肾综合征出血热（HFRS）是由汉坦病毒（Hantavirus）感染引起的一种自然疫源性急性传染病，属我国法定乙类传染病。HFRS患者感染早期血液和尿液中存在汉坦病毒，虽有少量接触后被感染的案例报告，但普遍认为HFRS传染源以啮齿类动物为主，而非患者^[1]。汉坦病毒不会引起宿主动物患病，但感染汉坦病毒的宿主动物排泄物含有大量病毒，是人类感染汉坦病毒的主要来源^[2]。该病发生主要取决于病毒、啮齿类宿主动物和人之间的相互作用，存在地理、季节差异，也存在一定的周期性和偶然性，受气候与气象、环境、经济社会发展、人类活动和个人行为等因素影响^[3]。浙江省舟山市20世纪80、90年代HFRS病例报告较多，是HFRS的老疫区，自然疫源地存在广泛，传染源主要是褐家鼠（Rattus norvegicus），1986年为发病高峰，此后发病率逐渐下降，呈散发状^[4]。目前舟山市可供参考的宿主动物相关资料较少，2021年岱山县疾病预防控制中心（疾控中心）与定海区疾控中心于舟山市的岱山县和定海区等地开展了HFRS宿主动物鼠密度、种群分布和鼠带病毒情况的调查以及病毒基因特点分析等工作。

RNeasy Mini Kit（74104）（德国Qiagen）；HFRS汉坦病毒Ⅰ、Ⅱ分型核酸测定试剂盒（荧光PCR法）购于上海之江科技有限公司；一步法RT-PCR试剂盒（RR055A）、PCR试剂盒（RR902A）均购自宝生物工程（大连）有限公司。荧光定量PCR仪采用Applied Biosystems QuantStudio 5；普通PCR仪使用梯度基因扩增仪T-one 96G（德国耶拿分析仪器股份公司）；凝胶成像分析仪Essential V6；电泳仪EPS300。

根据《全国肾综合征出血热监测方案》^[5]要求，2021年在浙江省舟山市定海区、岱山县采用夹夜法，开展野外和居民区的鼠密度、鼠种监测，并进行鼠种鉴定统计。

无菌采集小兽肺标本置于2 ml无菌离心管中，标记编号后置于冰上，在离心管中加入无菌不锈钢珠和400 μl磷酸盐缓冲液（PBS），用组织研磨器研磨0.5~1 min制作组织匀浆；将匀浆液4 ℃ 8 000×g离心1 min，收集上清液分装至1.5 ml离心管中；采用RNeasy Mini Kiti试剂盒，按说明书操作提取病毒核酸。

根据汉坦病毒首尔型M基因（KY639618.1）自行设计M段全基因序列引物进行病毒基因扩增，序列见表 1。

表 1 汉坦病毒巢式PCR扩增引物序列 Table 1 Sequences of primers for Hantavirus gene amplification by nested PCR

表选项

采用HFRS汉坦病毒Ⅰ、Ⅱ分型核酸测定试剂盒（荧光PCR法）进行检测以确定基因型别，RT-qPCR反应体系及反应条件按试剂盒中使用说明书进行。

采用巢式PCR进行2轮扩增，首轮外套扩增条件[用一步法RT-PCR试剂盒（RR055A）]：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 45 s，30个循环。第2轮内套扩增条件[用PCR试剂盒（R902A）]：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36个循环。内套扩增产物经电泳50 min后在成像仪上确定特异性条带浓度达到测序要求后，递交上海派森诺基因科技有限公司进行测序。

将测序中的引物序列去除后，应用DNAStar软件进行序列的拼接、比对和分析。从美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GenBank中下载国内外人源和鼠源M基因序列作为参比序列（表 2）。采用MEGA 7软件（v7.0.26）进行序列间的同源性比较，绘制M基因的遗传进化树。选用贝叶斯信息量（BIC）值最小的Tamura 3-parameter模型来构建，绘制方法采用邻接（neighbor-joining，NJ）法。

表 2 汉坦病毒毒株及来源 Table 2 Hantavirus strains and sources

表选项

用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，率的比较采用χ²检验。检验水准取α=0.05。

2021年在舟山市岱山县本岛、岱山县渔山岛及定海区本岛共布放有效鼠夹4 851夹次，其中野外布放2 985夹次，居民区布放1 866夹次。共捕获小兽194只，小兽密度为4.00%，其中鼠166只，鼠密度为3.42%，臭鼩（Suncus murinus）28只，密度为0.58%。野外捕获鼠51只，野外鼠密度为1.71%，居民区捕获115只，居民区鼠密度为6.16%。居民区优势鼠种为褐家鼠，占捕获鼠类的54.82%，野外优势鼠种为黑线姬鼠，占捕获鼠类的33.13%。岱山县本岛、岱山县渔山岛和定海区本岛鼠密度（χ²=108.468，P < 0.001），居民区和野外鼠密度（χ²=68.935，P < 0.001），以及岱山县本岛、岱山县渔山岛和定海区本岛不同鼠种密度（χ²=37.749，P < 0.001）之间差异均有统计学意义。共鉴定出褐家鼠、小家鼠（Mus musculus）、黄毛鼠（R. losea）、黑线姬鼠（Apodemus agrarius）、臭鼩和北社鼠（Niviventer confucianus）6种（表 3）。宿主动物调查点位见图 1。

