精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)是无脊椎动物体内唯一磷酸原激酶，通过催化精氨酸和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的可逆反应，产生磷酸精氨酸和二磷酸腺苷镁(magnesium adenosine diphosphate，MgADP)，是机体能量代谢的关键激酶^[1]。昆虫中AK的表达水平会受到精确的调节，以确保ATP含量和细胞能量的平衡^[2]。AK的表达水平与昆虫的发育阶段密切相关，而蜕皮激素和保幼激素是调控昆虫生长发育的重要因子^[3]。蜕皮激素尤其是最具生物活性的20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)，在昆虫幼虫蜕皮和变态方面发挥着重要的作用^[4]。20E的激活直接受2个核受体—蜕皮激素受体(ecdysone receptor，EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein，USP)的共同调控，只有当EcR和USP形成异源二聚体后，20E方可与EcR结合形成20E-EcR/USP复合体，随后激活诱导Broad-complex(BR-C)等早期应答基因的表达，完成蜕皮反应过程。因此EcR和Br-C是蜕皮激素信号通路上的关键基因^[5]。保幼激素(juvenile hormone，JH)是昆虫在发育过程中由咽侧体所分泌的一种激素，在幼虫期保持幼虫蜕皮后的形状与特征，在成虫期促进雌成虫的卵发育和雄成虫的性成熟，参与昆虫的各项生理功能，如蜕皮、化蛹、羽化、生殖等^[6-7]。保幼激素受体(methoprene-tolerant，Met)和下游转录因子(kruppel homolog 1，Kr-h1)是保幼激素信号通路上的关键基因，在调控昆虫发育和生殖过程中发挥重要的作用^[3]。目前，已在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、烟夜蛾(Helicoverpa assulta)和中华蜜蜂(Apis cerana cerana)中发现不同发育阶段AK的活性与蜕皮激素滴度变化一致^[8-10]。检测家蚕(Bombyx mori)AK基因(BmAK)在幼虫和蛹中的表达发现，BmAK基因的表达量变化趋势与蜕皮激素滴度变化趋势相一致^[11]。棉铃虫(Helicoverpa armigera)的AK基因HaAK在多种组织和幼虫发育阶段均有特异性表达，在5龄幼虫的中肠中表达量最高，HaAK的沉默显著延缓了幼虫的发育^[12]。本实验室在前期研究中发现CpAK1和CpAK2的表达具有发育阶段特异性，CpAK1和CpAK2在蛹期的表达量较高^[13]。本研究在此基础上，利用外源激素处理和RNA干扰信号通路关键基因分析保幼激素和蜕皮激素对CpAK1和CpAK2表达的影响，研究结果阐明了保幼激素和蜕皮激素对淡色库蚊(Culex pipiens pallens)2种AK的调节作用，对深入了解2种AK的功能有重要的意义。

淡色库蚊品系引自江苏省疾病预防控制中心，扬州大学植物保护学院养虫室连续多代饲养，饲养条件：温度(27±2)℃、湿度(70±5)%、光周期(L∶D)12 h∶12 h，幼虫期饲喂全营养鼠粮，成虫期饲喂5%~10%蔗糖水，用小白鼠给血繁殖。

烯虫酯、20-羟基蜕皮酮(Sigma-Aldrich)，TAE buffer、DNA Marker[生工生物工程(上海)股份有限公司]，TEMED(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，Tissue Protein Extraction Kit(康为世纪生物科技公司)，HiScript^® II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，10%TGX FastCast Acrylamide Kit、过硫酸氨APS、HRP-coupled secondary anti-rabbit、anti-mouse antibodies、Tanon™ High-sig ECL Western Blotting Kit、TRIZol^® reagent、RNase-free ddH₂O、75%乙醇溶液、三氯甲烷、异丙醇(中国医药集团有限公司)。

一抗：CpAK1和CpAK2的抗体合成由金斯瑞生物科技股份有限公司完成。分别以CpAK1的C端CIYDISNKRRMGLTE氨基酸序列和CpAK2的C端MASREAFRKYLEGAC氨基酸序列合成肽段作为抗原注射进兔体内进行多克隆抗体制备。

