耶尔森菌（Yersinia）属于肠杆菌科，目前已被发现的种类有19种^[1]，具有致病性的有3种，分别是鼠疫耶尔森菌（Y. pestis，鼠疫菌）、小肠结肠炎耶尔森菌（Y. enterocolitia）和假结核耶尔森菌（Y. pseudotuberculosis）。甲类传染病鼠疫的病原体——鼠疫菌，在3种致病性耶尔森菌中毒力最强，鼠疫具有极强的传播性和极高的致死率；另2种毒性相对较弱的小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌均属于肠道致病菌及食源性致病菌^[2]，可引起各种肠道综合征。假结核耶尔森菌在遗传学上与鼠疫菌非常接近^[3]，但在生长条件、生化反应、致病性、传播途径等方面与小肠结肠炎耶尔森菌有许多相似之处^[4]。致病性耶尔森菌的感染均对人类的生产生活造成过严重的影响，因此从一些传染来源如食物、水、环境样本以及染疫动物的各种生物样本中及时发现它们十分重要，对于感染者来说从临床样本中快速检出3种病原菌对于诊断和后续针对性治疗也尤为重要。本文从免疫学、分子生物学、噬菌体检测等方面综述了3种致病性耶尔森菌的检测方法以及近年来检测技术的新进展。

1 抗原、抗体的免疫测定

利用抗原、抗体间的特异性识别反应进行检测的免疫学方法，不仅检测效率高、特异性强，而且在检测现场的适用性、检测样品的多样性、前处理的简便性等方面优势突出，弥补了传统培养法检测效率低等不足，为快速鉴定致病性耶尔森菌提供了较为理想的解决方案，目前一种基于鼠疫菌F1抗原检测的横向流动鼠疫快速诊断试验（rapid diagnostic tests，RDT）已经被开发、生产。这种方法在15 min内检测到浓度低至0.5 ng/ml的F1抗原，其敏感性和特异性均为100%，且细菌阳性检出率比细菌培养方法和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分别高了41.6%和31.0%^[5]。横向流动鼠疫RDT是一种特异、敏感和可靠的检测手段，可用于肺鼠疫和腺鼠疫的快速诊断^[6]。Hau等^[7]通过制备低钙反应V抗原（low-calcium response vantigen，LCRV）和F1两种抗原的单克隆抗体，建立了检测限为1~2 ng/ml的高分析灵敏度侧流免疫分析法（lateral flow immunoassay，LFI）。Simon等^[8]首次建立了纤维蛋白酶原激活因子（plasminogen activator，PLA）酶免疫测定（enzyme immunosorbent assay，EIA）方法和PLA免疫试纸条检测方法（PLA-dipstick）。这2种方法的优点在于，能够快速检测环境样本和媒介样本中的鼠疫菌，对于鼠疫自然疫源地的监测和流行病学调查具有重要价值，解决了F1抗原单独检测所带来的假阴性问题，也大大提高了横向流动鼠疫RDT的诊断能力^[9]。免疫磁性分离（immunomagnetic separation，IMS）技术使用表面覆盖小肠结肠炎耶尔森菌的特异性抗体的磁珠，可替代预富集步骤，将检测时间缩短至24 h。Estrada等^[10]应用此方法对污染食品中的小肠结肠炎耶尔森菌进行分类，后经巢式PCR方法检测，检测限可达10⁴~10⁷ CFU/ml，可区分致病性和非致病性菌株且无交叉反应。

耶尔森菌病在感染初期和中期，可以通过检测粪便或体液的小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌来诊断。然而在耶尔森菌病晚期，体液中细菌的检测是非常困难的，因此检测特异性抗体是诊断耶尔森菌感染的有效方法。有研究团队表达了可用于血清学测试的重组蛋白，即小肠结肠炎耶尔森菌特异性蛋白（MyfA）和假结核耶尔森菌的特异性蛋白（PsaA），用于开发一种能同时区分小肠结肠炎耶尔森菌感染和假结核耶尔森菌感染的新型ELISA^[11]。

