蜱是一种专性吸血节肢动物，是世界上仅次于蚊虫的第二大病原体传播媒介^[1-3]。蜱媒病毒（tick-borne viruses，TBV）指在蜱和脊椎动物宿主之间进行传播的病毒，其能够在节肢动物和脊椎动物细胞中感染并复制，是蜱传播的一种重要致病因子^[4-6]。能够引起人类疾病的TBV，主要分布在黄病毒科（Flaviviridae）、内罗病毒科（Nairoviridae）、白蛉病毒科（Phenuiviridae）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）、正粘病毒科（Orthomyxoviridae）等5个病毒科^[7-8]。我国东北地区是蜱媒病毒重要自然疫源地，已发现了多种TBV的流行，包括蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）、大别班达病毒[Dabie bandavirus，DBV，曾称发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）]、阿龙山病毒（Alongshan virus，ALSV）、松岭病毒（Songling virus，SGLV）、Antu病毒（Antu virus，ATV）等^{[4, 9-11]}。

佳木斯市桦南县孟家岗镇位于我国黑龙江省的东北部，地处完达山西麓余脉的浅山地带，属寒温带季风气候，森林覆盖率高，适合野生动物栖息，为蜱的生长繁殖创造了良好的条件^{[4, 12]}。本团队前期曾在黑龙江省佳木斯市桦南县蜱标本中检测出TBEV^[4]，本研究继续在该地区开展蜱媒病原体调查，研究结果将为当地开展蜱媒疾病的监测和防控提供科学数据。

2023年5月8日在黑龙江省佳木斯市桦南县孟家岗镇（东经130°50′，北纬46°23′）开展蜱标本采集。采集方式为人工布旗法和动物体表摘拾法，在林区和草地进行游离蜱采集，在放养的牛体表进行饱血蜱采集^{[4, 12]}。将采集的蜱标本装入容器内，密封容器口，做好编号和登记，运送至实验室，存放于-80 ℃冰箱^[4]。

采用形态学方法，通过体视显微镜观察蜱的假头基、盾板、基突、须肢、侧沟、气门、生殖沟、肛沟、尾突等特征进行分类鉴定，操作全程在冰排上进行^[4]。

将全部蜱标本分类后，依次记录其采集时间、地点、种类、性别、吸血状态等信息^[4]。使用高通量组织研磨仪Tissuelyser II（德国Qiagen公司）对分装后的全部蜱标本进行充分研磨，成蜱为单只研磨，若蜱按10~15只分组研磨。4 ℃，13 000×g，离心30 min，取200 μl标本研磨上部清液，使用CqEx-RNA/DNA核酸提取试剂盒（西安天隆科技有限公司）进行蜱标本总核酸的提取^[12]。

使用AgPath-ID^TM One-Step RT-PCR Reagents荧光定量试剂盒（美国ABI公司）采取反转录实时荧光定量PCR（reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）方法检测蜱标本RNA中的SGLV，引物和探针序列见表 1。反应体系为25 μl，包括：2×RT-PCR buffer缓冲液12.5 μl，Nuclease-free water 9 μl，正、反向引物（10 μmol/L，北京天一辉远生物技术有限公司合成）各1 μl，TaqMan探针（10 μmol/L）0.5 μl，RT-PCR Enzyme Mix（25×）1 μl，病毒RNA模板1 μl。在QuantStudio 5荧光PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）中进行。反应条件：45 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45个循环。

表 1 反转录实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）检测松岭病毒的引物和探针序列 Table 1 Primer and probe sequences for Songling virus detection by reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR

表选项

参照文献[9]中的SGLV L节段（L segment）、M节段（M segment）、S节段（S segment）中保守区序列合成反转录巢式PCR（reverse transcription real-time nested PCR，RT-nested PCR）引物，使用SuperScript^TM IV One-Step RT-PCR System一步法RT-PCR试剂盒（美国ABI公司）对阳性标本RNA进行RT-nested PCR扩增，反应体积为25 μl，包括：2×Platinum^TM SuperScript^TM RT-PCR Master Mix 12.5 μl，Nuclease-free water 7 μl，正、反向引物（10 μmol/L，北京天一辉远生物技术有限公司合成）各1.25 μl，SuperScript^TM IV RT Mix 0.5 μl，病毒RNA模板2.5 μl。第1轮反应条件：45 ℃ 20 min，98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 5 min。第2轮反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 5 min。