二抗：Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody，购于上海索莱宝生物科技有限公司。

微量注射器(Hamilton)，显微镜(奥林巴斯有限公司)，干式恒温零度金属浴[天根生化科技(北京)有限公司]，ChemiDoc^TM Touch lmaging System(Bio-Rad)、CFX96^TM real-time PCR Systems(Bio-Rad)、PCR扩增仪Mastercycler nexus GX2(Eppendorf)、5424R高速冷冻离心机(Eppendorf)、微量移液器(Eppendorf)、DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、DYCP-31CN电泳槽(北京六一生物科技有限公司)、捷达凝胶成像系统(江苏捷达科技发展有限公司)。

用食用色素溶液配制终浓度为2 000 ng/μl的蜕皮激素20E和5 000 ng/μl保幼激素类似物烯虫酯，使用10 μl注射器(Hamilton)，在淡色库蚊蛹的腹下第二、三体节间隙注射200 nl激素混合液，对照组注射相同量的未加入激素的色素混合液，分别在注射后1、6、12和24 h收集样品，每个处理3个生物重复，每个重复10头蛹。

根据淡色库蚊各基因序列设计dsEGFP、dsBR-C、dsECR、dsKrh-1和dsMet特异性引物进行PCR扩增(表 1)。使用Thermo Fisher Scientific公司的TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit试剂盒合成dsBR-C、dsECR、dsKrh-1、dsMet和dsEGFP体外双链。用显微注射法进行RNA干扰。对淡色库蚊蛹分别注射5 000 ng/μl dsBR-C、dsECR、dsKrh-1和dsMet 200 nl，阳性对照组注射5 000 ng/μl的dsEGFP溶液200 nl，同时设立空白对照组(WT组)。每个处理3个生物重复，每个重复10头蛹。

表 1 dsRNA合成引物 Table 1 Primers for dsRNA synthesis

表选项

使用组织蛋白提取试剂盒提取蛋白，主要提取步骤如下：

(1) 试虫收集：分别注射20E和烯虫酯，在注射后6 h和12 h收集试虫，称取100 mg试虫，随后立即进行虫体蛋白提取。

(2) 配置1×工作液，取适量预冷的组织蛋白提取试剂，抽提蛋白2~3 min，按照1∶99比例加入蛋白酶抑制剂混合物。

(3) 按照0.1 g组织加入1 ml 1×工作液的比例加入足量的工作液，转移至灭菌后匀浆器中，在冰上匀浆处理，随后冰上孵育20 min。

(4) 10 000 ×g离心20 min，转移上清至新的离心管中，使用二喹琳甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定，稀释同浓度蛋白进行蛋白活性测定。

测定步骤如下：

(1) 制蛋白胶，按照10% TGX FastCast Acrylamide Kit(Bio-Rad)说明书操作。

(2) 纯化蛋白中加入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液，吹打混匀，沸水中煮沸变性10 min。

(3) 将变性后的蛋白上样SDS-PAGE电泳，定压200 V，20 min左右。

(4) 转膜：取出SDS-PAGE蛋白胶，根据蛋白条带的尺寸裁剪聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，甲醇中浸泡1 min，按照3层滤纸、目的蛋白胶、PVDF膜、3层滤纸顺序安装转膜装置，注意对应电极方向；将装置放于冰上，加入电泳液1×Transing buffer没过蛋白胶，定流200 mA，90 min。

(5) 封闭：配置封闭液，配置含5%脱脂牛奶的洗膜缓冲液(tris buffered saline tween，TBST)，将PVDF膜浸入封闭液中，置于摇床室温下60 r/min，封闭1 h，倒尽封闭液，用TBST清洗PVDF膜，置于摇床，每次5 min，重复3次。

(6) 孵育：TBST配置一抗混合液(1∶1 000)，一抗混合液浸过PVDF膜，置于摇床室温下60 r/min，1 h或过夜；回收一抗混合液，置于摇床，用TBST清洗PVDF膜，每次5 min，重复3次；TBST配置二抗混合液(1∶8 000)，二抗混合液浸过PVDF膜，置于摇床室温下60 r/min，1 h。

(7) 回收二抗混合液，置于摇床，用TBST清洗PVDF膜，每次5 min，重复3次；配置显色液：使用增强型化学发光(enhanced chemiLuminescence，ECL)底物试剂盒，其中A液与B液按照1∶1配置，滴在PVDF膜上，5 min后，观察并拍照。

