立克次体是一类严格细胞内寄生、体积小、革兰阴性的原核细胞型微生物^[1]。立克次体主要分为原始群、斑点热群、斑疹伤寒群和过渡群4个群^[2]。斑点热群立克次体（spotted fever group Rickettsia，SFGR）通过被感染立克次体的蜱、螨叮咬传播^[3]，目前已有21种SFGR在我国被发现，其中具有致病性的立克次体已增加至8种，分别是黑龙江立克次体（Rickettsia heilongjiangensis）、拉欧蒂立克次体（R. raoultii）、新塔拉塞维奇立克次体（Candidatus Rickettsia tarasevichiae）、西伯利亚立克次体BJ-90亚种（R. sibirica sp BJ-90）、R. sp. XY99、日本立克次体（R. japonica）、蒙纳森斯立克次体（R. monacensis）、信阳立克次体（Candidatus Rickettsia xinyangensis）^[4]。随着我国传染病监测的不断加强，以及生物学技术的不断进步，新的立克次体类病原体将不断被发现。斑点热群的另1种——立氏立克次体（R. rickettsia）目前在我国尚未发现，其经蜱叮咬传播引起立氏立克次体病，该病是一种急性地方性传染病，也称落基山斑点热、蜱传斑疹伤寒，临床特征有发热、头痛和皮疹^[5]，重型患者可危及生命^[6]。立氏立克次体已成为我国高入侵风险等级的主要病原体之一^[7]。

早在1899年就有立克次体病的报道，直到1906年美国才报道首例分离于人体的斑点热立克次体^[8]。此后，在非洲、欧洲、美洲均有蜱传立克次体病的报道。中国研究立克次体病较晚，1958年我国从患者体内分离出莫氏立克次体菌株。一项调查显示，1990年我国立克次体人群感染率为2.2%^[9]。随着调查的深入，我国陆续发现了无形体（Anaplasma）、贝纳柯克斯体（Coxiella burneti）^[10]、日本立克次体、扇头蜱立克次体（R. rhipicephalus）、马赛立克次体（R. massilliae）和埃立克体（Ehrlichia）等^[11]。

2017年5月，六安市疾病预防控制中心（疾控中心）接到辖区霍山县疾控中心报告，该县2家医疗卫生机构1周内接诊多例发热伴皮疹患者，发病原因不明。霍山县是一个山区县和库区县，森林覆盖率达75.1%。患者的主要临床表现为发热、乏力、全身酸痛、畏寒、皮疹和头痛等症状，部分患者有血小板和白细胞减少。患者在发病前都曾从事采茶活动，多数患者有蜱虫、蚂蟥等叮咬史。为了进一步弄清引起该病的原因，市疾控中心与霍山、金寨和舒城县多家医疗卫生机构于2017年5月－2021年11月，收集患者急性期和恢复期血样，进行相关病原体的检测和排除。由于患者进行强力霉素治疗后，症状很快消失，病人逐渐恢复，结合其临床表现考虑立克次体感染。现将结果报告如下。

2017年5月－2021年11月在六安市辖区内收集发热伴皮疹患者急性期（发病1周内）、恢复期（发病后3~4周内）的血清和对照人群（年龄、性别相近，同一村庄，1年内无蜱叮咬史和无相关症状）的血清。分别取3 ml外周静脉血及时分离血清，分离后血清存放-20 ℃冰箱备用。所有样本采集均获知情同意。

使用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）检测血清中不同病原体的IgG水平，立氏立克次体、无形体、伯氏疏螺旋体、东方体、埃立克体、斑疹伤寒立克次体试剂盒均购于美国Fuller公司。检测过程均按照试剂盒提供的使用说明书进行。

选取10份急性期和恢复期血液样本中特异性IgG滴度升高4倍以上的急性期血液，由中国军事医学科学院首先采用QIAGEN DNA试剂盒，按照试剂盒说明书提取DNA，采用巢式PCR分别对样本进行ompA、gltA和17kDa基因扩增，扩增引物见表 1^{[1, 3, 12]}。第1轮PCR反应体系为：4 μl核酸提取物，12.5 μl酶混合物，正、反向引物各0.5 μl，7.5 μl无核酸水；第2轮0.25 μl第1轮扩增产物，12.5 μl酶混合物，正、反向引物各0.5 μl，11.5 μl无核酸水。ompA、gltA、17kDa扩增反应条件见表 2，扩增产物送北京天一辉远生物科技有限公司在illumina Miseq进行二代测序。

表 1 用于立克次体ompA、gltA和17kDa扩增的引物序列 Table 1 Primer sequences for rickettsial ompA, gltA, and 17kDa amplification

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表 2 立克次体ompA、gltA和17kDa基因扩增反应程序 Table 2 Amplification reaction procedure for rickettsial ompA, gltA, and 17kDa

