革螨通常是指中气门目（Mesostigmata）革螨股（Gamasina）中的螨类。鼠类体表寄生性革螨可携带多种病原体，包括原虫、病毒和细菌^[1-2]。立克次体属（Rickettsia）是一类专性真核细胞内寄生的革兰阴性微小杆菌，其中部分种类可感染人类，引起多种急性发热性疾病，统称为立克次体病。全世界目前已发现20余种对人类致病的立克次体^[3-4]，我国已报道10余种，并且在我国分布十分广泛^[5]。人被携带立克次体的吸血节肢动物叮咬或接触其粪便而发病，常见的立克次体媒介包括虱、蚤、蜱，尚缺乏革螨携带和传播立克次体方面的研究^[2]。本课题组用分子生物学技术，检测了2021年在内蒙古自治区（内蒙古）部分地区鼠体采集的革螨中立克次体特异性核酸片段，了解革螨感染立克次体情况，期望为我国立克次体病和革螨危害的防控提供参考依据。

革螨标本来源于本课题组2021年在内蒙古地区捕获的鼠类体表，放入装有75%乙醇溶液冻存管中，1鼠1管，-80 ℃冰箱保存。采集地点包括呼伦贝尔市新巴尔虎右旗（N1）、锡林郭勒盟东乌珠穆沁旗（N2）、锡林浩特市朝克乌拉苏木（N3）和白音锡勒牧场（N4）、太仆寺旗（N5）、阿巴嘎旗（W2）、西乌珠穆沁旗（W4）、通辽市科尔沁左翼中旗和扎鲁特旗（W5）。根据参考资料和革螨形态特征鉴定革螨种类^[6-7]。

将革螨标本从乙醇溶液中取出，在75%乙醇溶液中涮洗1次，置于一次性培养皿中，使用酒精灯灼烧过的昆虫解剖针刺穿螨躯体后部，然后转移至QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒的组织裂解液中，按说明书提取基因组DNA，洗脱缓冲液（AE）加入量为50 μl。

根据文献[8]合成立克次体17 kDa蛋白基因特异性引物，用巢氏PCR扩增立克次体属特异性核酸片段，PCR引物见表 1。宝日医（TaKaRa）生物（北京）有限公司EX Taq™ Version 2.0试剂，反应体系为25 μl模板体系：加入2 μl模板DNA进行第1次PCR扩增，取1 μl第1轮扩增产物进行第2轮PCR扩增，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，阳性产物送于北京奥科生物技术有限公司进行测序。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃退火40 s，68 ℃延伸1 min，循环40次；最后在68 ℃延伸7 min。测序证实立克次体阳性的标本再用外膜蛋白A（outer membrane protein A，ompA）基因引物进行巢式PCR扩增，反应体系及反应条件同上。

表 1 本研究立克次体PCR扩增引物 Table 1 Primers for PCR amplification of Rickettsia in this study

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根据文献在美国国立生物技术信息中心（NCBI）中下载36个立克次体17 kDa基因参考序列^[10-13]和8个ompA基因参考序列^[14]。将阳性序列与NCBI中下载的立克次体17 kDa基因放在一起，用MEGA 11软件进行序列编辑、Clustal W法序列比对，用最大似然法（ML）构建系统发育树。用SPSS 24.0软件计算立克次体阳性率，用χ²检验分析其阳性率差异，以P < 0.05为差异有统计学意义。

本研究用17 kDa基因引物扩增并测序，获得11条核酸片段。用320 bp阳性序列与参考序列构建ML系统发育树（图 1）。其中3个序列（W519-1-2、N515-19-26、N515-19-15）与日本立克次体（R. japonica）和黑龙江立克次体（R. heilongjiangensis）具有较高的同源性（99.40%~100%）；4个序列与猫立克次体（R. felis）聚为一个分支，其中N319-8-1、N515-19-3为一组，与猫立克次体同源性在99.70%~99.71%；N417-25-1、N319-4-2为另一组，与猫立克次体同源性在98.50%~98.80%，2组内同源性为100%，组间同源性为99.05%；4个序列（N115-62-1、N417-28-2、N417-53-1、N519-3-7）单独聚成一支，同源性最近为R. lusitaniae。经BLAST比对其与R. lusitaniae同源性为97.79%~97.87%。

