中国媒介生物学及控制杂志  2023, Vol. 34 Issue (5): 607-611
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汉坦病毒（Hantavirus）是一类有包膜、分节段的RNA病毒，属汉坦病毒科（Hantaviridae）的正汉坦病毒属（Orthohantavirus），呈球形，ϕ80~120 nm。汉坦病毒基因组包含3个负义单链RNA，基因由小到大分别为S、M和L。其中S片段约1.7 kb，编码核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）；M片段长约3.6 kb，编码包膜糖蛋白；L片段约6.5 kb，编码RNA依赖的RNA聚合酶，即L蛋白[1-3]。人类感染汉坦病毒后主要引起汉坦病毒心肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）和肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS），HFRS的临床表现为出血、低血压、少尿或多尿等肾功能损害，病死率约为1%，研究表明，HFRS主要流行于亚欧大陆，而我国是目前报道HFRS最多的国家[4]。
2020年浙江省舟山市连续出现多例HFRS病例[5]，对舟山地区公共卫生造成一定的威胁。为明确病毒基因特征，本研究对宿主动物开展汉坦病毒核酸检测及全基因序列测定及分析，为防疫工作提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 标本来源收集2021年舟山群岛小型兽类肺标本194份，其中鼠类标本166份，臭鼩（Suncus murinus）28份，经实时荧光定量PCR法检测，汉坦病毒阳性13份，均来自于褐家鼠（Rattus norvegicus），均为首尔型汉坦病毒（SEOV），选取其中循环阈值（cycle threshold，Ct） < 30的样品进行巢式PCR。
1.2 主要试剂与仪器一步法反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒（RR055A）、PCR试剂盒（RR902A）均购自宝生物工程（大连）有限公司。普通PCR仪使用梯度基因扩增仪T-one 96G（德国耶拿分析仪器股份公司）；凝胶成像分析仪Essential V6（英国UVITEC公司）；电泳仪EPS300（上海天能科技有限公司）。
1.3 样本处理与核酸提取无菌采集鼠肺标本用组织研磨器研磨1 min制作组织匀浆；将匀浆液4 ℃、8 000×g离心1 min，收集上清液分装至1.5 ml离心管中；采用RNeasy Mini Kiti试剂盒（德国QIAGEN公司），按说明书操作提取病毒核酸。
1.4 巢式PCR引物的设计与合成根据前期工作获得的M片段序列[5]在GenBank数据库中分别找到L、M、S片段同源性最高的序列KP645196、KY639618、KY639699作为参考序列设计引物，送至宁波康贝生化有限公司合成，引物序列见表 1。
对实时荧光定量PCR汉坦病毒核酸阳性的标本采用巢式PCR进行扩增，第2轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳50 min后在成像仪上确认特异性条带达到测序要求后，送上海派森诺基因科技有限公司进行测序。
1.6 序列拼接及系统发育树构建采用DNAStar的子软件SeqMan 7.1.0.44进行序列拼接，采用MEGA 7.0软件进行多序列比对和系统发育树的构建，选用贝叶斯信息量（BIC）值最小的Tamura 3-parameter模型，绘制方法采用邻接（neighbor-joining，NJ）法，参考序列均来自GenBank数据库。
1.7 基因亚型分析M片段基因变异情况可作为汉坦病毒分型的依据，SEOV可分为4~6个亚型[6-7]，本研究将AF288652、AF035833、AB027086、AB027087、AF190119、DQ159911、S47716、S72343、FJ811839和AF145977作为参考序列，与本研究中的ZJDS55、ZJDSD3、ZJDSE2三株病毒株的M段基因构建系统发育树。
2 结果 2.1 巢式PCR及序列拼接2轮扩增后经琼脂糖凝胶电泳确认获得有效条带共36条，3株完整的汉坦病毒样本ZJDS55、ZJDSD3、ZJDSE2达到测序要求。序列拼接后获得3株汉坦病毒全基因组序列，上传至美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库，登录号为OQ466600~OQ466608。见表 2。