采用Trizol法分别对不同试验组的淡色库蚊蛹进行RNA提取，将获得的RNA保存于-80 ℃超低温冰箱备用。参照cDNA合成试剂盒(TransScript^®ⅡOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)步骤，合成反转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)备用的第1链cDNA模板，产物保存于-20 ℃。

注射20E、烯虫酯处理组，检测CpAK1和CpAK2的mRNA表达量。注射体外双链dsBR-C、dsECR、dsKrh-1和dsMet处理组分别检测CpBR-C、CpECR、CpKrh-1和CpMet的mRNA表达水平。在确认注射双链组有显著干扰效率情况下，再使用同一模板对CpAK1和CpAK2的mRNA表达量进行检测。根据已获得的CpAK1(MZ491206)和CpAK2(MZ491207)以及淡色库蚊CpBR-C、CpECR、CpKrh-1和CpMet基因序列设计特异性荧光定量引物，以淡色库蚊的肌动蛋白β-actin基因作为内参基因，合成特异性引物见表 2。

表 2 用于CpBR-C、CpECR、CpKrh-1、CpMet、CpAK1和CpAK2反转录实时荧光定量PCR扩增的引物 Table 2 Reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR primers for CpBR-C, CpECR, CpKrh-1, CpMet, CpAK1, and CpAK2

表选项

荧光定量10 μl的反应体系：2×SYBR Premix ExTaqⅠ5 μl、正反向引物各0.4 μl、cDNA 1 μl、ddH₂O 3.2 μl。将配置好的溶液，短暂离心混匀。使用CFX96™荧光定量PCR仪(Bio-Rad)，反应步骤如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，65 ℃延伸5 s，循环20次。扩增反应的特异性通过熔解曲线分析检测。

所有数据均以平均值±标准误表示，使用SPSS 13.0软件进行数据分析，采用One-Way方差分析和最小显著性差异(LSD)法对组间差异性进行比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

在淡色库蚊蛹期注射20E或烯虫酯后1、6、12和24 h收集样品，经过实时荧光定量和WB实验分析，发现注射蜕皮激素20E后，CpAK1的mRNA表达水平整体下降，24 h下调至19.77%(图 1A)。而CpAK2的mRNA表达水平上升，6 h和12 h分别上调5.70和2.77倍，24 h恢复正常表达水平(图 1B)。经WB分析发现，6 h CpAK1的蛋白表达水平显著下调，而CpAK2的蛋白表达水平在6 h和12 h均无显著变化。见图 1C、D。

注：A 20E处理不同时间后CpAK1的相对表达量；B 20E处理不同时间后CpAK2的相对表达量；C 20E处理不同时间后CpAK1和CpAK2蛋白表达水平；D 20E处理不同时间后CpAK1和CpAK2蛋白表达对应的灰度值；α-Tubulin α微管蛋白；数据均以平均值±标准误表示；a P < 0.01；b P < 0.05。WT为对照组，仅注射相同量的未加入激素的色素混合液。 图 1 20E处理对CpAK1和CpAK2的mRNA和蛋白表达水平的影响 Figure 1 The effects of treatment with 20E on the mRNA and protein expression of CpAK1 and CpAK2

图选项

注射烯虫酯后，CpAK1的mRNA表达水平在1~12 h变化不大，24 h明显上升，为对照组的3.36倍(图 2A)。而CpAK2的mRNA表达水平整体下降，其中在6 h和12 h均显著下降，在12 h达到最低值，仅为对照组的39.34%(图 2B)。在蛋白水平方面，处理6 h和12 h后CpAK1的蛋白水平显著上调，而CpAK2的蛋白水平显著下调。见图 2C、D。

注：A烯虫酯处理不同时间后CpAK1的相对表达量；B烯虫酯处理不同时间后CpAK2的相对表达量；C烯虫酯处理不同时间后CpAK1和CpAK2蛋白表达水平；D烯虫酯处理不同时间后CpAK1和CpAK2蛋白表达对应的灰度值；α-Tubulin α微管蛋白；数据均以平均值±标准误表示；a P < 0.01；b P < 0.05。WT为对照组，仅注射相同量的未加入激素的色素混合液。 图 2 烯虫酯处理对CpAK1和CpAK2的mRNA和蛋白表达水平的影响 Figure 2 The effects of treatment with methoprene on the mRNA and protein expression of CpAK1 and CpAK2