注：★为本研究获得序列；A. 基于17 kDa基因的系统发育树；B. 基于ompA基因的系统发育树。 图 1 立克次体基因序列最大似然法（ML）系统发育树 Figure 1 ML phylogenetic tree of Rickettsia gene sequence

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对17 kDa阳性样本进行ompA基因巢式PCR扩增，成功获得2个277 bp阳性序列（N515-19-26和W519-1-2），与参考序列构建ML系统发育树，阳性序列与黑龙江立克次体聚为一支，经NCBI比对与黑龙江立克次体（AF179362.2）序列同源性为100%，与日本立克次体（U43795.1）同源性为95.85%，结合17 kDa的比对结果，初步确定W519-1-2、N515-19-26和N515-19-15为黑龙江立克次体。

共检测了4科8属17种536只革螨，在其中5种共11只革螨中检测到立克次体阳性，总阳性率为2.05%，其中阳性率最高的是寄螨属未定种1，阳性率为12.50%（3/24），其次是东北血革螨为8.89%（4/45），仓鼠真厉螨为3.39%（2/59），北野血革螨为2.22%（1/45），格氏血厉螨为0.68%（1/147）（表 2）。运用Fisher确切概率法对不同革螨立克次体阳性率进行检验，差异有统计学意义（P=0.005）。

表 2 内蒙古地区鼠体革螨立克次体阳性率 Table 2 Positive rate of Rickettsia in gamasid mites on the body surface of rodents in Inner Mongolia

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黑龙江立克次体阳性的革螨包括东北血革螨和仓鼠真厉螨，宿主是达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）和五趾跳鼠（Allactaga sibirica），分布在锡林郭勒盟太仆寺旗和通辽市扎鲁特旗。猫立克次体近缘种阳性的革螨包括东北血革螨、北野血革螨和仓鼠真厉螨，其宿主均为达乌尔黄鼠，分布在锡林郭勒盟锡林浩特市、白音锡勒牧场和太仆寺旗。立克次体未定种阳性革螨包括格氏血厉螨和1种寄螨属种类的第二若螨，其宿主为布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）和达乌尔黄鼠，分布在白音锡勒牧场、新巴尔虎右旗和太仆寺旗。见表 3。

表 3 内蒙古地区立克次体阳性革螨的寄生鼠类及采集地点 Table 3 Species and collection sites of parasitic rodents with gamasid mites positive for Rickettsia in Inner Mongolia

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立克次体属微生物为节肢动物体内共生菌，已命名45种^[15]，我国发现10余种^[16-19]。根据进化关系立克次体属可分为祖先群、斑疹伤寒群、斑点热群和过渡群，除祖先群中个别种类以外都以节肢动物为宿主^[20]。世界上目前已发现20余种对人类致病的立克次体^[3-4]。立克次体由虱、蚤、蜱、革螨等吸血节肢动物叮咬而传播给人或动物，其中斑点热群立克次体种类最多，此群均以蜱为其宿主和传播媒介。螨立克次体（R. acari）属于过渡群，是已知唯一以螨为传播媒介的立克次体，其传播媒介是血红异皮螨（Allodermanyssus sanguineus），属于皮刺螨总科（Dermanyssoidea）皮刺螨科（Dermanyssidae）。在西方盲走螨（Metaseiulus occidentalis）[革螨股植绥螨科（Phytoseiidae）]中曾检出立克次体，该螨是一种捕食螨^[21]。Moro等^[2]综述既往皮刺螨总科革螨携带和传播病原体的研究，在以哺乳动物为主要宿主的皮刺螨科、巨刺螨科（Macronyssidae）和厉螨科（Laelapidae）中的部分种类中曾检出多种人兽共患传染病病原体，但立克次体属只有4例报道，除上述螨立克次体，还有普氏立克次体（R. prowazeki）、未鉴定种类立克次体和斑点热群立克次体。Reeves等^[22]应用PCR技术检测埃及的褐家鼠（Rattus norvegicus）和黑家鼠（R. rattus）体表的柏氏禽刺螨（Ornithonyssus bacoti）中立克次体的17 kDa基因，其阳性率达6.70%，其中1株与澳大利亚立克次体（R. australis）序列同源性为99.00%，另外5株与蚤中检测出的序列完全相同。在我国台湾省的褐家鼠体表革螨中曾检出猫立克次体^[23]。但我国革螨种类多，分布广，其中仅皮刺螨总科革螨就已记录356种^[24]，其中多数以鼠类为寄生宿主，在人居环境中游离的革螨可以叮咬人，已经证实格氏血厉螨可传播肾综合征出血热（HFRS）病毒^[25]。