免疫检测虽然已经实现了快速诊断，但这些方法只能作为一种间接的诊断依据，非目的抗原造成的交叉免疫反应所带来的假阳性和检测环境影响造成的假阴性问题仍需要进一步解决。

2 分子生物学检测方法

基于核酸检测的分子生物学技术近年来仍在不断发展中，除普通PCR以外，实时PCR、环介导等温扩增等多种快速、经济、精确的分子技术已被用于致病性耶尔森菌的检测。

2.1 普通PCR

PCR是目前基于核酸DNA的最常用的病原生物学检测方法，具有速度快、费用低、操作简便、特异性强、灵敏度高等优点，一般检测需要1~3 d。许多研究表明，单个基因无法确定地检测出致病性耶尔森菌，并且由于传代和储存过程中质粒可能丢失，因此同时仔细筛选并同时使用来自毒力质粒和染色体的目的基因是十分必要的。目前小肠结肠炎耶尔森菌主要围绕黏附侵袭位点基因（ail）、小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素A基因（ystA）、小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素B基因（ystB）、黏附素基因（yadA）和Yop调节子的转录活化因子基因（virF）这5个基因进行PCR检测^[11]。假结核耶尔森菌检测的主要毒力基因有位于染色体上的侵袭素基因（inv），位于假结核耶尔森菌毒力质粒（PYV），主要扩增yadA和virF基因^[12-13]。

普通PCR方法检测需要通过琼脂糖凝胶电泳来观察结果，延长了检测时间和耗费人力，检测灵敏度也不高，于是一些无需扩增后鉴定步骤的快速检测PCR技术逐渐兴起。

2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）

qPCR比传统的方法更快速、更灵敏，既减少了循环时间，又取消了PCR反应后人工检测程序。Lambertz等^[14]开发一种基于TaqMan探针的qPCR方法，5种食品样品接种并过夜富集后可检测出每10 g样本中55 CFU或更少水平的致病性小肠结肠炎耶尔森菌。Matero设计了4对引物和探针，其中2对用于扩增ypo2088和pla这2个鼠疫菌特异性靶基因，另1对扩增特异鉴定鼠疫菌和假结核菌的靶基因wzz，还有1对是作为内部扩增对照的λ噬菌体特异性引物，从而建立了检测鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌的多重qPCR方法，检测鼠疫菌的灵敏度十分高，检测菌量可低至1 CFU^[15]。

dPCR相较于qPCR具有更高的敏感度、精密度、独立于标准曲线及更高的抗干扰能力等优点^[16]。根据样品分散方式的不同，dPCR分为磁珠模式、微滴模式和芯片模式，其中应用较多的是微滴式dPCR（droplet digital PCR，ddPCR）。Cristiano等^[17]应用qPCR与ddPCR两种技术对污染的绿叶蔬菜中的小肠结肠炎耶尔森菌进行检测，发现ddPCR不容易受到食品本身存在的抑制物的影响，可代替qPCR检测从而减少假阴性结果的发生概率^[18]。虽然dPCR技术具有很高的稳定性、敏感度和重复性，但因价格昂贵和检测范围受限等问题阻碍着该技术在未来的广泛应用。

2.3 等温扩增技术

近年来很多的研究应用等温扩增技术进行核酸扩增，无需昂贵的热循环仪器和复杂的样品预处理，不经过PCR反应时DNA的变性、退火等一系列的循环变温过程，只需要保持在恒温60~65 ℃的条件下反应即可^[19]，不受非目的核酸的显著影响，费用低廉且方便，在病原菌的现场快速检测和条件有限的实验室中具有广阔前景。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是将目标基因、4种不同的引物、具有链置换活性的DNA聚合酶和底物在恒温下孵育，30~60 min即可完成核酸扩增^[20]，而扩增情况是通过反应混合物浑浊度的增加来检测的^[21]。

Zhang等^[22]建立了以16S~23S rDNA内部转录间隔区（internal transcribe spacer，ITS）为靶点的LAMP检测奶粉中的假结核耶尔森菌，扩增1 h后阳性结果均产生肉眼可见的白色沉淀，通过在扩增产物中进一步加入荧光染料SYBR Green I，假结核菌阳性样本呈现绿色，非假结核样本呈现棕色，该方法比常规的PCR法灵敏100倍。快速检测鼠疫菌对于鼠疫流行地区的实地调查至关重要，有助于迅速采取控制措施来预防疾病的传播。Bai等^[23]应用LAMP检测的方法，设计6个特异性引物扩增荚膜抗原基因（caf1）操纵子的一个亚基（caf1A），在65 ℃的干浴加热器上孵育即可在30 min内完成扩增，通过产物颜色变化观察结果。该方法可应用于检测跳蚤、啮齿动物和其他在鼠疫流行地区收集的环境样本是否感染鼠疫菌，在处理大样本量时非常有帮助。

