肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus，HV)引起的自然疫源性疾病，病原体包括汉滩病毒(Hantaan virus，HNTV)、首尔病毒(Seoul virus，SEOV)、普马拉病毒(Puumala virus，PUUV)等，主要由啮齿动物和蝙蝠等传播^[1-2]。人类可通过吸入或直接接触感染宿主动物排泄物等感染^[3]。中国是全世界HFRS发病率最高的国家，每年病例总数占全球病例总数的70%~90%^[4]。邓雪飞等^[5]分析显示2004－2021年全国31个省(自治区、直辖市)(不包括港、澳、台)累计报告224 396例HFRS病例。尽管近年来通过爱国卫生运动、疫苗接种和鼠类监测与控制等策略使得HFRS发病率下降，但其对我国的公共卫生安全仍构成巨大威胁。

汉坦病毒宿主主要包括啮齿目鼠类、劳亚食虫目鼩鼱(Soricidae)、鼹鼠(Talpidae)和翼手目蝙蝠等，不同基因型汉坦病毒具有宿主特异性，HTNV和SEOV的主要宿主分别为黑线姬鼠(Apodemus agrarius)和褐家鼠(Rattus norvegicus)^[2-3]。国际病毒分类委员会将汉坦病毒归于布尼亚病毒目汉坦病毒科正汉坦病毒属^[6]。其基因组为单股负链RNA，包含小(small，S)、中(medium，M)和大(large，L)3个片段，分别编码核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)、糖蛋白前体(glycoprotein precursor，GPC)和病毒RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(viral RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)^[2]。根据汉坦病毒基因序列，一般将HNTV分为9个基因型，SEOV分为6个基因型，近年监测结果显示汉坦病毒仍存在多种未分型的遗传进化分支^[7]。

基于全国病媒生物鼠类病原学监测工作，本研究对安徽省捕获的小兽进行汉坦病毒核酸检测，以评估安徽省不同地区小兽宿主携带汉坦病毒情况，通过对阳性标本进行病毒基因分型和核苷酸序列分析，了解安徽省汉坦病毒分子特征和地理分布特点，以期为HFRS防控提供技术支持。

2021年9月－2022年12月，安徽省16个地市疾病预防控制中心(疾控中心)按照《全国病媒生物病原学监测方案(试行)》和《安徽省鼠类生态学监测方案(试行)》的相关要求，在农村居民区、城镇居民区、重点行业(餐饮、食品制售、农贸市场、宾馆饭店等)、农田和林地等生境采集鼠类，主要通过夹夜法进行鼠类生态学监测和标本采集，各地市平均每2个月监测1次，将捕获标本进行解剖，采集肺部组织研磨，采用反转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)方法检测小兽感染汉坦病毒情况^[8]。将汉坦病毒核酸阳性小兽肺标本或研磨后的阳性混悬液送至安徽省疾控中心进行S基因序列扩增及序列分析。

DNA/RNA共提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司，SuperScript^TM ⅢOne-Step RT-PCR System with Platinum^TM Taq High Fidelity DNA Polymerase PCR试剂盒购自Invitrogen公司，普通PCR仪购自Eppendorf公司，电泳仪购自Bio-Rad公司，凝胶成像分析仪购自上海天能科技有限公司。

剪取黄豆粒大小小兽肺标本放入1.5 ml离心管中，加入500 μl磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，在生物安全柜内使用塑料研磨棒手工研磨至均一混悬液(或直接取送检阳性研磨后混悬液)，取上清液200 μl按照试剂盒说明书提取核酸，采用PCR试剂盒扩增汉坦病毒S片段，按照文献合成扩增引物(表 1)。扩增条件55 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，40个循环；68 ℃ 5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，阳性产物送至武汉天一华煜科技有限公司进行测序。

表 1 汉滩病毒和首尔病毒S片段引物序列^[9] Table 1 Primers for S segments of Hantaan virus and Seoul virus

表选项

将获得的测序结果使用DNAStar 7.1软件中的SeqMan进行序列拼接，拼接后完整序列使用MegAlign进行同源性比较；将本研究中获得序列与GenBank数据库下载参考序列采用MEGA 7.01软件进行核苷酸多重序列比对和进化树构建，绘制方法采用邻接法，bootstrap值为1 000。