表 3 2021年浙江省舟山群岛部分地区鼠密度 Table 3 Rodent density in some areas of Zhoushan Islands, Zhejiang province, 2021

表选项

图 1 2021年浙江省舟山群岛宿主动物调查点位分布 Figure 1 Distribution of investigation sites for host animals in Zhoushan Islands, Zhejiang province, 2021

图选项

对194份小兽肺标本进行RT-qPCR扩增检测，13份小兽肺标本检测到汉坦病毒RNA，阳性率为6.70%，其中11份来自岱山县渔山岛褐家鼠，岱山县本岛和定海区本岛褐家鼠阳性各1份，分型均为Ⅱ型（SEOV型）汉坦病毒核酸阳性。

13份标本汉坦病毒RNA提取物中3份（岱山县本岛、岱山县渔山岛和定海区本岛各1份）成功扩增并对汉坦病毒的M段基因测序。系统进化树表明，本研究中3个M段基因同源性在96.90%~97.10%，属于SEOV型汉坦病毒S3亚型。本研究的3段M基因DSE2、DS55、DSD3与浙江分离株Z37（AF190119.1）、河北分离株HBT-3（KM233661.1）、山东分离株JX20140581（KY639572.1）同源性最为接近，分别为97.39%、98.33%和98.22%。见图 2。

注：●为本次检测到的病毒序列；SEOV首尔型汉坦病毒；HTNV汉滩型汉坦病毒。 图 2 SEOV部分M基因核苷酸序列系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of nucleotide sequence of M gene fragment of SEOV

图选项

舟山群岛位于浙江省东部海岛，20世纪80、90年代HFRS病例报告较多，疫情经历了快速上升期、快速下降期和低水平散发几个时期，流行情况与浙江省的整体情况类似^[6]。作为一种自然疫源性疾病，HFRS的流行与其自然宿主动物密切相关。本研究共捕获鼠166只，鼠密度为3.42%，接近浙江省的平均鼠密度（4.21%）^[7]，岱山县本岛和定海区本岛鼠密度分别为2.49%、2.45%，与1985－2000年的平均鼠密度相近^[4]。渔山岛鼠密度高达11.22%，可能主要与渔山岛整岛搬迁后挖山填海扩容，整体开发成工业园，导致宿主动物栖息环境发生改变，同时大量工作人员驻岛作业，人口密度剧增，居住环境杂乱给宿主动物提供了良好的隐匿繁殖环境有关^[8-9]。野外鼠密度低于居民区，与姚萍萍等^[10]在浙江省天台县监测结果不同，主要原因可能与HFRS宿主动物监测结果影响因素众多，与鼠夹类型、鼠夹布放人员技术和气候条件等因素有关^[11]，提示今后应建立稳定的监测队伍持续开展监测，以保证监测数据的代表性、真实性。定海区本岛和岱山县本岛小兽以褐家鼠、黑线姬鼠和臭鼩为主，而岱山县渔山岛主要鼠种为褐家鼠，这可能与前文所述渔山岛整体搬迁后挖山填海开发为工业园，岛上地理环境和宿主动物生境较为单一有关。居民区优势鼠种为褐家鼠，野外优势鼠种为黑线姬鼠，与浙江省2016－2020年监测结果以及全国2014年监测结果一致^{[6, 12]}，优势鼠种相对稳定。

宿主动物标本汉坦病毒总阳性率为6.70%，与张连根等^[13]舟山群岛的调查结果（6.11%）相近，但高于2011年浙江省监测点结果（2.62%）^[14]，可能与岛内开发导致宿主动物栖息环境受扰，带病毒宿主动物的扩散和繁殖有关。经济发展、基础建设、人口流动等社会因素会使HFRS宿主动物习性改变，会加速汉坦病毒基因变异，以适应新环境或形成新的HFRS自然疫源地。同时，汉坦病毒也会逐渐增强在宿主和传播媒介体内的适应能力。应加强对自然疫源地，尤其是新发现疫源地宿主动物及其携带汉坦病毒监测，达到疾病防控关口前移，对降低疾病发病率、保障居民生命健康以及维护社会旅游经济的稳定发展具有重要作用。

汉坦病毒具有宿主动物特异性和地理簇聚性^[15]，本次所有汉坦病毒阳性标本均来自褐家鼠，均为SEOV型，表明褐家鼠是SEOV的主要宿主，并且提示当地暂未出现SEOV进化过程中病毒在宿主间的“溢出”现象。3份汉坦病毒阳性样本M基因核苷酸同源性较高，均为SEOV S3亚型，提示当地汉坦病毒可能为同一型别，而舟山地区HFRS的流行毒株是否以SEOV S3亚型为主，还需进一步研究。

综上所述，舟山存在以褐家鼠为传染源的HFRS疫源地，流行型别为SEOV S3亚型，是否存在其他流行型别需进一步调查；多种社会因素会改变宿主动物习性从而影响HFRS的流行，今后应加强HFRS疫源地的调查及病原学等监测，为当地HFRS的防控提供可靠依据。

利益冲突  无