蜱是一类专性吸血的体外寄生虫，分布范围广，宿主多样，在多种生境中均能生存。蜱类不仅直接叮咬宿主，还传播病原体，危害畜牧业生产和人类健康^[1]。蜱类生活史一般分为卵、幼蜱、若蜱和成蜱阶段，除卵外其他发育阶段均需吸食宿主血液完成发育^[2]。蜱类种群动态和多种生物因素相关，如人类活动^[3]、宿主分布和密度^[4-5]等。此外，蜱类种群动态还受到其所处生境的环境因素，如植被和气候的影响^[6-7]。目前，常用化学、物理和生物防治等手段进行蜱类防治^[8]。其中，预测蜱类种群数量的动态有助于采取有针对性的措施进行蜱及相关疾病的预防和控制。

对卵生动物而言，胚胎发育指自卵产出至孵化的过程，是发育中的重要环节。其胚胎发育没有外源营养供应，需要母体通过卵子发生将营养物质分泌到卵母细胞中。蜱类胚胎发育受到温度等环境因素的调控^[9-11]，并与幼蜱数量直接相关。

长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）属硬蜱科（Ixodidae）、血蜱属（Haemaphysalis），在东亚地区广泛分布，后扩展至大洋洲和美国^[12]。鉴于该蜱广泛的地理分布和传播病原体的多样性，对其生物学和生态学的研究历来受到重视。长角血蜱具有两性生殖和孤雌生殖2种生殖方式，雌成蜱饱血后开始产卵，产卵量与吸血量呈正相关关系^[13]。目前，长角血蜱胚胎发育过程尚不清楚。本研究在实验室条件下应用胚胎固定和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色技术^[14]观察和记述了2种生殖方式长角血蜱胚胎的发育过程，为该种群数量动态预测提供依据。

采用拖旗法在野外植被上采集游离长角血蜱，两性生殖种群采集地点为河北省小五台山国家级自然保护区（39°97′N，115°4′E），孤雌生殖种群采集地点为四川省苍溪县（31°37′N，105°43′E）。将蜱带回实验室后置于人工气候培养箱[温度为（26±1）℃，相对湿度为（75±5）%，光周期（L∶D）为16 h∶8 h]（Percival Scientific，Inc.，Lowa USA）中饲养。蜱吸血阶段用家兔（Oryctolagus cuniculus）为宿主供血，建立长角血蜱实验室种群。供试长角血蜱已在实验室饲养10代以上。

雌蜱饱血后单独置于培养皿中产卵。同一天产的卵（胚胎）集中放置于1个离心管中，离心管中放入湿润的滤纸，并用棉塞和纱布堵住管口，标明日期、两性或孤雌生殖类型，放入人工气候培养箱（参数设置同饲养条件）中孵化。重复以上操作，每日取样，共收集1~24 d的胚胎。定期对离心管进行喷水处理，使胚胎正常孵化。每日记录胚胎孵化情况，记录胚胎数≥2 000。

以上述收集的胚胎为材料（因胚胎样本间黏连，每日观察样本设置为100 mg），参照Santos等^[14]的方法对胚胎进行脱壳和固定，在显微镜下确认胚胎成功脱壳后，对脱壳胚胎进行固定和DAPI染色。

在避光条件下，将装有胚胎的凹孔载玻片放在荧光显微镜下观察，在视野下找到合适的胚胎，并移动凹孔载玻片调整胚胎朝向，使每个胚胎的排列方向一致，分别拍照记录腹面、背面和侧面体位胚胎的变化。每日每体位至少拍摄记录5张照片，保证结果的准确性。

两个种群间的发育历期差异比较采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

在实验室条件下，孤雌生殖和两性生殖的长角血蜱胚胎发育历期分别为（24.6±1.7）d和（22.5±3.5）d。孤雌生殖种群胚胎发育历期显著长于两性生殖种群，其差异有统计学意义（t=2.699，P=0.010）。

长角血蜱初产胚胎颜色大部分为棕色、浅棕色或褐色，呈半透明状，具有黏着性，在培养皿中呈团状堆积（图 1A）。胚胎的大小为0.5~1.0 mm，呈椭圆形或者圆形（图 1B）。随着发育，胚胎逐渐变为乳白色。胚胎发育后期，可见完整的体壁和附肢结构（图 1C）。

图 1 饱血雌蜱产卵状态（A）、发育1 d（B）和发育21 d胚胎（C） Figure 1 Engorged female tick laying eggs (A) and embryonic development on day 1 (B) and day 21 (C)

