屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，Der p）是引起过敏性疾病最常见的螨种之一^[1-5]，世界卫生组织/国际免疫联合会官网（www.allergen.org）已公布其过敏原单组分32个，即：Der p 1~11、13~15、18、20、21、23~26、28~33和36~40。患者可能因其中的一种或几种过敏。儿童变应性鼻炎诊断和治疗指南（2022年，修订版）中提到“告知患儿及其监护人接受变应原检查的必要性和主要方法，对检查结果进行合理解读，结合患儿的临床表现，制定有针对性的个体化预防措施^[6]”。精准检测屋尘螨变应原引起的过敏性疾病可为制定个体化防治提供依据。本研究通过基因克隆、表达、纯化获得了Der p 33重组蛋白，为单组分诊断试剂制备提供原料，结果报告如下。

屋尘螨为本室人工培养，培养条件为（25±1）℃，相对湿度（75±5）%，屋尘螨培养基为酵母粉和鱼粉按照一定比例混合配制；载体pET-28a（+）和大肠埃希菌（Escherichia coli）Rosetta 2（DE3）plysS均为无锡市人民医院临床研究中心保存。

屋尘螨变应原特异性阳性患儿血清（特异性IgE > 0.35 kU/L）和健康人血清来自无锡市人民医院临床研究中心，所有血清中乙肝表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎抗体（抗-HCV抗体）、人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV抗体）和梅毒螺旋体抗体（抗-TP抗体）用化学发光免疫分析法均为阴性。所有参与者均知情同意。

BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶、大肠埃希菌感受态细胞JM109（Code No.9052）、RNAiso Plus kit（Code No.9108Q）、PrimeScript^TM RT-PCR Kit（Code No.RR014A）、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（Code No.9762）、Tks Gflex DNA Polymerase Kit（Code No. R060A）为宝生物工程（大连）有限公司产品；In-Fusion^® HD Cloning Kit（Clontech Code No.639648）为Clontech公司产品；HiTrap TALON crude、TALON Superflow（Code No. 28953766）为美国GE公司产品；透析膜SnakeSkin Dialysis Tubing 10000 MWCO（Cat No.68035 Lot No.MH160055）为美国Thermo Scientific产品；HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG来自Zymed Laboratories（CA，USA）。

RNAiso Plus kit提取屋尘螨总RNA，反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）合成cDNA。反应体系20 µl，包括1 µl Total RNA、1 µl随机6核苷酸引物（20 µmol/L）、1 µl Oligo dT Primer（2.5 µmol/L）、1 µl dNTP Mixture（10 mmol/L）和6 µl RNase-free水。65 ℃ 5 min，冰浴2 min后加入4 µl 5× PrimeScript RT buffer、0.5 µl核糖核酸酶抑制剂（40 U/µl）、0.5 µl PrimeScript RTase和5 µl RNase-free水。反应条件为30 ℃ 10 min、45 ℃ 30 min、70 ℃ 15 min。

用Tks Gflex DNA Polymerase扩增cDNA，正向引物：5'-TCGACTAATGTAATGGCAATCA-3'；反向引物：5'-TTGTTGTTGTTGTTCTATTTCG-3'。首次PCR反应体系50 µl，包括1 µl cDNA模板、25 µl 2×Gflex PCR buffer（Mg²⁺，dNTP plus）、1 µl Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 units/µl）、正反向引物各1 µl、21 µl dH₂O，反应条件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、58 ℃ 15 s、68 ℃ 60 s，35个循环。以首次PCR产物为模板，再次进行PCR扩增。正向引物InF：5'-AATGGGTCGCGGATCCATGCGTGAATGTATATCATTAC-3'（下划线部分是Bam H Ⅰ酶切位点），反向引物InR：5'- TGCTCGAGTGCGGCCGCTCAAAATTCTTCACCATC- CTG-3'（下划线部分是Not Ⅰ酶切位点）。反应体系50 µl，包括1 µl第1次PCR的产物、25 µl 2×Gflex PCR buffer（Mg²⁺，dNTP plus）、1µl Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 units/µl）、InF和InR各1 µl、21 µl dH₂O。反应条件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、58 ℃ 15 s、68 ℃ 60 s，30个循环。取5 µl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带。

MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0回收纯化目的片段后，用Bam H Ⅰ/NotⅠ酶对载体pET-28a（+）进行酶切，将回收的目的片段与载体片段进行In-Fusion反应，取反应液2.5 µl热转化大肠埃希菌感受态细胞JM109中，37 ℃培养过夜，挑选阳性菌落植菌，抽提质粒使用引物T7、T7 terminator、P测序。引物P：5΄-AAAGTAAACAACATGCCATA-3΄。

取测序正确的重组质粒pET-28a（+）-Der p 33转化大肠埃希菌（Rosetta 2（DE3）plysS，空质粒pET-28a（+）为对照进行同样的操作。挑选单菌落接种于含有卡那霉素（50 ug/ml）和氯霉素（34 μg/ml）的LB培养基中，37 ℃培养过夜。第2天按2%的接种量接种于5 ml含有卡那霉素（50 μg/ml）和氯霉素（34 μg/ml）的LB培养基中。37 ℃培养到待细菌处于对数生长期[吸光度（A）600值约为0.6]时，加入150 mmol/L IPTG 33 μl至终浓度为1 mmol/L进行诱导。继续培养4 h后，集菌超声破碎，菌体破碎液经12 000 r/min（离心半径6 cm）离心5 min。分别取8 μl全细胞裂解液、上清、沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），鉴定表达情况。

