蚊媒病毒引起多种人类蚊媒传染病（以下简称蚊媒病），严重危害人类健康，已知种类超过100种，如登革病毒（Dengue virus，DENV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）、黄热病毒（Yellow fever virus，YFV）、西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）、流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）、东方马脑炎病毒（Eastern equine encephalitis virus，EEEV）、盖他病毒（Getah virus，GETV）以及塔希纳病毒（Tahyna virus，TAHV）等。DENV感染引起登革热/登革出血热，近年来全球登革疫情形势严峻，在超过125个国家广泛流行，全球约一半人口面临感染DENV的风险^[1]。2015年5月，巴西自确诊第1例ZIKV感染病例后疫情迅速蔓延，短短8个月内约150万人感染ZIKV，随后在拉丁美洲和加勒比海国家大肆流行，全球超18个国家报告感染病例，被WHO定性为“国际关注的突发公共卫生事件”^[2]。ZIKV感染被认为和新生儿小头畸形及其他几种胎儿出生缺陷高度相关。YFV导致黄热病，临床表现为高热、头痛、黄疸、蛋白尿、相对缓脉和出血等症状，死亡率高传染性强。2016年曾在非洲安哥拉和刚果民主共和国等国暴发严重的黄热病疫情，至今在全球约47个国家和地区仍有流行。WNV引起西尼罗热，在整个非洲、欧洲部分地区、中东、西亚和澳大利亚流行，自1999年传入美国后引起多次疫情暴发。JEV引起流行性乙型脑炎，在东南亚区域和西太平洋区域24个国家流行，30亿人存在感染风险。CHIKV导致基孔肯雅热，从1952年在坦桑尼亚发现至今，已造成70多起疫情^[3]。

近年来，随着全球化推进，人流物流愈加频繁，以及全球气候变暖，蚊媒病传播风险进一步升高，使蚊媒病防控工作面临更大的挑战。针对现场捕获的蚊虫样本，广泛开展携带病原体的监测，将蚊媒病防控关口前移，能尽早发现疾病传播的风险，将显著提升公共卫生体系的效能。

然而，传统的蚊媒病毒检测方法主要基于患者来源的血清、体液或组织样本开发，不完全适用于现场蚊虫样本携带病原体的检测。现场蚊虫样本的成分构成与以上样本有明显不同，且自然感染率往往相对较低，这就要求检测方法具有更高的敏感性。此外，蚊虫样本的现场采集地常不具备良好的实验室条件，因此检测方法最好不依赖于大型仪器设备，对操作人员的技术要求不高。本文将梳理现有的蚊媒病毒检测方法及近期主要研究进展，分析其主要特点，探讨适用于检测现场蚊虫样本中蚊媒病毒的技术方法开发方向。

1 病毒分离

病毒分离是应用于病毒检测的传统方法。蚊媒病毒的分离培养是将病毒接种于乳鼠颅内、敏感细胞或蚊虫胸腔进行分离，分离得到的毒株可进一步用于形态学观察、基因分型和血清学鉴定。1943年，日本科学家Hotta和Kimura将急性期患者血清接种于乳鼠颅内而后分离到DENV，这是小鼠颅内接种法最早应用于蚊媒病毒的分离，这种方法也是DENV分离的最经典方法。但使用该法需多次传代或转种细胞进行培养，操作繁琐周期长，同时分离阳性率低，现极少应用于临床^[4]。

蚊媒病毒分离培养常用的敏感细胞系有白纹伊蚊（Aedes albopictus）卵细胞（C6/36）、幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）和Vero-E6细胞等。细胞系的选择在病毒的细胞培养中至关重要，不同的细胞对不同的病毒乃至病毒亚群有不同的敏感性。C6/36和BHK-21细胞较适合分离印度洋谱系的CHIKV，而埃及伊蚊（Ae. aegypti）Aag-2细胞、人宫颈癌细胞（HeLa）和Vero细胞较适用于亚洲基因型CHIKV的分离^[5]。

总体而言，病毒分离培养是一种历史悠久且曾被广泛应用于病毒检测的经典方法，该法存在一定的生物安全风险，要求实验室安全级别高，费用昂贵，且操作复杂，检测周期长（甲病毒在一些细胞上病变时间总体快于黄病毒），现场应用难度大。近些年出现了一些改良的细胞培养技术，如离心培养法，其原理是利用低速离心引发易感细胞表面轻度损伤，增加病毒与细胞接触概率，缩短病毒进入胞内时间，并结合免疫染色技术进行检测^[6]。该方法大大缩短了培养周期，但应用场景仍比较局限，暂不适合在现场应用。