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两种生殖方式长角血蜱的胚胎发育过程无明显差异（图 2、3）。其胚胎发育过程均为：发育1~4 d，无法区分出胚胎背面、侧面和腹面。发育1 d，初期胚胎能够识别到细胞核；发育4 d，细胞数量显著增加，胚盘出现；发育6 d，胚胎体节和腹侧沟出现；发育7 d，能够明显区分出头部、胸部和生长区，3对附肢（1L~3L）原基清晰，第4附肢（4L）明显短于前3对附肢；发育12 d，腹侧沟关闭，第4附肢开始退化，另外3对附肢变大，胚胎收缩到前腹区，背侧开始闭合；发育16 d，背侧闭合继续发生，头部的螯肢位置发生改变；发育20 d，背侧闭合完成，胚胎开始孵化。见图 2、3。

注：Cm卵丘细胞（cumulus cell）；VF腹侧沟（ventral furrow）；Ch螯肢（chelicera）；P触肢（pedipalp）；L1~L4第1至第4附肢。 图 2 长角血蜱两性生殖种群胚胎发育过程 Figure 2 The embryonic development process of bisexual Haemaphysalis longicornis

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注：Cm卵丘细胞（cumulus cell）；VF腹侧沟（ventral furrow）；Ch螯肢（chelicera）；P触肢（pedipalp）；L1~L4第1至第4附肢。 图 3 长角血蜱孤雌生殖种群胚胎发育过程 Figure 3 The embryonic development process of parthenogenetic Haemaphysalis longicornis

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本实验观察发现，孤雌生殖种群长角血蜱胚胎发育历期显著长于两性种群，与Chen等^[13]的研究结果一致。2种生殖方式胚胎在第24天时基本均能孵化，短于Chen等^[13]研究中胚胎孵化时间[实验温度（25±1）℃，孤雌种群：32~36 d，两性种群：25~33 d]，其原因可能是由于本研究中胚胎发育的实验温度较高，使得胚胎发育时间相对缩短。在野外环境中，长角血蜱胚胎发育时间为（41.5±5.5）d^[15]，也显著长于本研究中的胚胎发育时间。除胚胎发育时间外，长角血蜱的产卵前期、产卵期、蜕皮时间等都随着温度的降低而显著延长^[10]。这些结果进一步证实了温度是影响蜱生长发育的关键因素。从长角血蜱胚胎发育的机制来看，胚胎发育过程中组织蛋白酶B和D，以及酸性磷酸酶的活性受到温度调控，而这些酶的活性对于胚胎营养供给至关重要^[16-17]。雌蜱饱血后开始产卵，胚胎发育成功率决定着蜱类种群数量。因此，在防治工作中，不可忽视温度对蜱类种群数量的影响，应根据气象条件采取适宜的防治措施。此外，在全球气候变化的背景下，蜱类的发育历期可能变短，也需要我们及时调整防控策略^[18]。

本实验采用胚胎固定和DAPI染色技术对长角血蜱胚胎发育过程进行了可视化分析，明确了关键的发育阶段。该技术较早应用于微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）胚胎发育研究^[14]，并在安氏革蜱（Dermacentor andersoni）中也得到成功应用^[19]。因此，这种技术也可以用于其他蜱种的胚胎发育研究。尽管为不同属的蜱类物种，长角血蜱、微小扇头蜱和安氏革蜱具有相似的胚胎发育过程，在发育的20 d里，胚胎都经历了细胞增殖、胚盘形成、体节和腹侧沟形成、螯肢、触肢和附肢形成、第4附肢退化、背侧闭合等过程，不同阶段发育时间基本一致^{[14, 19]}。孤雌生殖种群长角血蜱胚胎发育历期虽显著长于两性种群，但两者胚胎发育过程并无显著差异。据此可以推测，硬蜱科胚胎发育过程在进化上较为保守，他们是否存在一种普适性的调控机制，这一点需要在更多蜱类物种中进行研究后证实。

在胚胎发育的第7天，能够观察到4对附肢的出现，且前3对附肢原基清晰。因此，胚胎发育早期是长角血蜱足形成的关键阶段。我们在长角血蜱成蜱种群饲喂过程中发现多种类型的缺足现象，可能是由于近交衰退、机械损伤或环境胁迫的结果。虽暂未明确缺足对于长角血蜱搜寻宿主、叮咬吸血的影响，但今后可以收集早期发育胚胎，进一步去探究缺足的生理和分子机制。

蜱类胚胎发育涉及多种生理和代谢过程，如卵黄蛋白降解、糖代谢等，决定着胚胎结构和组织形成^{[16, 20-21]}。Seixas等^[22]认为微小扇头蜱胚胎发育过程中一些关键蛋白质，如卵黄天冬氨酸内肽酶和半胱氨酸内肽酶（egg-yolk aspartic endopeptidase and cysteine endopeptidase，VTDCE）和谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST），具有开发为蜱类疫苗的潜力。因此，今后如开发蜱类疫苗可关注长角血蜱胚胎发育过程的关键蛋白质。此外，在胚胎发育的关键阶段进行遗传操控^[23]，也有助于揭示蜱类发育机制，为探索新型防治方法提供依据。

利益冲突  无