3 基于噬菌体检测的方法

噬菌体是能够在感染细菌后将其裂解的一种病毒^[24]，它与宿主细菌随着时间的推移共同进化，形成了一种相互配对的特异性。这种特异性已被用于临床和环境中各种病原体的诊断，近几年来也被利用于开发快速、灵敏地检测致病性耶尔森菌的新兴技术^[25]。

利用qPCR检测特异噬菌体的扩增可以替代传统噬菌体裂解试验。通过设计鼠疫诊断噬菌体phiA1122和L-413C的特异引物进行qPCR，可省略模板DNA提取步骤并间接检测鼠疫菌活细胞^[26]。该方法具有快速（4 h内检测）、高灵敏度（检测限为10³ CFU/ml）和高特异性的优势^[27]。一种基于噬菌体vB-YenP-ZN18的电化学生物传感器已被研制成功，可在35 min内检测出活的假结核耶尔森菌，可用于食品、水和临床样品中假结核菌的监测^[28]。基于噬菌体受体结合蛋白（receptor binding protein，RBP）的磁分离技术已被应用于小肠结肠炎耶尔森菌的分离。用Gp47和Gp37这2种分别来源于噬菌体φ80-18和噬菌体vB-YenM-TG1的RBP包被的磁性微粒的混合物可同时捕获O∶3、O∶5、27、O∶8和O∶9这些主要血清型小肠结肠炎耶尔森菌，结合头孢磺啶三氯生新生霉素培养基（CIN培养基）或者CHROMagar Yersinia培养基（CAY培养基）使用可更加精准地从食物样本中筛选出致病性小肠结肠炎耶尔森菌^[29]。利用噬菌体的RBP来捕获病原菌是一种浓缩的替代方法，未来还可用于提高PCR、ELISA以及生物传感器等快速检测方法的分析灵敏度。

4 其他新兴技术

除了以上方法外，微阵列的出现也为致病性耶尔森菌的检测带来了更多的进步。在这种技术中，病原体被固定，然后通过实施不同的策略进行检测。通过开发结合多基因（ail、virF、yst和blaA）PCR扩增和随机DNA片段的微芯片，可以在各种样品中检测小肠结肠炎耶尔森菌^[30]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是近几年发展起来的一种新方法，能从12种耶尔森菌中通过蛋白质图谱比对鼠疫菌进行正确地识别，可作为一线识别方法^[31]。

间隔短回文重复序列及相关蛋白CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas（CRISPR associated proteins）系统是新一代的分子诊断工具，被广泛应用于病原生物快速检测技术的研发。Chen等^[32]选择了4个鼠疫菌检测的特异性标签来设计基于CRISPR-Cas12a的检测系统，使用重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）和LFI的试纸条实现结果可视化，检测限达到了pg级别^[33]，该系统具有便携、成本低、操作简便等优点，可应用于鼠疫菌的现场检测。

这些新型的检测技术仍需要进一步改进，测试的成本高和产品制备的时间长仍是我们需要解决的问题。

5 总结与展望

3种致病性耶尔森菌的感染案例在全球范围内仍在出现，小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌在各类食品、水以及冷藏环境中均被检出，但检出率较低^[34]。曾经被普遍认为不能在宿主之外存活的鼠疫菌，近年来不断在土壤、水等环境样本中被检测和培养出来^[35-36]。耶尔森菌病和鼠疫的临床表现复杂多样且发病率低，加上许多临床医生对这些疾病的认识不足，极易误诊从而耽误治疗^[37]。因此，在各类样本中快速、准确地对这3种致病性耶尔森菌进行检测尤为重要。免疫学、分子生物学等方法可弥补传统培养方法的不足，进一步确认检测结果。近年来LFI、dPCR、等温扩增、噬菌体检测以及基于CRISPR-Cas等诸多检测技术不断被研发出来，它们有着各自的优势，但单一地使用任何一项技术也会有其限制性，它们未来还可以进一步被优化和发展。因地制宜地选择合适的检测方法，多种技术的组合使用可相互对检测结果进行验证，能更准确、更快速地检测3种致病性耶尔森菌。这些新兴技术也将成为准确估计和减少全球耶尔森菌病和鼠疫发病率的有力工具。

利益冲突  无