2 抗原检测

病毒的抗原检测是利用抗原与抗体的特异性反应来检测病毒及其抗原的免疫学技术。杨鹏飞等^[7]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记JEV的NS1的抗体，制成免疫层析检测试纸条，并对三带喙库蚊（Culex triaeniorhynchus）进行模拟添加JEV检测，结果显示该法具有较高的灵敏度和特异性，且对实验条件要求低，可用于现场检测。常见的蚊媒病毒中有一大类隶属于黄病毒科黄病毒属，这些病毒大多具有共同抗原，抗原检测存在交叉反应。2002年，Konishi和Suzki^[8]首次将非结构蛋白1（NS1）用于JEV检测，发现与DENVⅠ~Ⅳ型均无交叉反应，部分解决了抗原交叉反应的问题。值得注意的是，NS1检测并不适用于所有黄病毒感染的抗原检测，如ZIKV NS1抗原检测的敏感性非常低，限制了其应用^[9]。2018年，Fumagalli等^[10]建立了以重组包膜蛋白2作为抗原的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CHIKV，发现其与多种病毒均无交叉反应。

总体而言，抗原检测方法操作便捷、成本低廉、无需大型辅助设备等特点使其具备现场快速检测的应用价值，但存在一定的交叉反应性，特异性有待提高，其敏感性也不及其他检测方法。

3 分子生物学检测 3.1 基于PCR技术的核酸检测

聚合酶链式反应（PCR）是诞生于20世纪80年代的一种体外特异性扩增特定DNA片段的分子生物学技术。反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）是将RNA的反转录和cDNA的PCR相结合的技术，由于蚊媒病毒的遗传物质大部分是RNA，一般采用RT-PCR技术对蚊媒病毒进行核酸检测。RT-PCR技术自20世纪90年代初开始应用于YFV等蚊媒病毒的检测^[11]。

实时荧光定量PCR（qPCR）在传统PCR的基础上采用荧光实时显示扩增物产量，与传统PCR/RT-PCR相比，该法具有快速、特异性更高、灵敏度更高且能进行定量分析等优点^[12]。2018年，Yang等^[13]建立了以ZIKV包膜E蛋白编码基因保守序列作为靶标实施实时定量反转录PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）检测，该方法可广泛检测所有亚洲以及非洲的ZIKV谱系，具有高度的检测灵敏度和特异性，有效地解决了此前存在的假阳性问题，成为检测ZIKV的有力工具。另一项研究基于实时RT-PCR方法结合新型Taqman探针用于扩增ZIKV非结构蛋白NS5序列，与传统的qPCR方法相比，该法表现出更高的检测灵敏度^[14]。Santiago等^[15]开发了一种新型Trioplex实时RT-PCR检测法，该法在同一反应体系中进行ZIKV、CHIKV和DENV的定性检测，可用于鉴别诊断ZIKV与CHIKV和DENV。经独立研究证实，Trioplex实时RT-PCR检测法具有高度敏感性。自2016年以来，Trioplex检测法已相继被国际上200多个公共卫生实验室采纳。

基于PCR技术的核酸检测方法具有灵敏度高，特异性强等优点，但其需要昂贵的热循环仪（PCR仪），检测成本较高，且对操作人员的专业程度要求高，无法在欠发达地区广泛开展，限制了其现场应用。

3.2 核酸分子杂交技术

核酸分子杂交是具有互补序列的DNA单链，或者RNA单链与DNA单链形成双链的过程，包括核酸斑点杂交、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、荧光原位杂交等。核酸分子杂交常与其他技术相结合用于蚊媒病毒的检测。戎霞等^[16]利用标记地高辛的DENV通用引物扩增蚊媒体内的病毒核酸，然后以反向斑点杂交法检测扩增片段并进行分型，该法检测灵敏度是凝胶电泳检测扩增片段方法的10倍，且稳定性良好。结合液相芯片和多重PCR技术建立的能同时检测6种蚊媒病毒（包括JEV、DENV、CHIKV、ZIKV、YFV、裂谷热病毒）的方法展现了快速、高灵敏度及高通量等优势^[17]。

