柯克斯体属（Coxiella）是一种可导致人类机会性感染的蜱传细菌性病原体，包括贝氏柯克斯体（C. burnetii）、马氏柯克斯体（Candidatus Coxiella mudrowiae）、柯克斯体共生菌（Coxiella-like endosymbionts）等^[1]。贝氏柯克斯体具有致病性高、抵抗力强、易存储、易播散等特征，可导致人Q热发生或暴发流行^[2]。2019年我国珠海市暴发Q热疫情，其传染源可能为当地感染贝氏柯克斯体的山羊^[3]。柯克斯体共生菌与贝氏柯克斯体亲缘关系较近，在与宿主蜱长期共生关系中，可向贝氏柯克斯体进化并感染脊椎动物^[4]。Chisu等^[5]研究表明柯克斯体共生菌可能与人类菌血症有关。马氏柯克斯体同贝氏柯克斯体进化关系较远，现流行于中国的嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）等媒介蜱种中，参与能量代谢、胞间囊泡形成、受体细胞识别等生理过程。尽管对马氏柯克斯体的自然感染状况及其流行病学意义尚不得而知，但其在探究柯克斯氏体家族进化以及贝氏柯克斯体起源中具有重要的科学价值^[6]。蜱传疾病是全球范围内新兴的公共卫生问题之一，对蜱携带的微生物进行调查是制定有效的蜱及蜱传疾病控制策略的先决条件。

高通量测序技术通过对生物样本中所有微生物DNA或RNA扩增，并与数据库中序列信息对比分析，可帮助研究人员识别已知病原体和发现完全未知的病原体^[7]。与传统的病原体分离培养和基因及血清学诊断技术相比，高通量测序技术在筛查病原微生物方面，更具有全面性、广泛性和预见性等优点^[8]。

贵州省具有独特的喀斯特地貌，是蜱的适应栖息地之一^[9]，曾报道过Q热病例^[10]；另外，柯克斯体属细菌潜在的健康风险是目前调查的主要关注点^[6]。本研究从罗甸县收集山羊体表寄生蜱，运用分子生物学方法调查其携带的柯克斯体属细菌的基本情况，为贵州省的蜱媒疾病的预防和控制提供一定的本底数据。

2021年9月和2022年1月，从贵州省罗甸县大关村散养山羊体表采集寄生蜱66只。

将前期采集到的蜱用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，单只放于1.5 ml的离心管中，先用75%乙醇溶液清洗3次，再用无菌PBS清洗。加入210 µl无菌PBS缓冲液，用电动组织研磨器研磨蜱组织，制成悬液。依据西安天隆科技有限公司的qEx-DNA/RNA核酸提取试剂盒说明书对蜱组织悬液进行DNA提取。

参照邓国藩等^[11]对蜱种进行初步鉴定，同一蜱种随机抽取2~3只，采用蜱种鉴定特异性引物进行分子生物学鉴定^[12]。

根据公司送样要求，每只蜱取5 µl DNA进行混样。然后将混样之后的标本送生工生物工程（上海）股份有限公司。采用Nanopore三代测序技术对标本进行高通量测序，引物序列为8F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'），然后使用Kraken2数据库对获得的每一条序列进行物种注释，并统计物种数目构建操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）表，然后根据OTU表挑选出对应的序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）上进行基于局部比对算法的搜索工具（BLAST）比对分析获得的柯克斯体属的序列。

参考柯克斯体属的16S rRNA基因选择引物^[13]，扩增目的片段为680~710 bp，PCR反应体系为：Taq DNA polymerase 0.125 µl，10×PCR buffer 2.5 µl，dNTP（10 mmol/L）2 µl，上下游引物各0.5 µl（10 µmol/L），DNA模板1 µl，双蒸水补足体积，终体积为25 µl。扩增程序为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增结束取5 µl的PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。本实验使用的阴性对照为双蒸水，阳性对照为柯克斯体属PCR阳性DNA。出现目的条带为阳性，选取部分阳性扩增产物送至深圳华大基因股份有限公司测序。使用Vector NTI 11.5软件中的Align X分析从高通量测序获得的属于柯克斯体属的序列与PCR阳性样本DNA序列之间的差异。

从NCBI的GenBank数据库中选择与柯克斯体属16S rRNA基因同源性最高的序列和其他不同种的对应序列，通过MEGA 7.0软件中Bootstrap Test of Phylogeny项目下的neighbor-joining法构建系统发育树，分析本研究获得的柯克斯体属序列的遗传进化特点。

通过形态学和分子生物学方法确认本次共采集到63只长角血蜱（Ha. longicornis）和3只微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus），长角血蜱的基因登录号为OQ568709，微小扇头蜱的基因登录号为OQ568714。

本次扩增子测序获得的原始数据已上传到序列读取归档（sequence read archive，SRA）数据库，对应的序列号为SRR28055682。经生物信息学分析共获得17条柯克斯体属细菌16S rRNA序列。高通量数据库中获得的17条16S rRNA序列经BLAST后，获得了90%以上相近的序列。见表 1。

