蜱属于节肢动物门蛛形纲蜱目(Ixodida)，是脊椎动物的专性非永久性外寄生虫，可传播多种病原体，对公共卫生和畜牧业发展产生影响。长须血蜱(Haemaphysalis aponommoides)隶属于硬蜱科血蜱属，多寄生于牦牛和黑熊，广泛分布于尼泊尔、印度以及我国西藏、青海、贵州、甘肃、湖南等省(自治区)。该蜱形态特殊，是进化中较为原始的类型，同时也是人类和动物疾病的潜在传播媒介^[1]。目前，对于蜱类的防治以化学防治为主，而化学杀虫剂的长期使用容易造成环境污染、蜱类抗药性和化学药物残留等问题^[2-3]，因此，急需寻找一种新的经济有效、绿色可持续的防治方法来代替化学杀虫剂防治策略。

蜱类可利用其第1对足跗节上哈氏器(Haller’s organ)的化学感应功能实现对宿主的感知和定位^[4-5]，这种化学感知功能在蜱类躲避猎物、获取食物、交配和产卵场所选择等方面发挥重要作用^[6]。了解蜱类的嗅觉感应分子基础和反应机制，可为新的驱蜱剂或引诱剂的开发提供新的思路。C型尼曼-匹克蛋白2(Niemann-Pick C2 protein，NPC2)是一种小的可溶性携脂蛋白，主要参与脊椎动物的脂质代谢，NPC2蛋白具有和气味结合样蛋白(odorant binding protein like，OBPL)、化学感受蛋白(chemosensory protein，CSP)类似结构及功能特征，表明它们可能在蜱、螨等节肢动物的化学感受中发挥气味结合蛋白作用^{[5, 7-10]}。近年来，关于嗅觉相关蛋白的研究受到广泛关注，主要集中在蜘蛛、蚂蚁、蜜蜂、蚊虫等类群^{[7, 11-13]}，而对于蜱类嗅觉相关蛋白的研究鲜有报道。本研究旨在通过对长须血蜱转录组数据库的嗅觉相关基因进行筛选、同源建模和分子对接，初步了解其对潜在气味刺激的感应机制和嗅觉感应分子基础，为探索有效的蜱类控制技术，进而为促进蜱和蜱媒病的防治提供技术支撑^[5]。

长须血蜱采自甘肃省天祝藏族自治县野外植物上，带回后经形态学鉴定，饲养于室温为(25±1) ℃、相对湿度为(70±10)%、自然光周期的实验室环境。成蜱饲血采用新西兰兔(普通级)，幼蜱和若蜱采用昆明小鼠(清洁级)。

用不含核糖核酸酶(RNase)的水将未吸血的雌性成蜱清洗3次，加入液氮并研磨样品。使用RNA提取试剂盒(QIAGEN，货号：74136)从3组未饲血的雌蜱中提取总RNA(每组5只)。使用Nanodrop 1000分光光度计(Thermo Fisher Scientifc)测量核酸浓度。然后建立cDNA文库，并在Illumina HiSeq平台上进行转录组测序和组装(Novogene Technology，中国北京)。测序数据提交美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库，收录于蜱转录组项目(项目号：PRJNA1059273)SRR27389208，基因登录号：PP375530.1~PP375533.1。测序返回的数据进行整理分析，首先对原始测序读长(reads)进行去除接头序列和低质量读长后得到高质量读长，然后使用MEGAHIT将高质量读长进行从头(de novo)组装得到连续序列(contigs)。用基于局部比对算法的搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)的BLASTx将组装好的连续序列与NCBI非冗余蛋白质数据库(Nr)进行比较，为保持高灵敏度和低假阳性率，将期望值(E value)的阈值设为1×10^-5，获得全部序列的分类信息，根据分类信息提取相关序列，使用Lasergene 17.3软件包中的SeqMan程序对获得的序列进行合并和去重，从而获得目标片段的完整核苷酸序列。为避免组装拼接错误，将读长映射到相应的参考序列上，同时利用Geneious Prime 2023软件检查映射结果，库中每百万读长(read per million mapped reads，RPM)来估计每个靶标基因的丰度。BLAST同源比对和基因注释使用7个大型数据库[Nr、核酸序列数据库(Nt)、蛋白质家族数据库(Pfam)、真核生物蛋白质直系同源簇(KOG)、Swiss Prot、京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)]^[14]。使用开放阅读框(open reading frame，ORF)预测单基因的氨基酸序列。使用针对Pfam的基于隐马尔可夫模型的序列比对工具(hidden Markov model for molecular evolution，HMMER)搜索NPC2同源序列蛋白质数据库，并通过预测跨膜区编码进行鉴定。