分子杂交方法有较高的特异性和灵敏度，但由于对实验室环境与实验仪器的要求比较严格，且操作复杂等原因，在实际检测工作中应用较少。

3.3 核酸序列分析技术

核酸序列分析技术是指分析特定核酸片段碱基序列的技术，20世纪70年代末，WalterGilbert发明化学修饰链裂解法，FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序。二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA序列分析技术，可以对样本DNA高通量快速测序。与一代测序的合成中止测序不同，二代测序引入了可逆终止末端，实现边合成边测序，NGS在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定病原体的核酸序列。近年来，越来越多的研究将NGS运用到蚊媒病毒的检测中。2017年，一名从匈牙利返回的比利时老人突发重病，传统的诊断方法未能确定病因，而研究人员采用培养的呼吸道样本进行NGS测序，序列分析结果发现了完整的WNV基因组，从而确诊其感染了WNV^[18]。2020年，Hameed等^[19]对中国新疆维吾尔自治区（新疆）采集的548只蚊进行了宏基因组NGS测序，数据结果表明JEV已传播至新疆，这也揭示了NGS对蚊媒病毒流行病学研究的重大意义。三代测序技术是指单分子测序技术，在测序过程中无需经过PCR扩增，即可实现对每一条DNA分子的单独测序，整个测序过程可避免因PCR扩增产生的错误和偏好性。三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序，其技术阵营主要分为单分子荧光测序和纳米孔测序2种。近年来已有学者将三代测序技术运用到蚊媒病毒的检测中，Adikari等^[20]采用纳米孔测序技术对DENV进行全基因组序列分析，序列比对结果显示纳米孔测序平台与二代测序平台测出的两组序列具有99.5%以上的相似性，检测结果准确可靠。

与其他检测技术相比，核酸序列分析技术具有相当高的特异性、灵敏度及准确度，在筛查不明病原体时具有显著的优势。但序列分析需要大型昂贵的专业仪器，检测成本以及对操作人员的专业要求都很高，检测分析周期较长，因此对于蚊媒病毒的现场检测不适用。

3.4 核酸等温扩增技术

核酸等温扩增技术是一种在恒定温度下对样本中DNA进行高效扩增的方法，主要包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、依赖螺旋酶的扩增（HDA）、交叉刺激扩增（CPA）和链置换扩增（SDA）等，以及与规律成簇间隔短回文序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR相关（CRISPR-associatied，Cas）蛋白组成的CRISPR-Cas系统相结合的等温扩增技术。

3.4.1 LAMP

2000年，日本科学家Notomi等^[21]开发了能在恒定的温度条件下高特异性、高效快速地扩增DNA的LAMP方法，与PCR技术相比，其不需要经历模板的预变性、温度循环（变性、退火、延伸）等诸多步骤。LAMP方法是针对靶基因区域设计2~3对引物，利用具有链置换性质的嗜热DNA聚合酶在一个恒定的温度下实现一步核酸扩增的高效方法，其扩增效率是PCR反应的10~100倍。LAMP结果检测方法多样，除传统的凝胶电泳检测外，也可用肉眼直接观察或者使用浊度仪进行定量分析，还可在反应体系中加入荧光染料，通过观察荧光的变化进行分析。

LAMP已被开发应用于DENV、ZIKV、CHIKV等蚊媒病毒的检测。2018年，Kim等^[22]设计了特异性的新型引物，采用反转录环介导等温扩增（reverse transcription-LAMP，RT-LAMP）技术可在25 min内完成DENV-1、DENV-2和DENV-4的鉴别检测，结果显示与其他相关蚊媒病毒不存在交叉反应，具有良好的特异性。而基于RT-LAMP的结合特异性探针的多重检测系统可在30 min内实现ZIKV、DENV和CHIKV的现场可视化检测^[23]。2022年，Maddison等^[24]建立了比色RT-LAMP的方法用于EEEV的检测，使用分离培养得到的EEEV、现场获取和实验感染EEEV的阳性蚊来验证，与qRT-PCR的结果进行对照，结果表明比色RT-LAMP检测法可检测到样本中的痕量EEEV，具有高度灵敏度，可用于对敏感性要求较高的现场检测。Tomar等^[25]开发了基于比色法的反转录环介导等温扩增（colorimetric RT-LAMP，cRT-LAMP）和结合侧流试纸条（lateral flow dipstick，LFD）的RT-LAMP（RT-LAMP with lateral flow dipstick，RT-LAMP-LFD）的方法，对引物浓度、温度和时间进行优化，63 ℃的最佳温度下可在40 min内完成检测，能够5 min内在侧流试纸读取结果。经实验测定最低检测限为10个拷贝数，对WNV特异性较高，该法为WNV的现场检测带来可能。

