2024, Vol. 35扩展功能
文章信息
- 崔永洁, 刘益萍, 崔佳, 饶华祥, 栗冬梅, 于娟
- CUI Yong-jie, LIU Yi-ping, CUI Jia, RAO Hua-xiang, LI Dong-mei, YU Juan
- 山西省长治市宠物犬人兽共患病病原菌及巴贝虫感染状况调查
- Prevalence of infections with zoonotic bacterial pathogens and Babesia in pet dogs in Changzhi, Shanxi Province, China
- 中国媒介生物学及控制杂志, 2024, 35(2): 232-236
- Chin J Vector Biol & Control, 2024, 35(2): 232-236
- 10.11853/j.issn.1003.8280.2024.02.018
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文章历史
- 收稿日期: 2023-09-13
2 长治医学院基础医学部, 山西 长治 046000;
3 长治医学院公共卫生与预防医学系, 山西 长治 046000;
4 传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室, 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室, 北京 102206
2 Department of Basic Medical Sciences, Changzhi Medical College, Changzhi, Shanxi 046000, China;
3 Department of Public Health and Preventive Medicine, Changzhi Medical College, Changzhi, Shanxi 046000, China;
4 National Key Laboratory of Intelligent Tracking and Forecasting for Infectious Diseases, Department of Vector Biology and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
近年来, 我国宠物饲养数量大幅度增加, 宠物是人类的朋友, 但同时也是人兽共患病的重要传染源和传播媒介。其中, 与人类关系最为密切的是宠物犬和宠物猫。目前, 已发现70多种人兽共患病与宠物犬、猫等有直接或间接关系[1]。由于其与人类有着密切接触, 使得宠物源人畜共患病的患病风险日益增加, 对人类健康存在潜在威胁。
巴尔通体（Bartonella）感染可以引起巴尔通体病, 主要表现为菌血症、淋巴结肿大、心内膜炎、视神经炎等, 在犬中已检测出汉塞巴尔通体（Bar. henselae）、文森巴尔通体伯格霍夫亚种（Bar. vinsonii subsp. berkhoffii）、罗莎利马巴尔通体（Bar. rochalimae）等多种巴尔通体[2]。伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）感染可引起莱姆病, 犬感染后的临床表现包括发热、跛行、多发性关节炎和肾小球肾炎[3]。无形体可引起家畜、野生动物和人类粒细胞无形体病, 近年来在犬中感染率呈上升趋势, 我国安徽省流浪犬中感染率高达38.3%, 并且存在多种无形体混合感染情况, 其中嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）感染最为常见[4]。致病性钩端螺旋体（Leptospira interrogans）感染后可引起钩端螺旋体（钩体）病, 犬对钩体普遍易感, 犬钩体病在世界范围内均有报道, 临床表现从慢性无症状感染到急性重症[5]。巴贝虫（Babesia）可寄生在犬的红细胞内引起较严重的血液寄生虫病, 是引起犬血小板减少症和溶血性贫血的重要原因, 主要病原体有犬巴贝虫（Bab. canis）、吉氏巴贝虫（Bab. gibsoni）和韦氏巴贝虫（Bab. vitlli）, 在我国以犬巴贝虫和吉氏巴贝虫为主[6]。
本课题组前期研究中, 在山西省东南部地区的啮齿类动物中检出巴尔通体、伯氏疏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体、致病性钩体等人兽共患病病原菌, 人群存在一定的感染风险[7-8]。宠物犬相较于啮齿动物, 与人类有着更加密切的联系, 因此有必要在该地区的宠物犬中进行相关人兽共患病病原体的流行病学研究, 以降低人类罹患此类传染病的风险。
1 材料与方法 1.1 标本来源2021年1－6月, 在山西省长治市收集宠物犬抗凝血, -80 ℃保存, 并收集宠物犬种类、性别和犬龄等基本信息。
