2023, Vol. 34扩展功能
文章信息
- 刘丹, 李晓娜, 乌兰图雅, 樊红霞, 帖卫芳, 马宇星, 梅步俊, 殷旭红, 曹民治, 高娃
- LIU Dan, LI Xiao-na, Wulantuya, FAN Hong-xia, TIE Wei-fang, MA Yu-xing, MEI Bu-jun, YIN Xu-hong, CAO Min-zhi, Gao wa
- 内蒙古自治区大兴安岭林区游离蜱及其疏螺旋体调查
- Free ticks and tick-borne Borrelia in Daxinganling forest zone, Inner Mongolia Autonomous Region, China
- 中国媒介生物学及控制杂志, 2023, 34(3): 394-399
- Chin J Vector Biol & Control, 2023, 34(3): 394-399
- 10.11853/j.issn.1003.8280.2023.03.019
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文章历史
- 收稿日期: 2022-12-02
蜱媒疾病的医学重要性早已被人们所认知，但对于诸如疏螺旋体等新出现的蜱媒病原体的发生却知之甚少。疏螺旋体包括莱姆病螺旋体（Lyme disease borreliae）和回归热螺旋体（Relapsing fever borreliae）。在欧洲报告的所有蜱媒疾病中，莱姆病是迄今为止最流行的，每年约新增85 000例病例[1]，且年患病率正在以10.1%的速率上升[2]。自1981年鉴定出伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）为莱姆病的主要病原体以来[3-4]，世界各国相继报道了若干个亚种，包括B. burgdorferi sensu stricto、B. garinii、B. afzelii、B. bavariensis和B. spielmanii等，在地理分布和感染的临床表现上各不相同[5]。1985年，中国黑龙江省报告了第1例莱姆病感染病例，随后进行的血清流行病学调查显示，至今已有约30个省（自治区、直辖市）的人群中存在伯氏疏螺旋体感染[6-7]。中国菌株目前至少存在5个基因型[8]，其中B. garinii和B. afzelii是主要致病基因型。
回归热螺旋体是一种可导致回归热的病原体，B. miyamotoi是1995年在日本北海道的全沟硬蜱（Ixodes persuleatus）中分离出的一种蜱传回归热螺旋体新种[9]，2011年在俄罗斯首次报告该菌感染引起的新型回归热病例[10]，随后在美国、荷兰以及日本等地也相继出现了感染病例[11-13]。2019年，本团队首次成功从内蒙古自治区（内蒙古）大兴安岭林区采获的全沟硬蜱中分离到B. miyamotoi，并命名为B. miyamotoi-Hetao1（LC557152）[14]，也是国内首次完成的分离。
内蒙古大兴安岭林区得天独厚的地理生态环境，以及丰富的自然资源景观促进了蜱的生长和繁殖，成为我国蜱传疾病的主要疫源地之一。本课题组前期研究发现，内蒙古大兴安岭林区莱姆病螺旋体和回归热螺旋体具有较高的检出率[15]。本研究旨在对该林区采获的不同蜱中检出的疏螺旋体进行系统学特征调查，为该区域防控蜱传疏螺旋体疾病提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 样本采集地区2019－2021年春夏季，在内蒙古大兴安岭林区的呼伦贝尔市地区和兴安盟阿尔山的不同森林地区通过布旗法采集蜱样本，同时记录采集时间、地点、经纬度、海拔等信息。
1.2 蜱种鉴定根据形态学标准进行初分类，并鉴定蜱所处的发育阶段，再采用扩增16S rDNA基因mt-rrs部分序列，PCR采用引物（mt-rrs1：5' -CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3'；mt-rrs2：5'- CCGGTCTGAACTCAGATCAAGTA-3'），94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，所有PCR产物均直接测序[11]。