为了确定目标序列与其他节肢动物类NPC2序列之间的进化关系，利用BLASTp将目标蛋白序列与NCBI数据库比较，筛选来自不同节肢动物的NPC2同源序列，下载fasta格式序列。将所有氨基酸序列输入MEGA 11.0，进行序列对齐，按最大似然法构建进化树。建树参数：建树检验方法为自助法(bootstrap method)、bootstrap值调整为1 000、其他参数设置为默认。

针对蛋白质数据库的NPC2、microplusin样蛋白(microplusin-like protein，ML)和OBPL序列，在PDB数据库(http://www.rcsb.org)搜索预先构建的位置特定评分矩阵(position-specific scoring matrix，PSSM)中蛋白质序列，以获得同源蛋白质模型。BLAST返回的配置文件使用Clustal W 2.0软件进行分析以获得多重序列比对和系统图。然后利用Swiss-Model软件进行同源建模，先根据序列相似性重新排列同源蛋白pro文件和二级结构，再通过同源性、进化、序列相似性、半胱氨酸(Cys)的数量系统图和结构参数选择最优模型。建模参数设置：“最大主链模型数量”为50、“侧链样品在300K”为5，“中间体”和“最终模型”设置为“优”、AMBER99参数设置为“原子力场”、其他参数设置为默认值。建模后，模型的立体结构优化和自由能最小化分别通过广义波恩-体积整合技术(generalized Born/volume integral methodology)和溶剂化自由能计算(electrostatic solvation energy)进行优化。

以优化后的蛋白三级结构同氨水、吲哚等挥发性气味分子进行分子对接。对接采用Sybyl-X 2.0中的Docking Suite标准模式进行。对接多通道曲面参数设置为原型分子摩尔生成，膨胀系数设置为2 Å，单分子额外起始构象增加为10，“搜索密度”设置为6。为提高对接精度，还考虑了环的灵活性，将最终构象之间的最小均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)设置为0.5 Å，其他参数设置为默认值。

从长须血蜱中共获得嗅觉相关转录子6个，其中，3个转录子的全长ORF核苷酸长度分别为501、480和444 bp，编码氨基酸长度分别为166(NPC2-1)、159(NPC2-2)和147 aa(NPC2-3)，经在线BLASTp比对，与长角血蜱(Ha. longicornis)NPC2序列高度同源；1个转录子全长ORF核苷酸长度为541 bp，编码氨基酸长度为180 aa，与长角血蜱OBPL序列高度同源；剩余2个转录子的全长ORF核苷酸长度分别为453和330 bp，编码氨基酸长度分别为150(ML-1)和110 aa(ML-2)，与长角血蜱嗅觉相关的ML蛋白高度同源。与目标蛋白的序列相比，这些嗅觉相关蛋白NPC2(相对分子质量为17 742，等电点为9.03)、OBPL(相对分子质量为20 206，等电点为6.32)和ML(相对分子质量为16 185，等电点为7.32)，在100%覆盖度下，氨基酸相似率均 > 90%。基于这些序列利用最大似然法构建的系统发育树结果显示，长须血蜱的上述嗅觉相关蛋白，与相近的长角血蜱、褐黄血蜱(Ha. flava)、青海血蜱(Ha. qinghaiensis)等血蜱属种类的相应蛋白序列聚为一支。见图 1。

图 1 长须血蜱3个候选嗅觉相关蛋白与其他节肢动物候选蛋白的系统发育关系 Figure 1 Phylogenetic relationship between three candidate olfaction-related proteins of Haemaphysalis aponommoides and those of other arthropods

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对上述蛋白的二级结构分析结果显示，经SignalP 5.0预测，NPC2的信号肽长度不等，为20~43 aa，结构域编码长度130 aa；含有6个Cys残基，9个β-折叠，5个转角，结构特征为X49-C1-X14-C2-X4-C3-X45-C4-X6-C5-X41-C6-X9(X代表任何氨基酸)。OBPL蛋白的信号肽长度为17 aa，结构域编码长度为148 aa。OBPL具有典型的6个Cys残基，具有2个β-折叠、5个α-螺旋，2个转角，属于X38-C1-X11-C2-X27-C3-X37-C4-X21-C5-X9-C6-X11(X代表任何氨基酸)OBP亚群。仅1条ML蛋白序列(ML-1)有信号肽，长度为20 aa，结构域编码130 aa；含有6个Cys残基，9个β-折叠，5个转角，结构特征为X26-C1-X14-C2-X5-C3-X45-C4-X5-C5-X40-C6-X9(X代表任何氨基酸)。见图 2。