1.2 核酸提取按照TIANamp Micro DNA Kit[天根生化科技（北京）有限公司]的操作方法提取宠物犬血液DNA。
1.3 细菌性病原体检测采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）方法扩增巴尔通体、伯氏疏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体和钩体基因片段, 探针及引物[9]（表 1）由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室提供。PCR反应体系为20 μl, 包含10 μl HRqPCR Master Mix（上海辉睿生物科技有限公司）, 正、反向引物各0.8 μl（10 μmol/L）, 0.4 μl探针（10 μmol/L）, 5 μl dd H2O, 3 μl DNA模板。采用ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪（ABI, 美国）进行PCR扩增, 反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s, 40个循环。设立阴、阳性对照, 循环阈值（Ct） < 35判为阳性。
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采用普通PCR方法扩增巴贝虫基因片段, 引物为BabsppF1：GTTTCTGMCCCATCAGCTTGAC；BabsppR：CAAGACAAAAGTCTGCTTGAAAC[10]。PCR反应体系为20 μl, 包含10 μl 2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）（全式金生物技术有限公司）, 正、反向引物各0.8 μl（10 μmol/L）, 6.4 μl ddH2O, 2 μl DNA模板。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35个循环；72 ℃ 10 min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 将422~440 bp的PCR产物送至西安擎科生物技术有限公司进行测序。
1.5 核苷酸序列分析运行美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）上的基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool, BLAST）, 将巴贝虫核苷酸序列与GenBank中注册的巴贝虫物种序列进行同源性比对, 使用MEGA 7.0的邻接（neighbor-joining, NJ）方法, 选择Kimura 2-parameter model（k2）模型, 自展值（bootstrap）设为1 000, 构建系统发育树。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件对数据进行录入并分析, 定性资料采用n（%）表示, 率的比较采用Fisher确切概率法, 检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 宠物犬基本信息本次调查共采集到98只宠物犬的全血标本, 涉及泰迪犬（24只）、金毛犬（16只）、比熊犬（13只）、中华田园犬（10只）、贵宾犬（4只）等17种犬类。犬龄最小半岁, 最大14岁, 平均4.59岁。80只犬接种过常规疫苗（包括狂犬疫苗和预防犬瘟热、细小病毒病、传染性肝炎和副流感的四联疫苗）, 疫苗接种率81.63%。经性别鉴定, 雌性58只, 雄性40只, 雌雄比为1.45∶1。
2.2 不同病原体检出情况对血液标本进行5种病原体检测, 除钩体未检出外, 其余4种病原体均有检出, 其中嗜吞噬细胞无形体检出阳性7份, 阳性率为7.14%（7/98）, 巴尔通体阳性4份, 阳性率为4.08%（4/98）, 伯氏疏螺旋体阳性3份, 阳性率为3.06%（3/98）, 巴贝虫阳性3份, 阳性率为3.06%（3/98）。有2只宠物犬存在共感染现象, 具体为巴尔通体和嗜吞噬细胞无形体共感染1只, 伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无形体共感染1只（表 2）。不同性别、犬龄以及是否接种疫苗的犬只中, 各病原体检出率比较差异均无统计学意义（均P > 0.05）。