阳性产物送北京天一辉远生物技术有限公司进行测序。使用SeqMan软件（DNAStar）对阳性标本核苷酸序列进行核苷酸拼接^[4]。从美国国立生物技术信息中心（NCBI）中选取4株SGLV以及ATV、布拉纳病毒（Burana virus，BUR）、黄陂蜱病毒1（Huangpi tick virus 1，HpTV-1）、塔姆德病毒（Tamdy virus，TAMV）、塔城蜱病毒（Tacheng tick virus 1，TcTV-1）、温州蜱病毒（Wenzhou tick virus，WzTV）的基因组序列，结合本研究获得的基因组序列信息，构建大节段（L节段）、中节段（M节段）、小节段（S节段）数据集，使用BioEdit 7.0软件分别对获取的序列进行比对；MEGA-Ⅹ软件进行邻接法（neighbour-joining method，NJ法）系统进化树构建及同源性分析，boostrap值设为1 000^[4]。

共采获421只蜱标本，标本采集信息见表 2，经鉴定包括森林革蜱（Dermacentor silvarum）184只，占比43.71%；全沟硬蜱（Ixodes persulcatus）115只，占比27.32%；日本血蜱（Haemaphysalis japonica）32只，占比7.60%；嗜群血蜱（H. concinna）43只，占比10.21%；长角血蜱（H. Iongicornis）7只，占比1.66%；未鉴定若蜱40只，占比9.50%。

表 2 2023年5月黑龙江省佳木斯市桦南县孟家岗镇采集蜱标本信息 Table 2 Information on tick specimens collected in Mengjiagang Town, Huanan County, Jiamusi, Heilongjiang Province, May 2023

表选项

使用RT-qPCR法对SGLV进行病毒筛查，结果检测到1份（编号：2023JMS365）SGLV阳性，携带蜱种为饱血状态的雌性嗜群血蜱，其循环阈值（Ct）为26。

用Sanger测序法分别获得2023JMS365标本的L、M、S节段基因序列，大小分别为785、853和684 bp，结合其他同种和同属病毒基因序列构建系统进化树并进行同源性分析（图 1）。结果显示：2023JMS365标本的L、M和S节段与SGLV HLJ1202株的核苷酸序列一致性分别为96.78%、92.11%和97.59%，氨基酸序列一致性分别为99.22%、97.50%和93.28%。见表 3。

注：●表示本研究获得的松岭病毒序列；分支点上的校验值为经1 000次重构后获得，分支点校验值隐藏表示该值< 70%。 图 1 2023JMS365号标本松岭病毒L、M、S节段序列系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis of the L, M, and S segments of Songling virus of specimen 2023JMS365

图选项

表 3 2023JMS365标本基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分析 Table 3 Homology analysis of nucleotide and amino acid of genome of 2023JMS365

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本研究在黑龙江省佳木斯市桦南县孟家岗镇开展了蜱媒携带病原体的调查。运用形态学方法，将获得的全部蜱标本进行分类鉴定，共采集到1科3属5种421只蜱，其中40只为若蜱未进行形态学鉴定。在1只饱血嗜群血蜱中检测到SGLV核酸阳性，表明该地区可能存在SGLV感染流行^[4]。

SGLV属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）内罗病毒科正内罗病毒属（Orthonairovirus）成员，为反义单链RNA病毒，基因组包括L、M、S 3个节段。SGLV于2017年首次从我国黑龙江省大兴安岭地区松岭区的1名蜱叮咬后不明原因发热患者的血液中发现，并命名为“松岭病毒”，随后在黑龙江省和内蒙古自治区的658例住院患者中检测到42例SGLV感染者^[9]。2021年，在我国黑龙江省塔河县嗜群血蜱中检测到SGLV^[13]。随后，在新疆维吾尔自治区（新疆）阿拉山口市和古尔班通古特沙漠边缘玛纳斯县的大沙鼠（Rhombomys opimus）脾脏标本中检测到SGLV的L节段，这是首次从啮齿动物中发现SGLV，同时也表明啮齿动物可能是SGLV的储存宿主^[6]。迄今为止，SGLV仅在我国发现，地理分布范围包括我国东北的大、小兴安岭和西北的新疆^{[6, 9, 13]}，该病毒的宿主范围和地理分布尚有待进一步研究。SGLV属于新发蜱媒病毒，目前尚无针对该病毒的治疗方法及疫苗，最近，有研究者利用免疫信息学鉴定了4种潜在的疫苗靶蛋白，设计了一种具有广泛全球覆盖范围的综合候选疫苗，为SGLV-V4的疫苗研究奠定了基础^[14]。本研究首次在佳木斯市桦南县蜱中检测到SGLV，为该地区蜱媒病毒性疾病的预防和控制提供了理论依据。

利益冲突  无