经测序获得的ZJDS55、ZJDSD3、ZJDSE2的全基因组序列分别有11 682、11 494、11 508个核苷酸。这3株汉坦病毒L、M、S基因长度见表 1，其核苷酸同源性分别为97.30%~97.90%、96.80%~97.10%和96.30%~98.20%。采用MEGA 7.0软件对核苷酸进行比对分析，以NJ法构建系统发生树。L、M和S 3个基因的核苷酸系统发生树分别见图 1~3。3株汉坦病毒均属于SEOV，L基因与MT711943.1同源性为97.00%~97.80%；M基因与KM233661.1、MT711943.1等同源性为97.00%~98.98%；S基因与GU592951.1、AF288299、KY639683等毒株同源性达99.00%。3株汉坦病毒与SEOV疫苗株Z37的AF285266.1、AF190119.1、AF285266.1基因核苷酸同源性分别为97.29%~97.63%、96.70%~97.74%和97.61%~97.97%；与SEOV疫苗株Z37的氨基酸同源性L、M、S基因分别为98.52%~99.53%、93.74%~99.59%和99.30%；与疫苗株Z37的2个糖蛋白免疫表位435GQKKTILTKTLVIGQ451、880PFSCPEFGQFRKKC894氨基酸序列一致，与4个核蛋白免疫表位72GKNIGQDRDPTGVEPGDHLKERSALSYGNTLDLNSLDID110、165YEDVNGIRKP174、251PIAGSLSGNPVNRD264、338MRNTIMASK346均一致。
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| 注：●为本次检测到的病毒序列；SEOV 首尔型汉坦病毒；HTNV 汉滩型汉坦病毒。 图 1 汉坦病毒L基因核苷酸系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree of L gene nucleotide sequence of Hantavirus |
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| 注：●为本次检测到的病毒序列；SEOV 首尔型汉坦病毒；HTNV 汉滩型汉坦病毒。 图 2 汉坦病毒M基因核苷酸系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of M gene nucleotide sequence of Hantavirus |
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| 注：●为本次检测到的病毒序列；SEOV 首尔型汉坦病毒；HTNV 汉滩型汉坦病毒。 图 3 汉坦病毒S基因核苷酸系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree of S gene nucleotide sequence of Hantavirus |
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本研究ZJDS55、ZJDSD3、ZJDSE2 3株病毒株的M段基因与参考基因构建系统发育树，3株病毒株与Z37、ZT10等为同一进化分支，均为S3亚型，见图 2。
3 讨论随着社会的快速发展，浙江省舟山群岛工业园的建设逐年增加，其地理地貌发生了巨大变化[8]，而研究表明HFRS的发病与生态环境、鼠类分布等因素密切相关[9]。浙江省舟山群岛近30年未有HFRS病例报告，2020年在舟山市连续出现多例HFRS病例，根据目前的生态形势，HFRS的发病概率可能会提高。本研究为明确舟山群岛汉坦病毒基因型别、序列特征、变异情况，采用巢式PCR，自行设计引物序列，采用准确程度较高的Sanger测序法进行全基因组序列测定，巢式PCR通过2轮扩增，大幅度提高了反应灵敏度，在未进行病毒培养的条件下成功扩增出3个汉坦病毒全基因序列，结果表明，浙江省舟山群岛汉坦病毒为SEOV型S3亚型，其基因序列与浙江省瑞安市，辽宁和山东省等地同源性较高。
研究表明，早期建立有效的中和抗体反应可显著改善HFRS患者预后，经疫苗接种产生特异性抗体，在预防HFRS发生和流行可起到积极性作用[10-11]，我国目前使用的二价灭活疫苗为沙鼠肾细胞（MGKC）制备的HTNV型（Z10株）、SEOV型（Z37株）和地鼠肾细胞（GHKC）制备的HTNV型（84LFi株）和SEOV型（L99株）[12-13]。汉坦病毒的核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性，汉坦病毒包膜糖蛋白具有病毒毒力位点、细胞结合位点、中和抗原决定簇及特异性抗原位点等，是诱导免疫反应的主要因素[14]，ZJDS55、ZJDSD3、ZJDSE2与SEOV疫苗株Z37的2个糖蛋白免疫表位和4个核衣壳蛋白免疫表位氨基酸序列均一致[15]，因此，推断疫苗具有较好的保护作用，当地应加强疫苗接种，并持续开展病毒基因序列监测。
本研究采用的Sanger测序法具有准确性高的优点，但操作步骤繁琐，需多对引物和进行序列拼接，且全基因组的完整性仍有缺陷，影响数据的分析结果。因此，下一步的研究可采用二代测序或三代测序的方法，以获得更加完整、准确的全基因组数据。本研究成功测定了3株汉坦病毒的全基因组序列，明确了舟山群岛汉坦病毒基因型别。根据对流行株变异和系统发育的分析推断，目前我国使用的HFRS疫苗对该地区人群仍具有一定的保护力，对当地HFRS的防控提供了重要的科学资料。此外，本研究还积累了舟山群岛汉坦病毒的分子流行病学资料，为未来相关研究提供了参考依据。
利益冲突 无
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表1(Table 1)