1.3 DNA提取和检测将蜱浸泡在次磷酸钠、75%的乙醇溶液加碘伏5 min，然后用无菌水冲洗，自然干燥，在体视显微镜下解剖，摘出唾液腺，使用DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen公司），根据说明书提取唾液腺DNA，-20 ℃冻存。
先采用多重实时荧光定量PCR法（qPCR，探针法），以16S rRNA基因（16S rDNA）为靶向基因，进行莱姆病螺旋体和回归热螺旋体的检测，在Barbour[16]的基础上，为莱姆病螺旋体设计了带FAM标记的小凹槽粘合剂探针（FAM探针），回归热螺旋体（包括B. miyamotoi）设计了带VIC标记的小凹槽粘合剂探针（VIC探针），并使用Premix Ex Taq（Probe qPCR）（Takara Bio Inc.，Shiga，Japan）进行qPCR，按照说明书操作[17]。PCR循环次数设置为40次，rrs-Tagman探针序列：Borrelia_16 s_RT_F 5′-GCTGTAAACGATGCACACTTGGT-3'，Borrelia_16 s_RT_R 5′-GGCGGCACACTAACACGTTAG-3'；莱姆病螺旋体：BB probe_FAM-TTCGGTACTAACTTTAAGTAA-MGB；回归热螺旋体：BM probe VIC-CGGTACTAACTTACGATTA-MGB。qPCR阳性样本再以特异性较高的疏螺旋体鞭毛蛋白B（flagellin gene B，flaB）作为靶基因进行扩增确认，正向引物flaB-F_5' -CATACGCTTATGCYTTRGGMGCTGA-3'，和反向引物flaB-R_5'-GCAACCTCTGYCATACCTTCTTSTG-3'，扩增长度约为350 bp[18-19]。特异性引物合成与测序均委托南京金斯瑞生物科技公司完成。混合感染即通过对其序列分析呈多个病原体判定。
1.4 同源性和系统发育分析测序得到的序列均在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站进行同源性比对，然后使用MEGA 7.0软件进行系统发育分析并构建系统进化树。
1.5 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行数据分析。其中，计数资料的统计描述采用例数（百分比）来表示，不同组间的比较采用χ2检验，检验水准取α=0.05。
2 结果 2.1 蜱种分布共采获蜱2 755只，隶属于3属4种。其中，全沟硬蜱占85.6%，为该林区的优势蜱种。共采集嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）246只，占8.9%；日本血蜱（H. douglasi）134只，占4.9%；森林革蜱（Dermacentor silvarum）17只，占0.6%。见表 1、2。
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在疏螺旋体的qPCR和flaB的检测中共发现681个阳性样本，阳性率为24.7%（表 1、图 1）。其中回归热螺旋体有106个阳性，阳性率为3.8%；莱姆病螺旋体有575个阳性，阳性率为20.9%。全沟硬蜱和嗜群血蜱均检出莱姆病螺旋体，但阳性率差异较大，全沟硬蜱（24.0%）的阳性率远高于嗜群血蜱（3.7%）（χ2=501.368，P < 0.001）。回归热螺旋体仅在全沟硬蜱中发现，阳性率为4.5%。
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| 注：M DNA长度标记；N空白对照；1~7不同蜱样本。A实时荧光定量PCR检测结果；B疏螺旋体flaB基因PCR检测结果。 图 1 内蒙古大兴安岭林区蜱媒疏螺旋体PCR检测结果 Figure 1 PCR detection results of tick-borne Borrelia in Daxinganling forest zone, Inner Mongolia |
