的酶切体系（20 μl）：Sal Ⅰ-HF^®（20 U/μl）0.5 μl，10× NEB rCutSmart Buffer 2 μl，PCR产物2 μl，ddH₂O 15.5 μl。AChE-407酶切反应体系：Eco RV-HF^®（20 U/μl）0.5 μl，10× NEB rCutSmart Buffer 2 μl，PCR产物4 μl，ddH₂O 13.5 μl。以上酶切反应均在37 ℃下进行2 h，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶上上样，140 V条件下电泳30 min后，紫外成像检测。根据酶切产物的电泳条带，判定家蝇样品抗药性相关位点的个体基因型。

扩增出包含137位点的MdαE7基因片段，大小符合预期（213 bp），见图 1A。经Bst XI酶切后，不同基因型个体的PCR产物酶切图谱不同。敏感纯合子（137GG）的产物经酶切后可以产生187和26 bp的产物，其中26 bp片段在琼脂糖凝胶电泳中不易识别，如电泳图出现187 bp 1条条带，该个体MdαE7的基因型为敏感纯合。相反，抗性纯合子（137DD）的PCR产物中不包含Bst Ⅺ的酶切位点，因此不能被该酶酶切，其电泳结果仅213 bp 1条条带。杂合基因型个体的PCR产物同时包含可被Bst Ⅺ酶切和不能被酶切的基因片段，经酶消化后，产生3种不同大小的产物，即26、187和213 bp条带，见图 1B、表 2。

注：DD为MdαE7 137D抗性型纯合子；GG为MdαE7 137G敏感型纯合子；G/D为MdαE7 137杂合子；M为DNA marker。 图 1 基于聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性的家蝇MdαE7 137位点基因分型 Figure 1 Genotyping of Musca domestica on site 137 in MdαE7 using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism

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表 2 家蝇羧酸酯酶MdαE7 137、AChE 260和AChE407不同基因型对应的电泳条带 Table 2 Electrophoresis profiles for different genotypes of carboxylesterase MdαE7 at position 137, AChE at position 260 and AChE at position 407 of Musca domestica

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采用AChE-260的特异性引物，经PCR反应扩增出单一、符合预期大小（170 bp）的条带，见图 2A。由于敏感等位基因AChE 260V的PCR产物不存在Sal Ⅰ-HF^®酶切位点，与Sal Ⅰ-HF^®温浴后保持不变，电泳显示大小为170 bp的单一条带。抗性等位基因AChE 260L的PCR产物经Sal I-HF^®作用后，可以产生144和26 bp的产物。杂合个体同时包含AChE 260V和AChE 260L，其PCR产物经Sal I-HF^®酶切后，理论上产生170、144和26 bp 3个不同长度的产物，见图 2B和表 2。

注：VV为AChE 260敏感型纯合子；L/L为AChE 260抗性型纯合子；V/L为AChE 260杂合子；M为DNA marker。 图 2 基于聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性的家蝇AChE 260位点基因分型 Figure 2 Genotyping of Musca domestica on site 260 in AChE using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism

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采用基因特异性引物，扩增出了包含407位点的AchE基因片段，其长度为133 bp，见图 3A。PCR产物经Eco RV-HF^®消化后，敏感纯合子（AchE 407-FF）的产物因不存在酶切位点，其大小保持133 bp不变，抗性纯合子（AchE 407-YY）的产物经酶切后可以产生102和31 bp的产物。杂合个体包含抗性和敏感等位基因，其产物经Eco RV-HF^®作用后，产生133、102和31 bp 3种产物，在电泳图中显示出3条条带，见图 3B、表 2。

注：FF为AChE 407敏感型纯合子；YY为AChE 407抗性型纯合子；F/Y为AChE 407杂合子；M为DNA marker。 图 3 基于聚合酶链式反应-限制性片段长度多态的家蝇AChE 407位点基因型检测 Figure 3 Genotyping of Musca domestica AChE at position 407 based on polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism

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大规模、长时间地使用杀虫剂导致的抗药性问题^{[3-4, 11]}，已成为家蝇有效控制的一大障碍。系统开展家蝇抗药性监测，可以为杀虫剂的合理使用以及延缓抗药性的产生提供科学依据。传统的家蝇抗药性生物测定法人力消耗大、时间周期长，不便于经常性开展抗性监测工作，亟需更加快速和简便的检测方法。等位基因特异性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）技术也被用于病媒生物突变的个体基因型检测，但特异性不高^[12]，本研究采用PCR-RFLP法建立家蝇抗性基因突变位点检测技术，具有简单、高效、精准的优点。

家蝇羧酸酯酶MdαE7表达量的增加和某些位点的氨基酸替换会导致昆虫产生抗药性^{[6, 13]}，137和251位点突变与有机磷或拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关，其中G137D突变是二嗪磷抗性的诊断特征^[14]。137和251位点突变在国内外家蝇自然种群中普遍存在^{[3, 9, 15]}。MdαE7 251位点突变检测方法已有报道^[9]，本研究建立的MdαE7 G137D位点快速检测方法，有利于更全面地检测家蝇羧酸酯酶MdαE7抗性突变的种类和频率。

AChE V260L、G342A/V、F407Y等突变可以改变家蝇对有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感性^{[3, 8]}，这3个位点的突变在我国已被多次检测到^{[3, 16]}。Qiu等^[9]报道了G342A/V突变的检测方法，本研究建立了另外2个抗性突变（V260L、F407Y）的检测方法，拓展了家蝇AChE抗性突变的检测范畴。

本研究建立的羧酸酯酶MdαE7 G137D和AChE V260L、F407Y突变核酸检测方法，能够准确、快速地鉴定与杀虫剂抗性相关突变的存在和频率，研究结果可用于监测或预测家蝇由羧酸酯酶MdαE7 137位点和AChE 260、407位点变异介导的对有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性，为家蝇的有效控制提供决策依据。在MdαE7 G137D、AChE V260L和AChE F407Y位点酶切产物的小片段的大小均在30 bp左右，在常规琼脂糖凝胶电泳中不易看到，但可以根据另一大片段的存在与否判断样品的基因型。本研究建立的检测方法仅适用于已知的特定基因突变的检测，具有一定的局限性。如果目标基因存在新的突变类型，可采用基因测序的方法去发现。

利益冲突  无