由于现场快速检测的需求，不少学者对LAMP进行改进，期望建立更加快速准确的检测方法。Estrella等^[26]开发了一个基于RT-LAMP检测的简便系统，使用Bst DNA聚合酶3.0（来源于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶Ⅰ，通过基因工程手段去除了其5΄-3΄外切酶活性，而保留了5΄-3΄聚合酶活性，该酶具有很强的链置换能力），无需RNA提取或样品预处理，使RT-LAMP反应可以在10 min内完成。此方法表现出高度的测试灵敏度，进一步减少RT-LAMP检测时间，在蚊媒病毒的现场检测中有很大应用价值。

相比于PCR技术，LAMP反应在60~65 ℃的恒定温度下进行，因此无需昂贵的热循环仪，只需配备能够提供恒定温度的简单设备，同时反应试剂在室温下稳定，无需严苛的操作条件，且LAMP操作简便，检测耗时短，与PCR法相比，可缩短约50%的反应时间。此外，LAMP检测灵敏度是PCR的10~100倍^[27-28]。

3.4.2 RPA

2006年，Piepenburg等^[29]利用参与细胞DNA合成、重组和修复的蛋白质开发了RPA技术。RPA是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中定位到同源序列，而后发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增的等温扩增技术。RPA技术主要依赖于3种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这3种酶在常温下可保持活性，因此RPA反应在恒定温度（37~42 ℃）下进行，通过实时监控可以轻松分析结果。

迄今为止，RPA已被用于多种蚊媒病毒检测，包括ZIKV、DENV和WNV等^[30-32]。Escadafal等^[33]采用反转录重组酶聚合酶扩增（reverse transcription-RPA，RT-RPA）反应体系对20个不同来源的YFV毒株成功实现了鉴别检测，这一现场实时检测结果用RT-PCR方法进一步进行验证和确认，结果高度一致，证实了RPA法检测具有高度灵敏度和特异性。Tomar等^[30]采用实时RT-RPA法检测人类临床样本中的WNV，实验选取110个WNV可疑血清和血浆样本进行RT-RPA和qRT-PCR检测，两种方法检测结果高度一致，而检测速率比qRT-PCR快10~20倍，显示了该法在WNV现场检测的应用价值。

RPA技术在国内也得到一定应用和发展，基于RPA技术开发出了重组酶介导扩增（recombinase aided amplification，RAA），其与RPA唯一不同的是RPA使用T4噬菌体的重组酶，RAA使用来源于细菌或真菌的重组酶。2020年Xiong等^[34]将RAA方法与LFD相结合建立了RAA-LFD技术，该法无需复杂反应和可视化检测设备，操作便捷，肉眼可完成结果观察；且具有较高的特异性和灵敏度，非常适合用于资源匮乏的现场条件下实施快速检测DENV。Nie等^[35]采用实时荧光RT-RAA的方法用于快速检测GETV，该方法保留了探针qPCR的高特异性和灵敏度，又具有RAA快速准确的优点。李樊等^[36]建立TAHV核酸RT-RAA检测方法，采用构建含检测目的基因片段的质粒和病毒细胞培养物对该法进行评价，通过检测黄病毒属、甲病毒属、正布尼亚病毒属和东南亚十二节段病毒属共7种病毒验证方法的特异性，结果显示该法的特异性和灵敏度较高。这些研究表明，RPA技术便捷准确，在蚊媒病毒的现场检测中有巨大的应用前景。

与LAMP相比，RPA技术存在2个明显优势，其一整个反应只需用到1对引物，且引物长度也较短，引物设计相对简单；也可加入增强分析特异性的探针，提高检测的特异性。其二整个反应在37~42 ℃进行，相较于LAMP方法反应条件更易实现。但目前RPA还存在一些局限性，如成本较高、缺乏RPA专用引物的设计软件^[37]。此外，在使用琼脂糖凝胶电泳或LFD检测RPA结果时，通常需要在扩增反应后进行纯化/蛋白质消化，否则将影响结果判读。