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测序获得的疏螺旋体序列经BLAST比对和系统发育分析，结果显示分别为B. afzelii（CP003882）、B. garinii（CP003866）、B. miyamotoi（AB900798）和Borrelia sp.（LC170020）（表 2、图 2）。不同蜱种携带疏螺旋体种类及携带率存在差异。全沟硬蜱的B. garinii检出率最高，为19.5%，B. afzelii和B. miyamotoi检出率次之，均为4.5%，Borrelia sp.的检出率最低为0.2%（χ2=770.734，P < 0.001）；嗜群血蜱仅检出B. garinii，检出率为3.7%。FAM探针可广泛地从大兴安岭硬蜱中检测出伯氏疏螺旋体，包括B. garinii和B. afzelii等，而VIC探针检测到的回归热疏螺旋体范围较窄，仅为B. miyamotoi疏螺旋体。
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| 图 2 内蒙古大兴安岭林区蜱媒疏螺旋体鞭毛蛋白B（flaB）基因的系统发育分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of flaB gene of tick-borne Borrelia in Daxinganling forest zone, Inner Mongolia, China |
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仅从全沟硬蜱中发现回归热螺旋体和莱姆病螺旋体的混合感染。其中，B. garinii和B. miyamotoi混合感染蜱有8只；B. afzelii和B. miyamotoi混合感染蜱有5只。
2.4 系统发育分析以疏螺旋体菌群flaB基因序列作为参照构建的系统发育树分析结果显示，源于全沟硬蜱的一些序列分别与B. afzelii（CP003882）、B. garinii（CP003866）、B. miyamotoi（AB900798）和Borrelia sp.（LC170020）产生高度同源性（97.5%~100%）；源于嗜群血蜱的序列也与B. garinii（CP003866）聚在一簇。见图 2。
3 讨论内蒙古大兴安岭林区拥有我国最大的天然草原区，森林面积覆盖率超过78%，居全国国有林区之首，是蜱类赖以生存的绝佳生境。每年春夏季，林区居民被蜱叮咬事件时有发生，由于蜱传疾病没有特异性的临床表现，且临床医生缺乏相关的经验，常常造成误诊而延误治疗。
莱姆病的传播媒介因地区而异，在中国北方，全沟硬蜱是其最主要的传播媒介。本研究中全沟硬蜱莱姆病螺旋体的检出率为24.0%，低于内蒙古奇乾地区（29.01%）[20]，高于黑龙江省（20%）[21]。全沟硬蜱具有高度侵袭性，人被叮咬后可导致典型莱姆病的发生。本研究中全沟硬蜱的回归热螺旋体的检出率为4.5%，接近于俄罗斯（1%~16%）[10]，高于比利时（1.14%）和荷兰（3.84%）[22]。莱姆病螺旋体和回归热螺旋体均可以通过一些中小型的哺乳动物、鸟类、宠物猫及犬、牛、羊等家畜作为宿主，维持着自然界相关疾病的存在和持续循环[23-24]。回归热螺旋体被证实可通过输血在小鼠实验模型中传播，预示着也可能会在人类的输血过程中传播[25]。
本研究绝大部分疏螺旋体来自全沟硬蜱，其中部分疏螺旋体flaB基因序列与莱姆病螺旋体B. garinii、B. afzetii和回归热螺旋体B. miyamotoi存在差异，但同源性相对较高。全沟硬蜱是内蒙古东部林区的优势蜱种，提示该区域可能成为蜱媒莱姆病和回归热危害比较严重的地区。本研究中B. garinii、B. afzetii和B. miyamotoi的阳性率与内蒙古奇乾地区3种疏螺旋体的阳性携带率均相近[20]，提示内蒙古地区广泛存在这3种疏螺旋体的感染。本研究中莱姆病螺旋体以B. garinii占优势，与既往研究类似[26]。B. garinii主要损害神经系统，常从脑脊液中被分离出来，有助于根据其临床表现结合流行病学发现进行临床诊断。B. miyamotoi是一种回归热螺旋体，主要在硬蜱中被检出，通常与莱姆病螺旋体B. garinii和B. afzelii等混合感染[26]。
除生物因素和自然因素以外，社会因素在蜱媒疏螺旋体的发生和流行过程中也起到了极为重要的作用。每年的7－10月是内蒙古地区的旅游旺季，旅游业的发展增加了人从自然界感染蜱媒病原体的风险。
本研究证实，内蒙古大兴安岭林区蜱类中广泛携带以莱姆病螺旋体和新型回归热螺旋体为主的蜱媒疏螺旋体菌群，分布范围和蜱类感染形势超出以往的认识，游客中时有被蜱叮咬的报道，有必要针对性地加强该重点区域蜱传疾病的防控工作。
利益冲突 无
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