2021年9月－2022年12月共捕获小兽4 075只。除去3只未识别外，共计8种小兽(包括啮齿目鼠类和食虫目鼩鼱科)，其中分别捕获褐家鼠、小家鼠(Mus musculus)、黄胸鼠(R. tanezumi)、黑线姬鼠、臭鼩(Suncus murinus)和针毛鼠(R. fulvescens)1 310、891、885、850、90和27只，分别占32.15%、21.87%、21.72%、20.86%、2.21%和0.66%。褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠和黑线姬鼠在安徽省分布最广，捕获数量最多，合计占比为96.59%(3 936/4 075)。

检出汉坦病毒核酸阳性小兽60只，阳性率为1.47%(60/4 075)，序列分析显示HNTV和SEOV均有检出。针毛鼠、褐家鼠、黑线姬鼠、小家鼠和黄胸鼠阳性率分别为3.70%(1/27)、1.83%(24/1 310)、1.53%(13/850)、1.35% (12/891)和1.02%(9/885)，安氏白腹鼠(Niviventer andersoni)捕获5只，阳性1只，其余检测结果均为阴性。HNTV主要在黑线姬鼠中检出，SEOV在褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、黑线姬鼠、针毛鼠和安氏白腹鼠6种小兽中均有检出。汉坦病毒主要分布在阜阳、淮南、合肥、滁州、马鞍山、铜陵、宣城和黄山8个地市。汉坦病毒基因型除阜阳市为HNTV外，其余地市均为SEOV。不同地市小兽汉坦病毒检出情况见表 2。

表 2 2021年9月－2022年12月安徽省小兽捕获情况及汉坦病毒检出情况 Table 2 Small mammals catches and Hantavirus detection rates in Anhui Province, September 2021 to December 2022

表选项

小兽主要来源于农村居民区、城镇居民区、重点行业、农田和林地5种生境，其中农村居民区小兽1 428只，阳性率1.40%(20/1 428)；城镇居民区617只，阳性率0.49%(3/617)；重点行业648只，阳性率3.55%(23/648)；农田1 088只，阳性率0.92%(10/1 088)；林地285只，阳性率1.05%(3/285)；其他生境9只，阳性小兽1只。

通过交叉PCR法扩增汉坦病毒S序列，共计扩增60份阳性标本，获得19条S序列，其中阜阳市7条(22FY129、22FY133、22FY145、22FY146、22FY149、22FY151和22FY163)，均来自黑线姬鼠；淮南市3条(22HN066、22HN068和22HN069)，均来自小家鼠；合肥市3条(22HF014、22HF060和22HF081)，均来自褐家鼠；马鞍山市1条(22MAS301)，来自褐家鼠；滁州市3条(22ChuZ150、22ChuZ153和22ChuZ171)，均来自黑线姬鼠；铜陵市2条(22TL194和22TL202)，均来自黄胸鼠；黄山和宣城市未获得完整S序列(图 1)。核苷酸序列同源性比较分析发现，阜阳市7条序列均为HNTV，与陕西省等地部分序列聚在一起，为H5亚型；获得SEOV序列共12条，与山东、湖北、江西、河北和浙江省等地部分序列聚在一起，为S3亚型，见图 2。

图 1 本研究中汉坦病毒在安徽省的地理分布情况 Figure 1 The geographical distribution of Hantavirus in this study in Anhui Province

图选项

注：●表示本研究中获得的SEOV序列；■表示本研究中获得的HNTV序列。 图 2 汉坦病毒S序列基因系统进化树 Figure 2 Phylogenetic tree of Hantavirus S segment

图选项

共获得19条汉坦病毒S序列，序列间核苷酸相似性为72.00%~100%，氨基酸相似性为83.00%~100%。7条HNTV核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%，与国际标准株76-118核苷酸同源性为86.90%，氨基酸同源性为97.90%；与中国代表株84FLi核苷酸同源性为98.10%，氨基酸同源性为99.50%；本研究中12条SEOV序列核苷酸和氨基酸的相似性分别为97.40%~100%和99.80%~100%。除22HF014外，其余序列氨基酸相似性为100%。SEOV序列与国际标准株80-39核苷酸同源性为96.90%~97.50%，氨基酸同源性为99.80%~100%，其中22HF014与80-39氨基酸序列完全一致。与中国代表株L99核苷酸同源性为95.80%~96.60%，氨基酸同源性为99.30%~99.50%。淮南、滁州、铜陵和阜阳4个地市其本地汉坦病毒核苷酸序列相似性为100%。