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采用MEGA Ⅹ软件，与PubMed公布的基因序列进行分析比较。采用最大似然法（maximum likelihood，ML）与相关序列构建进化树，并用PhyML 3.0软件进行系统进化分析，明确六安市引起发热伴皮疹的病原体及其分子流行病学特征。

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，率的比较采用χ²检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2017－2021年，共调查139例发热伴皮疹患者，其中霍山县69例，金寨县45例，舒城县11例，金安区7例，裕安区6例，安庆市岳西县1例。77例为60岁以上的老年人，占患者总数的55.40%，其次是20~60岁人群，占患者的43.88%，而20岁以下患者仅1例。发热伴皮疹139例患者中女性94例，占67.63%，男女性别比为1∶2.09。调查21例患者的职业，其中18例为务农，占调查总数的85.71%。见表 3。

表 3 安徽省六安市发热伴皮疹患者的基本情况 Table 3 Basic information of cases of fever with rashes in Lu'an, Anhui Province, China

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共获得139例患者中61例的临床症状，主要临床表现为发热、乏力、食欲减退、头痛、全身酸痛、皮疹和焦痂（表 4），还有少部分出现白细胞减少。61例患者中的31例获得暴露情况，其中有8例种地，占比为25.81%，29例从事过采茶工作，占比为93.55%。。

表 4 安徽省六安市发热伴皮疹患者的流行病学和临床特征 Table 4 Epidemiological and clinical characteristics of cases of fever with rashes in Lu'an, Anhui Province, China

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共获得139例患者急性期血样132人份，恢复期37人份，对照组21人份，计190人份，其中有30例发热伴皮疹患者收集了急性期和恢复期双份血样。使用IFA法对血清中的6种致病病原微生物进行检测，其中无形体、伯氏疏螺旋体、斑疹伤寒立克次体的抗体检测结果均为阴性。双份血清中立氏立克次体IgG抗体均为阳性（患者发病1周内采集的第1份血清和恢复后2周内采集的第2份血清，按照试剂盒说明书进行检测和判定，恢复期血清中抗体滴度水平较之急性期有4倍升高，判定为结果阳性）。见图 1。

A. 阴性对照；B. 阳性对照；C. 加入样本稀释液的空白对照；D. 急性期血清稀释倍数1∶64（+）；E. 恢复期血清稀释倍数1∶512（+）；F. 恢复期血清稀释倍数1∶8192（+）。 图 1 安徽省六安市发热伴皮疹患者血清中立氏立克次体IgG间接免疫荧光法检测结果 Figure 1 Results of serum IgG antibody of cases of fever with rashes in Lu'an, Anhui Province, China to Rickettsia rickettsii by indirect immunofluorescence assay

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本次研究采集的190份血液样本，全部进行了立氏立克次体IgG抗体的检测，其中34份急性期血液同时进行了埃立克体、伯氏疏螺旋体、东方体、无形体和斑疹伤寒立克次体IgG抗体检测，结果伯氏疏螺旋体、无形体和斑疹伤寒立克次体IgG抗体检测均为阴性。

立氏立克次体IgG抗体检测结果显示，急性期、对照组和恢复期的阳性率分别为51.52%（68/132）、90.48%（19/21）和89.19%（33/37），差异有统计学意义（χ²=25.200，P < 0.001）。34份急性期血液样本立氏立克次体、埃立克体和东方体IgG抗体阳性率分别为67.65%（23/34）、26.47%（9/34）和38.24%（13/34）（表 5），不同病原体阳性率差异有统计学意义（χ²=12.407，P=0.002），其中3种抗体均阳性的8份，2种抗体阳性的4份，1种抗体阳性的2份，3种抗体均阴性的9份。见图 2。

表 5 安徽省六安市发热伴皮疹患者立克次体IgG抗体间接免疫荧光法检测结果 Table 5 Indirect immunofluorescence assay results of rickettsial IgG antibody of cases of fever with rashes in Lu'an, Anhui Province, China

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注：红色点表示该抗体阳性，灰色点表示该抗体阴性。 图 2 安徽省六安市发热伴皮疹患者34份急性期血液样本3种立克次体IgG抗体检测结果 Figure 2 Results of IgG antibodies of cases in 34 acute-stage blood samples of cases of fever with rashes in Lu'an, Anhui Province, China to three rickettsial species

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血清样本经过PCR扩增及电泳，ompA序列仅1份标本出现目标长度片段，经测序，并经基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对，同源性为90.3%~99.4%，证实为斑点热立克次体。gltA及17kDa序列无阳性条带出现。从GenBank上下载国内外公布的斑点热立克次体ompA序列，其中国内50条，国外18条，涵盖16个亚型和22个未定型，用MEGA Ⅹ构建邻接法进化树，结果见图 3。