3.4.3 其他等温扩增

除LAMP、RPA外，还有许多其他等温基因扩增技术，如NASBA、HDA、CPA和自持续序列复制反应（3SR）。这些等温扩增技术在检测耗时、灵敏度、特异性等方面优于基于PCR技术的检测方法。目前这些方法也已应用于蚊媒病毒检测，如2021年Zhou等^[38]经研究发现，NASBA应用于JEV的检测，显示出高度的特异性。

然而，所有这些等温扩增方法都有其自身的局限性，如NASBA需要在与扩增反应不同的温度下进行初始变性并且需要在变性步骤后添加所需的热降解酶，HDA需要高的孵育温度和额外的酶，例如用于实现双链DNA变性的DNA解旋酶，并且完成反应需要90 min，检测时间过长且常常达不到单分子检测阈值，CPA需要复杂的引物设计，而3SR需要不同的孵育温度来完成反应^[30]。由于存在检测成本高、操作复杂或检测特异性较低等问题，限制了这些方法在实践中的应用。

相较于被普遍认可和广泛使用的基于PCR技术的核酸检测方法，等温扩增技术无需昂贵的热循环仪，操作简便，检测快速，可以高效扩增样本中痕量DNA，且结果判读方法多样，其在检测成本和灵敏度方面均优于PCR方法，适合在资源匮乏的现场条件开展快速检测。但其检测过程中容易出现假阳性这一点成为其广泛应用的最大限制因素。

3.4.4 CRISPR-Cas结合等温扩增技术的检测方法

CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复序列，该序列与Cas蛋白组成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统是原核生物的一种自我保护机制，是细菌用来抵抗外来遗传物质入侵的适应性免疫防御系统。其发挥免疫的功能包括适应、表达和干扰3个阶段。

目前采用CRISPR-Cas技术进行核酸检测研究最著名的两大团队分别是来自麻省理工学院的张锋博士团队和加州大学的Doudna博士团队。张锋团队于2017年4月在Science杂志发表论文第1次系统介绍CRISPR-Cas系统在分子诊断领域的应用，他们将RPA技术与CRISPR-Cas系统相结合开发了SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unLOCKing）分子检测平台，不仅可以实现包括DENV、ZIKV以及病原性细菌等在内的人类病原体的核酸检测，还有望实现血液中癌细胞相关基因突变的检测，此外亦能成功鉴定人类基因组单核苷酸多态性（SNPs），检测灵敏度可达到阿摩尔级^[39]。该检测平台的关键是Cas13a，CRISPR效应蛋白Cas13家族成员之一（Cas13蛋白家族包含Cas13a~d 4个成员）。Cas13a是一种由向导RNA引导的RNase，能识别并切割带有特定靶序列的单链RNA，然而Cas13a在切割特异RNA分子后会无区分地切割其他非特异RNA分子，这被认为是Cas13a的“附带切割”活性。研究人员正是利用了Cas13a这一特点，加入一种可淬灭的荧光RNA，当荧光RNA被切开时，会发出荧光信号而显示检测结果^[40]，他们利用基于Cas13a的SHERLOCK平台检测到了浓度低于1个拷贝数的ZIKV和DENV^[41]。

采用SHERLOCK平台实施现场快速检测还须考虑关键的初步步骤样本的前处理和核酸的分离提取，Sabeti团队开发了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）方法进行样本的处理，经处理的临床样本再用SHERLOCK平台进行核酸检测，最终的检测结果能够在试纸条上很容易地观察到，整套检测流程能够在2 h内完成^[41]。利用HUSDON+SHERLOCK技术，能区分4种DENV血清型以及2015－2016年大流行的ZIKV的特定区域毒株，利用荧光和比色法在2 h内便可肉眼观测到ZIKV和DENV的检测及分型结果^[41]。通过将HUDSON和SHERLOCK联合使用，Sabeti团队能够直接在患者的唾液和血清样品中检测到DENV，还能够检测之前添加到健康血液和尿液样品中的ZIKV颗粒^[41]。