中国是HFRS高发国家之一，全国31个省(自治区、直辖市)(不包括港、澳、台)均有病例报道^[5]。1986年HFRS发病达到最高峰，发病例数高达10余万例。近年来国家通过实施免疫规划、健康促进、防鼠灭鼠和环境治理等综合干预措施，HFRS发病率已大幅下降，自2007年起HFRS发病已进入相对较低水平的平稳波动期^[5]。但近年云南、湖南和江西省等地HFRS病例再次出现大幅度波动，湖北和甘肃省部分县(区)也出现较大规模反弹，表明HFRS疫情仍不容忽视^[5]。近年研究发现，HFRS发病率与鼠密度、鼠带病毒率呈正相关关系^[10]。因此长期跟踪、监测鼠间汉坦病毒感染情况，可为HFRS传染病有效防控提供科学依据^[11]，并实现风险监测关口前移。

本研究表明，安徽省小兽优势种与湖北省相近，但种群结构与湖北省2018年病媒生物监测报告优势鼠种黄胸鼠(43.18%)、褐家鼠(27.27%)、小家鼠(21.59%)和黑线姬鼠(4.55%)的差异较大^[12]。与河南、山东省优势鼠种略有不同^[13-14]。2021年全国病媒生物鼠传病原监测报告中显示褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠、黑线姬鼠和北社鼠(N. confucianus)在全国各地捕获最多、分布最广^[8]。本次宿主动物汉坦病毒阳性率为1.47%，高于2021年安徽省鼠汉坦病毒阳性率^[8]。梁小洁等^[15]发现全国29个省(自治区、直辖市)均存在汉坦病毒宿主动物，并经血清学检测证实均存在HFRS的疫源地。2021年，监测人员在河北、辽宁、安徽和福建等13个省鼠肺中检测汉坦病毒核酸，阳性率在0.15%~26.20%，广东省阳性率最高^[8]。既往监测资料显示，HFRS在安徽省16个地市均有病例报道，排前6位的分别是阜阳、宣城、亳州、六安、宿州和滁州市^[16]，此次研究中汉坦病毒仅在阜阳、宣城、滁州等8个地市小兽中检出，可能与小兽携带汉坦病毒阳性率较低或采样点设置有关。

目前，中国发现73种脊椎动物可以感染汉坦病毒，包括61种哺乳类，8种鸟类，爬行类和两栖类各2种^[17]。HNTV和SEOV分别以黑线姬鼠和褐家鼠为主要宿主^[18]。研究表明HNTV存在于黑线姬鼠、北社鼠和褐家鼠等7种小兽中，SEOV至少在褐家鼠、黄胸鼠和黄毛鼠等13种小兽中检出^{[9, 19]}。本研究中HNTV仅在黑线姬鼠中检出，SEOV在褐家鼠、黑线姬鼠等6种小兽中检出。与刘源等^[20]研究结果一致，安徽省为HNTV和SEOV并存的混合型疫区。近年来，科研人员在云南省祥云、梁河县等地检测到与SEOV各基因亚型序列同源性 < 90%的未分类序列，提示SEOV存在新的基因亚型^{[7, 21]}。本研究测序SEOV序列相似性97.40%~100%，推测安徽省基因序列相似性较高，与河北省汉坦病毒基因型相似，均为S3亚型^[22]。本次研究中监测到HNTV H5和SEOV S3两种基因亚型。尚翠^[9]在2019年安徽省绩溪县HNTV阳性鼠肺标本分离到3株病毒株，S序列基因测序结果均为H9亚型。既往研究表明安徽省HNTV包含H1、H5和H9共3种基因亚型；SEOV包含S1、S3和S4共3种基因亚型，提示安徽省汉坦病毒基因型多样性^[9]。

HFRS为自然疫源性疾病，其发病情况与病毒和宿主之间相互作用、气候和气象因素、地理环境因素及经济和社会等因素密切相关^[23]，目前，病毒、宿主与人类间相互作用关系尚不清晰，科研人员可通过鼠类带病毒指数对HFRS的发病率进行预测^[24]，持续监测汉坦病毒在宿主动物间流行情况，对及时预测和预防汉坦病毒在人间的流行风险和地区分布具有重要意义。

利益冲突  无