注：Rh. Rhipicephalus；Ha. Haemaphysalis；Aa. Amblyomma。 图 2 长须血蜱3个候选嗅觉相关蛋白的二级结构示意图 Figure 2 Schematic representation of secondary structure of three candidate olfaction-related proteins of Haemaphysalis aponommoides

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使用Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)对所获得序列进行同源蛋白搜索，以相似度 > 50%为阈值获得了长须血蜱NPC2的同源结构蛋白12个，包括附节扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)NPC2(A0A131YR94)、牛NPC2(2 hka，1nep)、人NPC1-NPC2(5kwy，6w5v)等，选择A0A131YR94作为同源建模的模型，长须血蜱NPC2蛋白模型较为理想预测[全局模型质量估计(global model quality estimation，GMQE)值为0.73]，平均精度局部距离差测试(predicted local distance difference test，pLDDT)值为86.56%。通过能量最小化和空间结构优化，模板A0A131YR94与长须血蜱NPC2之间的α-碳原子(αC)的成对最小平方根为1.736 Å，冲突评分为1.23。在Ramachandran图谱中，90.51%的残基(118个残基)位于允许的区域，仅1个A13MET残基(0.63%)位于边缘区域附近(表 1)。长须血蜱NPC2的结合腔由5个转角和9个β-折叠形成。结合腔腔壁主要由64个疏水性残基形成，占比为50.46%，包括Val20、Leu30、Tyr36、Val59、Val64、Phe66、Leu94、Tyr100、Pro101和Ile124等。亲水性残基占比为27.42%，也是腔壁的一部分，包括Glu3、Cys25、Thr41、Asp44、Glu65、Cys68、Cys81、Thr94、Cys97、Glu115、Tyr124、Cys127、Cys138、Thr141和Cys150等(图 3A)。

表 1 长须血蜱3个候选嗅觉相关蛋白3D同源建模模型评估参数 Table 1 Evaluation parameters for 3D homology models of three candidate olfaction-related proteins of Haemaphysalis aponommoides

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图 3 长须血蜱3个候选嗅觉相关蛋白的三维结构模型 Figure 3 Three-dimensional structure models of three candidate olfaction-related proteins in Haemaphysalis aponommoides

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长须血蜱OBPL同源结构蛋白5个，包括长角血蜱HAELO(G3BJU6)、蜂蟹螨(Varroa destructor)OBP(7nza，7nyj)等。最后主要基于以下几点选择G3BJU6为基准进行同源建模：(1)依据蛋白结构分类原则，G3BJU6属于蛛形纲气味结合蛋白OBP家族。(2)系统发育结果显示，该序列与同为血蜱属的长角血蜱HAELO G3BJU6蛋白具高度同源性(96.57%)，期望值为2×10^-21，高于其他基准模型。(3)依据传统的嗅觉蛋白分类方法，该OBPL具有典型的6个Cys残基和5个α-螺旋，同G3BJU6蛋白结构特征类似。(4)长须血蜱OBPL除信号肽外，结构域编码氨基酸是连续的，没有间隙存在。其OBPL蛋白建模结果符合要求(GMQE值为0.80)，平均精度pLDDT值为83.19%。通过能量最小化和空间结构优化，模板G3BJU6与长须血蜱OBPL之间的α-碳原子的成对均方根误差(root mean square error，RMSE)为1.856 Å，冲突评分(clashcore)为0.36。在Ramachandran图谱中，91.67%的残基(165个残基)位于允许的区域，2.30%的残基(4个残基，即A14ILE、A170PRO、A172PRO和A176PRO)位于边缘区域附近，显示其整体立体化学质量总体可靠和可接受(表 1)。与蚊虫OBP具有6个α-螺旋不同的是，长须血蜱OBPL的结合腔由5个α-螺旋形成，分别为α1(42~62)、α2(73~90)、α3(62~70)、α4(79~86)和α5(93~103)。长须血蜱OBPL具有C端螺线(η1)，N末端没有形成螺旋。结合腔腔壁主要由62个疏水性残基形成，占比为41.83%，包括Thr9、Ile137、Ile143等；亲水性残基占比27.42%也是腔壁的一部分，包括Asp15、Glu37、Asp55、Thr65、Cys70、Try73、Glu79、Asp 91和Cys137等，残基Arg31的氧原子指向空腔中心，形成了空腔的极性表面。见图 3B。