表 1 贵州省罗甸县蜱携带柯克斯体与其亲缘关系最近细菌的基因一致性分析 Table 1 Genetic identity between the Coxiella carried by ticks in Luodian County, Guizhou Province and their closely related bacteria

表选项

在66份蜱样本中共有19份出现目的条带，总阳性率为28.78%，选取6份条带扩增较好样本送测序，仅有3份双向测序拼接成功并确认是柯克斯体属细菌。通过Vector NTI 11.5软件中的Align X进行多序列分析发现高通量测序获得的17条序列的一致性83.00%~96.00%，其中OR473157与OR473170~OR473173的一致性 > 90.00%，OR473158~OR473169间的一致性 > 90.00%。3个PCR扩增序列（LD14-4、LD14-14、LD28-1，683 bp）一致性均为100%，与本研究高通量测序获得序列一致性最高的是OR473159（97.00%），最低的是OR473157（89.00%）。见图 1。

注：LD14-4、LD14-14、LD28-1为PCR阳性样本的序列（683 bp）；OR473157~OR473173为高通量测序获得的柯克斯体属细菌的序列（1 394~1 490 bp）。 图 1 贵州省罗甸县蜱携带柯克斯体属16S rRNA序列之间的一致性分析 Figure 1 Identity analysis of 16S rRNA sequences of Coxiella carried by ticks in Luodian County, Guizhou Province

图选项

在NCBI上选取与柯克斯体共生菌16S rRNA基因同源性最高的序列和同属种类序列，并以Rickettsiella共生菌为外群构建进化树。本研究通过高通量测序获得的柯克斯体属16S rRNA序列（基因登录号：OR473157）与分离自以色列的柯克斯体共生菌（基因登录号：JQ480818）属于同一分支，PCR测序获得的柯克斯体共生菌（LD14-4）和高通量测序获得的柯克斯体共生菌（基因登录号：OR473159）与分离自泰国的柯克斯体共生菌（基因登录号：KC170759）位于同一分支，遗传进化关系较近，而与分离自南非（基因登录号：CP094378）和中国台湾（基因登录号：MZ836864）的柯克斯体共生菌不在同一分支，遗传进化关系较远。见图 2。

注：●为本研究获得的序列。 图 2 贵州省罗甸县蜱携带柯克斯体属细菌16S rRNA的系统发育树分析 Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of Coxiella carried by ticks in Luodian County, Guizhou Province

图选项

Q热的病原体（贝氏柯克斯体）被美国疾病预防控制中心归类为B类生物恐怖剂^[13]。全球暂未研究出高效安全的Q热疫苗^[14]。2020年李军等^[15]在广西壮族自治区（广西）南宁市进行了Q热的血清流行病学调查，发现牛、羊血清的Q热抗体阳性率分别为14.50%和26.50%。

本研究通过高通量测序技术对与广西接壤的罗甸县山羊体表寄生蜱携带的细菌进行了调查，并对发现的柯克斯体属的序列进行了综合分析。结果表明本研究获得的细菌为柯克斯体共生菌，而柯克斯体共生菌和Q热的病原体之间有着密切的联系，Duron等^[16]通过全基因组测序数据和多位点系统发育分析发现所有已知的贝氏柯克斯体都起源于柯克斯体共生菌。Thanchomnang等^[17]提出携带柯克斯体共生菌的蜱更可能携带埃立克体或无形体。蜱及其携带的柯克斯体属细菌存在共分化^[18]，李兰花^[19]发现降低柯克斯体共生菌含量与镰形扇头蜱（Rh. haemaphysaloides）和长角血蜱孤雌株的繁殖力下降有关。

本研究获得的蜱体内柯克斯体共生菌16S rRNA基因的核苷酸一致性在83%~96 %，表明其具有遗传多样性。PCR测序结果与高通量测序结果存在差异，其原因可能是传统PCR扩增的检测鉴定能力局限，而高通量测序识别鉴定的病原谱更广泛。

本研究存在的局限性：第一，由于受采样数量、地区和季节等的局限，本研究所获得的蜱种仅有长角血蜱和微小扇头蜱且数量较少，且有一部分饱血蜱，在饱血蜱中检测出的细菌有可能来自宿主动物。第二，本实验获得的柯克斯体共生菌的基因序列多态性较高，但本研究是把蜱DNA进行混样之后再进行扩增子测序，无法追溯其与采集时间、吸血状态及蜱种之间的关联性。第三，本实验以电泳出现目的条带来计算柯克斯体共生菌的阳性率，因PCR反应受多种条件的限制，例如DNA样品的新鲜程度，且Sanger测序对样品的浓度要求较高等。尽管研究中选取了6份扩增条带较好的样本送测序，但仅有3份测序成功，有可能存在假阴性。

综上所述，本研究对贵州省罗甸县山羊体表寄生蜱携带的柯克斯体共生菌的基因序列进行了分析，发现存在基因多态性，其致病性及公共卫生意义还待进一步研究。

利益冲突  无