本研究首次在5种革螨中发现3种立克次体，包括黑龙江立克次体、猫立克次体近缘种以及1种未知立克次体。黑龙江立克次体属于斑点热群立克次体，1982年首次在我国黑龙江省绥芬河市采集的嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）和森林革蜱（Dermacentor silvarum）中发现，已证实其对人具有致病性，世界卫生组织将其命名为远东斑点热（又称黑龙江蜱传斑点热）。黑龙江立克次体已证实由蜱传播，在我国东北、华北、华东和华南地区以及俄罗斯远东地区、日本、泰国的鼠类和多种蜱均曾有阳性报道，但未见其他节肢动物携带该种立克次体的报道^{[14, 16, 26-32]}。本研究从内蒙古锡林郭勒、通辽市的东北血革螨（达乌尔黄鼠）和仓鼠真厉螨（五趾跳鼠）中检出黑龙江立克次体。2种革螨广泛分布于东北、华北、西北和西南地区，其在立克次体传播中的作用需要进一步研究。

猫立克次体属于过渡群立克次体，可引起人类疾病，近几年在我国有不止1例人感染猫立克次体并致病的报道^[33-34]。猫立克次体主要宿主和传播媒介是猫栉首蚤（Ctenocephalides felis），与该蚤一样呈世界性分布，但是在其他蚤以及蜱、螨、木虱中也曾检出，具有多种宿主。我国台湾省在褐家鼠体表革螨中检出过该菌，其17 kDa同源性为100%。本研究发现有4株立克次体17 kDa序列可分为2组，与猫立克次体同源性分别为99.70%~99.71%和98.50%~98.80%，2组之间同源性为99.05%。前者为猫立克次体可能性较大，而后者可能是猫立克次体的近缘种，由于缺少其他证据，暂认为4株均是猫立克次体近缘种。

近年来用分子生物学检测方法已发现多种未知的立克次体，说明作为节肢动物体内共生菌种的立克次体远不止现有的已知种类。本研究发现1种17 kDa序列与R. lusitaniae同源性达97.93%。R. lusitaniae属于斑点热群立克次体，在美洲、欧洲、非洲和中国软蜱（或软蜱宿主鸽子）中检出^[35]。本种在布氏田鼠和达乌尔黄鼠体表的格氏血厉螨和1种寄螨属种类的第二若虫中检出，该寄螨与鼠类的关系尚不了解。格氏血厉螨宿主广泛，包括多种家鼠，全国均有分布，是HFRS病毒的传播媒介，如果证实其携带的立克次体可对人致病，其危害应引起重视^{[6, 25]}。

我国内蒙古东部地区与俄罗斯、蒙古国接壤，东邻东北3省、南接华北，已在该地区蜱中发现塔拉塞维奇立克次体（Candidatus R. tarasevichiae）、内蒙古立克次体（R. mongolitimonae）、劳氏立克次体（R. raoultii）和黑龙江立克次体^{[13, 26-27]}。本研究在此区域采集的鼠体革螨中除了发现黑龙江立克次体外，还检测到猫立克次体近缘种和1种未知的立克次体，采集区域包括锡林郭勒盟、呼伦贝尔和通辽市，说明上述区域内革螨也可自然携带多种立克次体。然而目前对革螨体内的立克次体只限于核酸检测，且局限于个别基因的扩增比对，部分已获得序列尚不能确定种类。因此需对革螨中立克次体开展多基因扩增测序，或通过立克次体分离培养和基因组测序来确定种类，以便对革螨在立克次体保存、传播中的作用以及可能对人类和其他动物的危害开展深入研究。

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