2020年5月初，张锋团队在前期工作基础上开发了一步法检测新型冠状病毒（SARS-Cov-2）核酸的STOP（SHERLOCK Testing in One Pot）Covid检测平台来推进对新型冠状病毒感染（COVID-19）的即时检验（POCT）。该技术采用RT-LAMP法代替RT-RPA扩增病毒核酸，选择耐高温嗜酸杆菌来源的AapCas12b代替Cas13a，AapCas12b在crRNA引导下切割目标dsDNA分子。AapCas12b也具“附带切割”活性，切完目标dsDNA分子后即可切割非特异性ssDNA分子，因此STOP Covid技术将ssDNA作为荧光报告分子^[42]。

Doudna团队主要发现Cas12a被激活后可非特异性地剪切、降解单链DNA，并以此建立了另一个CRISPR-Cas分子诊断技术，命名为DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter，简称DETECTR，该技术利用Cas12a（Cpf1）通过crRNA靶向特定的双链DNA，切割目标双链DNA后，会对所有的单链DNA发动任意切割，将ssDNA-荧光淬灭（FQ）报道基团加入反应中，在ssDNA降解时就会产生荧光信号。而后他们用实验证明，DETECTR能够快速和特异性地检测人类患者样本中的人乳头瘤病毒，从而为核酸诊断提供了一个简单的平台^[43]。2021年，Ooi等^[44]运用CRISPR结合RT-LAMP的方法，在30 min内成功检测野生型和变异型SARS-CoV-2，经证明测试表现出100%的特异性和阳性预测值。

除此之外，还有其他实验团队开发了将恒温扩增技术NASBA、toehold开关RNA传感器和CRISPR-Cas9系统进行结合的NASBA-CRISPR cleavage（NASBACC）技术，实现了ZIKV的分型检测^[45]。但以上技术尚未见在蚊媒病毒检测中应用的报道。2018年，中国科学院的王金团队和喻学锋团队分别开发了基于Cas12a的CRISPR-Cas结合LAMP扩增技术的HOLMES分子诊断技术^[46]和基于Cas9结合SDA的CRISDA技术^[47]。实验证明，CRISDA技术能够快速和特异性地进行乳腺癌相关SNPs基因分型^[46-47]。

与单纯采用等温扩增技术进行核酸检测不同，CRISPR-Cas结合等温扩增技术的核酸检测方法从一定程度上解决了等温扩增方法特异性不够的缺陷，同时仍然保留了等温扩增技术的高灵敏度，操作简便快速，结果判读形式多样等特点，并极大改善了假阳性和假阴性问题；可应用于核酸检测的Cas蛋白亚族成员众多，不同成员识别不同crRNA序列，且激活后的Cas-crRNA复合体对同一核酸报告分子的非特异剪切活性也存在差别，这一特点为实现病原体的多重检测奠定了基础；近年来，CRISPR-Cas结合等温扩增的核酸技术因可实现多重检测且兼具高灵敏度、高特异性等特点而成为新的研究热点，有望取代PCR的传统地位，在便携式、即时检测领域前景广阔，为蚊媒病毒现场快速检测应用提供了可能。

4 结论及展望

综上所述，现有的蚊媒病毒检测技术多样，包括病毒分离培养技术、免疫学和核酸检测技术。其中病毒分离培养需要很高硬件条件和熟练的技术人员，周期长且具有一定的生物安全风险；免疫学检测技术中的抗体检测不适用于蚊虫样本，抗原检测的灵敏度一般不足以检测出蚊虫样本中的病毒，因此这2种方法不适合现场蚊媒病毒检测。

核酸检测方法中的PCR和RT-PCR方法是目前多数蚊媒病毒的标准检测方法，但因其需要大型仪器设备，对实验室条件有较高的要求，不适合在资源匮乏的现场开展快速检测。核酸分子杂交及NGS方法对实验条件和操作人员要求也较高，且NGS检测的周期较长，因此应用于蚊媒病毒的现场检测中也有局限性。近来迅速发展的核酸等温扩增技术具有高度的敏感性，无需昂贵的大型仪器，检测周期短，样本处理要求低，且肉眼或手机可判定结果，在现场检测蚊媒病毒中表现出显著优势。特别是最新研发的CRISPR-Cas结合等温扩增技术，在进一步提升检测敏感性的同时还极大地提升了检测的特异性，显示出较为光明的开发前景。相信随着新技术的不断开发和应用，将显著提升人类对蚊媒病毒的监测和防控能力，从而更有效地保障人类健康。