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本研究中, 通过测序获得了2条420 bp的巴贝虫18S rRNA基因核苷酸序列（OR492309、OR492310）, 经过BLAST比对, 这2条序列与吉氏巴贝虫（Babesia gibsoni）（MN134517.1）的18S rRNA基因序列一致性均为99.76%。从GenBank下载不同地区、不同宿主、不同型别吉氏巴贝虫、莫氏巴贝虫（Bab. motasi）、驽巴贝虫（Bab. caballi）、犬巴贝虫（Bab. canis）、粗糙巴贝虫（Bab. crassa）、大巴贝虫（Bab. major）、东方巴贝虫（Bab. orientalis）、伏氏巴贝虫（Bab. vogeli）、分歧巴贝虫（Bab. divergens）、卡普里巴贝虫（Bab. capreoli）、奥氏巴贝虫（Bab. odocoilei）、猎户巴贝虫（Bab. venatorum）、双芽巴贝虫（Bab. bigemina）、邓肯巴贝虫（Bab. duncani）、Bab. vesperuginis、罗氏巴贝虫（Bab. rodhaini）和田鼠巴贝虫（Bab. microti）的18S rRNA基因序列, 以疟原虫18S rRNA序列为外群, 构建巴贝虫系统发育树。结果显示, 本研究中得到的2条序列与吉氏巴贝虫聚为一簇, 但这2条序列在吉氏巴贝虫内又聚为一个独立的分支, 与其他地区已报道的吉氏巴贝虫序列存在一定差异。见图 1。
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| 图 1 基于18S rRNA基因的山西省长治市宠物犬携带巴贝虫系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree constructed for Babesia carried by pet dogs in Changzhi, Shanxi Province based on 18S rRNA gene |
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随着我国经济快速发展, 人民生活水平不断提高, 宠物产业呈现迅速发展。在养宠物的人群中, 养犬人数高达50%以上[11], 宠物犬易感的病原体种类繁多, 可携带细菌、病毒、真菌、寄生虫等多种病原体, 因此了解和控制宠物犬中病原体感染在人兽共患病的防控中具有重要的意义。
本课题组前期对山西省东南部地区的啮齿动物进行了人兽共患病病原体的初步研究, 在此基础上, 在长治市宠物犬中开展巴尔通体等5类病原体的检测, 共检出巴尔通体、伯氏疏螺旋体、嗜吞噬细胞无形体和巴贝虫4类病原体。本研究中, 宠物犬的巴尔通体感染率为4.08%, 略高于山东省报告的2.82%[12]；伯氏疏螺旋体感染率为3.06%, 略高于云南省的2.00%[13], 但低于吉林省的15.22%[14]；嗜吞噬细胞无形体感染率为7.14%, 略高于云南省的5.71%[15]；巴贝虫感染率为3.06%, 低于湖南省的10.1%[16]；检获的巴贝虫经18S rRNA基因序列分析显示均为吉氏巴贝虫。不同地区宠物犬的病原感染率有差异, 符合自然疫源性疾病的特点。
采集的98份宠物犬血液标本中, 包含泰迪犬、金毛犬、比熊犬、中华田园犬和贵宾犬等17种犬类, 由于犬种多, 有些犬种数量较少, 未能进行不同犬类之间病原体检出率的比较, 不同犬种间各病原体的感染率是否存在差异有待进一步扩大样本量进行研究, 但在不同性别、犬龄以及是否接种疫苗的犬只中, 发现各病原体检出率差异均无统计学意义。另外, 本研究还发现犬病原体的共感染现象, 有1只宠物犬存在巴尔通体和嗜吞噬细胞无形体共感染, 1只宠物犬存在伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无形体共感染, 提示宠物犬病原体感染的复杂性。巴尔通体、嗜吞噬细胞无形体、伯氏疏螺旋体和巴贝虫均可通过蜱媒进行传播, 蜱易在1种或多种宿主动物中获得不同的病原体, 宠物犬被蜱叮咬后进而引起共感染[17]。宠物犬的共感染可能会导致病原体的传播概率增加, 并给宠物犬的临床治疗带来困难。山西省长治地区蜱分布广泛[18], 宠物犬经蜱叮咬感染病原体风险较高, 提示宠物犬主人在蜱孳生季节, 应注意防范犬进出草坪和丛林感染蜱虫, 以降低犬感染蜱传病原体的概率。
本次研究主要收集了长治市区的宠物犬样本, 今后将扩大采样, 将各县（区）的宠物医院也纳入采样范围, 全面了解长治市宠物犬中病原体的流行情况；本研究未收集宠物犬临床症状的相关信息, 后续研究中将弥补这一缺憾, 有助于掌握不同病原体及其不同型别与犬临床症状的相关性；本研究仅采集血液标本做检测, 可能导致非血液寄生的病原体如伯氏疏螺旋体和钩体检出率较低, 将在今后的研究中补充完善。
总之, 通过本研究初步了解山西省长治市人兽共患病病原菌及巴贝虫在宠物犬中的流行情况, 发现嗜吞噬细胞无形体、巴尔通体、伯氏疏螺旋体和巴贝虫在当地宠物犬中流行较为广泛, 对于人群和其他动物具有一定的致病风险, 应对宠物犬加强管理和防范。
利益冲突 无
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