图选项

对收集的蛹分别注射dsBR-C和dsECR，通过RT-qPCR技术检测，注射dsBR-C后在12 h有干扰效率，CpBR-C的表达量下调至38.26%。CpBR-C表达量下调导致CpAK1表达水平上调2.35倍，而CpAK2表达水平下调，仅为对照的2.80%，几乎不表达(图 3A)。注射dsECR，在24 h检测干扰效率为47.89%，在CpECR基因表达水平下调情况下，CpAK1表达水平上调8.13倍，而CpAK2表达水平下调42.79%(图 3B)。沉默2种蜕皮激素信号通路相关基因CpBR-C和CpECR，发现对2种AK的调控结果相同，均对CpAK1负调控，而对CpAK2正调控。

注：A敲减CpBR-C后CpAK1和CpAK2的相对表达量；B敲减CpECR后CpAK1和CpAK2的相对表达量；数据均以平均值±标准误表示；a P < 0.01；b P < 0.05。WT为空白对照组。 图 3 CpBR-C(A)、CpECR(B)敲减对CpAK1和CpAK2的mRNA表达水平的影响 Figure 3 The effects of knockdown of CpBR-C (A) and CpECR (B) on the mRNA expression of CpAK1 and CpAK2

图选项

根据淡色库蚊CpMet和CpKr-h1的基因序列，合成设计特异性双链dsMet和dsKr-h1进行蛹期注射干扰，在24 h检测沉默效率分别为60.64%和81.00%，与对照dsEGFP相比，CpMet的沉默导致CpAK1表达水平下调至43.87%，而CpAK2表达水平上调3.05倍(图 4A)。干扰CpKr-h1基因导致CpAK1表达水平下调至13.59%，而CpAK2表达水平上调4.35倍(图 4B)。2种AK对2种保幼激素信号通路相关基因CpMet和CpKr-h1下调响应模式相同，即均对CpAK1正调控，对CpAK2负调控。

注：A敲减CpMet对CpAK1和CpAK2的相对表达量；B敲减CpKr-h1后CpAK1和CpAK2的相对表达量；数据均以平均值±标准误表示；a P < 0.01；b P < 0.05。WT为空白对照组。 图 4 CpMet(A)、CpKr-h1(B)敲减对CpAK1和CpAK2的mRNA表达水平的影响 Figure 4 The effects of knockdown of CpMet (A) and CpKr-h1 (B) on the mRNA expression of CpAK1 and CpAK2

图选项

昆虫正常的生长发育进程是保幼激素和蜕皮激素相互调节的结果，有研究发现AK可能受蜕皮激素和保幼激素的调控，例如使用蜕皮激素处理中华蜜蜂后，观察到AK的表达显著上调^[8]。昆虫的滞育阶段受多种激素的共同调控，其中保幼激素的缺乏是引起昆虫滞育的重要因素，分析红尾肉蝇(Sarcophaga crassipalpis)和棉铃虫(H. armigera)滞育阶段蛋白转录组，发现AK的表达下调^[14-15]。Zhang等^[16]在赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中发现，在幼虫到蛹的变态过程中用20E、保幼激素直接处理和沉默20E、保幼激素调控信号通路的相关基因，对TcAK1和TcAK2调控方向相同，即20E负调控TcAK1的表达，正调控TcAK2的表达，而保幼激素对TcAK1的表达正调控，对TcAK2的表达负调控。本研究通过20E或烯虫酯直接注射淡色库蚊蛹也得到相同的结果，20E对CpAK1的表达负调控，对CpAK2正调控，而烯虫酯对CpAK1的表达正调控，对CpAK2负调控。干扰蜕皮激素受体基因CpECR及其转录因子CpBR-C后，CpAK1表达显著上调，CpAK2显著下调。干扰保幼激素受体基因CpMet及其下游转录因子CpKr-h1发现，CpAK1表达下调，CpAK2显著上调。这些结果进一步证实了CpAK1和CpAK2受保幼激素和蜕皮激素的调控，并且2种激素对这2种AK的调控机制完全相反。AK是能量代谢的关键激酶，与昆虫蜕皮、化蛹、羽化、生殖等能量需求高的生命活动密切相关^[17]。本研究表明在蚊虫化蛹到羽化的阶段，2种AK的表达水平受到蜕皮激素和保幼激素的调节，总体保持相对恒定，这种调节机制对于维持ATP的稳态具有重要意义。

利益冲突  无