长须血蜱ML蛋白同源结构蛋白11个，包括澳丽花蜱(Amblyomma aureolatum)ML(A0A1E1 WY90)、人NPC2(5kwy、6w5v和2 hka)和牛NPC2(1nep)，同理选择A0A1E1 WY90作为同源建模基准，模型GMQE值为0.87，平均精度pLDDT值为91.94%。模板A0A1E1 WY90与长须血蜱ML之间的αC的成对最小RMSE为1.529 Å，冲突评分为3.08。在Ramachandran图谱中，96.09%的残基(144个残基)位于允许的区域，仅1.56%残基(A56PRO和A71PRO 2个残基)位于边缘区域附近(表 1)。长须血蜱ML的结合腔由5个转角和9个β-折叠形成，其中疏水性残基占50.35%，亲水性残基占29.10%。长须血蜱ML蛋白质的结合腔，仅具备Asn39和Asn89氢键结合位点。见图 3C。

根据Sybyl-X的Surflex Dock预测，NPC2配基与吲哚碱在12~19个疏水性残基形成的结合口袋中心重叠(图 4A)。与NPC2不同，吲哚碱与结合配体在长须血蜱OBPL口袋的中心重叠，OBPL与吲哚碱结合位点包括Thr9、Ile137和Ile143，Thr65和Cys70与吲哚碱的氧原子之间形成氢键(图 4B)。ML则通过疏水性残基ASN39、ASN89进行结合(图 4C)。

图 4 长须血蜱3个候选嗅觉相关蛋白与配体的分子对接结果 Figure 4 Molecular docking for three candidate olfaction-related proteins with potential ligands in Haemaphysalis aponommoides

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目前对非昆虫节肢动物的化学感知研究较少^[15]。基于这些研究，嗅觉受体(GRs)和离子型受体(IRs)被认为是蜱类化学感知的重要受体。2014年在日本弓背蚁(Camponotus japonicus)中发现了NPC2蛋白^[7]，这是节肢动物中首次发现的嗅觉相关蛋白，该蛋白在非昆虫节肢动物中能起到信息化学载体的作用，同昆虫中普遍存在的气味结合蛋白(OBP)和CSP功能类似^[8]。此后，一些蜱类的嗅觉蛋白研究逐渐被重视。迄今为止，硬蜱属(Ixodes)^{[4, 9]}，花蜱属(Amblyoma)^[5]、扇头蜱属^[4]和钝缘蜱属(Ornithodoros)^[16]中已分别发现了多个同源序列。本研究中，3个编码NPC2蛋白、2个编码ML蛋白和1个编码OBPL蛋白的候选基因序列从长须血蜱的转录组数据库中获得，该结果丰富了蜱虫嗅觉基因的相关数据。系统发育分析表明，长须血蜱NPC2、ML和OBPL基因与其他蜱种的同类基因具有一定的同源性，它们的亲缘关系随科、属、种分类阶元的变化又存在一定的特异性，显示出分化的趋势。即使在同一蜱种中，这些基因的表达也存在着一定变异，这与先前的研究结果相似^[8]。本研究仅检测了4个候选NPC2基因，其中NPC2-1和NPC2-2同源性较高，分别与血红扇头蜱(R. sanguineus)和森林革蜱(D. silvarum)同源性较高。鉴于蜱类嗅觉相关基因的丰富性和复杂性，未来可能在长须血蜱等重要蜱种中发现更多的嗅觉功能序列。

本研究中，长须血蜱中NPC2和OBPL基因的分子结构和配基结合特点，提示了这些基因参与长须血蜱嗅觉感应的可能性，具体功能还有待进一步的体内结合实验验证。本研究仍有一些明显的局限性。由于需要蜱虫数量较多，参考文献较少，本研究的转录组序列是基于蜱类个体，而不是按器官进行，尤其是第1对足，因此，NPC2、ML和OBPL基因的结果不具备较好的器官针对性。这些基因的定量表达尚需针对不同组织、发育阶段处理进行分析与验证。总之，本研究发现长须血蜱的OBPL和NPC2均具备了参与嗅觉感应的结构特征，为未来探索蜱类高效引诱剂或驱避剂，进而有效控制蜱类和蜱媒病的传播提供了基础数据和技术支撑。

利益冲突  无