注：▲本研究所获得的序列。 图 3 基于ompA序列的安徽省六安市发热伴皮疹患者感染立克次体进化树 Figure 3 Rickettsial phylogenetic analysis of fever with rash infection based on rickettsial ompA sequence in Lu'an, Anhui Province, China

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六安市下辖的霍山、金寨和舒城3县地处大别山北麓，主要为山区丘陵地貌，地势西南高峻，东北低平，由南向北呈阶梯状分布。地理环境决定了本地有非常丰富的动植物资源，其生态环境适合病媒生物的孳生和生长，2015年该地被确定为发热伴血小板减少综合征疫源地。

本研究共调查139例发热伴皮疹患者，主要人群为老年人，职业主要为农民。霍山县患者主要集中在4－5月采茶季，患者均有采茶或上山耕地的暴露史，80%以上的患者出现皮疹、乏力、发热、C反应蛋白升高、全身酸痛和食欲减退。部分患者出现头痛和中性粒细胞升高，极少患者出现腹痛、腹泻症状。重症患者表现为全身严重过敏反应、心肌炎、出血、心力衰竭、呼吸衰竭、脓毒性休克等致命并发症^[8]。SFGR感染的临床症状主要有发热、皮疹和头痛，但一项本研究邻近地区的立克次体感染研究中，5名患者均未出现皮疹或焦痂，仅1例出现头痛；因此该研究认为，由于SFGR感染的临床症状不典型，需通过实验室检测方法辅助加以诊断^[13]。本研究采集发热伴皮疹病例的急性期血清样本进行立氏立克次体、东方体和埃立克体IgG检测，结果显示3种病原体均检出阳性。对采集有急性期和恢复期双份血清的30例病例进行立氏立克次体IgG滴度检测发现，恢复期滴度较急性期升高4倍以上有28例。立氏立克次体是落基山斑点热的病原体，为SFGR中毒力最强的一个种。立氏立克次体进入机体，在血管内皮细胞中生长繁殖导致血管损伤，患者可因主要器官衰竭而死亡^[14]。由于检测方法和试剂的局限性，SFGR存在一定的交叉反应，不能通过IFA检测结果来判定感染立克次体的具体种类，因此有必要对病原体核酸序列进一步分析，确立病原体分型，为后续流行病学调查和治疗奠定基础。

我国致病性SFGR目前报道的主要有8种，其引起的非特异性临床表现是诊断的一个重大挑战，患者均有高热、头痛、全身不适等非特异性临床症状，并且随种型特性、感染途径、数量以及人体敏感性的不同而呈现轻重不等的临床表现，极易误诊为上呼吸道感染或不明原因发热^[15]。大多数临床医生不熟悉疾病在早期表现为非特异性的蜱传疾病症状，应予以关注^[16]。随着现代分子生物学诊断技术的发展、应用，如三代测序技术及化学发光基因芯片等的应用，将有助于新病原体的发现，提高人类感染的实验室诊断水平^[17-19]。

根据立克次体遗传学分类指南，斑点热群成员应具有ompA基因或至少满足4项rrs、gltA、ompB和基因D标准中的2项。该群任何成员的rrs、gltA、ompB和基因D的成对核苷酸序列同源性分别为≥98.8%、≥92.7%、≥85.8%和≥82.2%^[20]。gltA基因编码柠檬酸合成酶，该酶的序列具有种属特异性，进化距离较远的立克次体之间有明显差异^[21]。ompA是外膜蛋白基因，由于5′端具有高度特异性，因此可作为SFGR的种属鉴定金标准^[22]。本研究对采集的发热伴皮疹病例的急性期血液样本进行立克次体ompA、gltA和17kDa^[23]巢式PCR扩增。结果只在Lu’an007样本中测出ompA目标片段，经二代测序得到序列，BLAST比对发现与SFGR的序列同源性达90%以上，可见该病原体确定为SFGR。Jin等^[24]2021－2022年从六安市金寨县880只蜱中分离出251株立克次体，经鉴定分属于立克次体、埃立克体和无形体3属。从建立的进化树可见，本次测得的ompA的序列与我国云南省发现的SFGR Cadidatus R. jingxinensis^[25]同源性较近，在进化树上二者形成一个单枝(monoclade)，可能属于同一个种，但还需要进一步和其他基因如rrs和gltA检测结果共同确定。而与我国黑龙江省发现的黑龙江立克次体^[26-27]同源性较远。遗憾的是，可能由于本次检测样本采集时间的问题或其他原因，在gltA和17kDa均未扩增出目标片段，未得到相应序列，该立克次体的确切分类需进一步深入研究。

利益冲突  无