重组菌经大量诱导表达，表达菌经处理后，用GE HiTrap TALON crude，5 ml TALON Superflow柱层析纯化目的蛋白后，收集目的蛋白。取少量进行SDS-PAGE电泳并以BSA标准品浓度为参考。透析后，取样品进行SDS-PAGE电泳分析。将未染色的转硝酸纤维素膜（PVDF膜）以Pena-His Antibody作为一抗，HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG作为二抗进行免疫印迹实验。

纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜上，将PVDF膜置于12 ml含1.5% BSA的封闭缓冲液中，37 ℃封闭1 h。向反应液中加入1∶10稀释的屋尘螨过敏患儿血清为一抗，反应1 h。吐温-三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffered saline with Tween 20，TBST）清洗1次；三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris buffer solution，TBS）清洗2次。加入1∶4 000稀释的Ms mAb to Hu IgE（HRP）抗体溶液反应1 h。同上清洗后加入TrueBlue Peroxidase Substrate显色1 min后观察结果。

原始测序结果5′和3′端的酶切位点去除后，DNAMan 6.0软件将核酸序列翻译为氨基酸序列，ProtParam tools预测其理化性质。Signal 4.1服务器预测其信号肽序列。NetPhos 3.1服务器预测磷酸化位点，SOPMA服务器预测其二级结构。

将扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，见1条约1 400 bp的条带，与理论值相符。阳性克隆质粒测序验证结果见图 1，从起始密码子ATG到终止密码子TGA共1 383 bp，与PCR产物一致，编码460个氨基酸。与GenBank公布的Der p 33基因序列（No. AUX14773）一致性为100%，与GenBank（No. MH618513）上的基因序列进行比对，具有82.38%的同源性。Der p 33表达载体构建成功。

图 1 屋尘螨变应原Der p 33基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列 Figure 1 Nucleotide sequence of Der p 33 gene from Dermatophagoides pteronyssinus and its deduced amino acid sequence

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重组菌诱导表达的目的蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示，相对分子质量（M_r）在44 300和66 400之间可见诱导后全细胞裂解液、超声破碎后沉淀均有较粗条带，且M_r符合预期大小（图 2）。大量诱导表达后，表达菌处理后使用GE HiTrap TALON crude，5 ml TALON Superflow柱层析纯化重组蛋白。收集目的蛋白，使用ImageMaster 1D version 3.0解析软件进行定量分析。共获得纯化重组蛋白10 ml，浓度为0.01 mg/ml、总量0.1 mg、蛋白纯度 > 95.00%。

注：Mr 相对分子质量；M表示蛋白质marker；1 pET-28a（+）全细胞；2 pET-28a（+）上清；3 pET-28a（+）沉淀；4 pET-28a（+）-Der p 33全细胞裂解物；5 pET-28a（+）-Der p 33上清；6 pET-28a（+）-Der p 33沉淀；箭头所示处为诱导表达的目的蛋白。 图 2 质粒pET-28a（+）-Der p 33诱导表达产物聚丙烯酰胺凝胶电泳 Figure 2 SDS-PAGE of induced expression of the pET-28a(+)-Der p 33 plasmid

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以16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿血清作一抗进行免疫印迹实验，第7、11、14号血清样本有阳性条带，该重组蛋白阳性率为18.75%（3/16）。对照组4例无阳性。见图 3。

注：Mr相对分子质量；M预染色蛋白质标准品；1~16屋尘螨过敏患者阳性血清与重组蛋白反应条带；17~20健康人血清对照。 图 3 免疫印迹实验检测屋尘螨变应原Der p 33重组蛋白与IgE的结合活性 Figure 3 IgE-binding activity of the recombinant protein of Der P 33 from Dermatophagoides pteronyssinus by Western blotting analysis

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Signal 4.1服务器预测其不存在信号肽结构。ProtParam tools分析M_r为51 432.81，理论等电点（Theoretical pI）为4.95，氨基酸构成中Glu（e）最多（占比8.48%），其中带负电残基（Asp+Glu）63个，带正电残基（Arg+Lys）39个；不稳定系数（instability index，II）为40.53；亲水性平均系数（Grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.269，为亲水性蛋白。NetPhos3.1服务器预测分析Der p 33磷酸化位点显示：有17个丝氨酸激酶（第37、47、48、50、51、54、56、146、157、164、171、247、284、293、395、406、425位氨基酸S），13个苏氨酸激酶（第43~45、79、100、115、185、196、300、313、355、367、387位氨基酸T）及7个酪氨酸激酶（第73、191、216、230、288、405、438位氨基酸Y）。SOPMA服务器预测其二级结构包括α-螺旋（188 aa，40.87%）、β-转角（33 aa，7.17%）、延伸链（80 aa，17.39%）和无规则卷曲（159 aa，34.57%）。见图 4。

注：h α-螺旋；t β-转角；e延伸链；c无规则卷曲。 图 4 屋尘螨变应原Der p 33二级结构预测结果 Figure 4 The predicted secondary structure of Der p 33 from Dermatophagoides pteronyssinus

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据报道，尘螨的分泌物、排泄物和降解产物可引起呼吸系统过敏性疾病如过敏性哮喘、鼻炎等^[7]。Der f 33已被学者克隆、表达和纯化^[8]。研究发现，屋尘螨和粉尘螨变应原蛋白同源性至少达80%以上^[9]。即使二者具有一定的序列相似，但并非同一物种，粉尘螨过敏原无法替代屋尘螨过敏原。明确致敏原对过敏性疾病的预防、诊断及治疗均至关重要。本文克隆的Der p 33序列与GenBank（No.MH618513）上的基因序列进行比对，具有82.38%的同源性，表明由于地理环境和气候的不同，Der p 33基因序列存在一定的地域差异性。因此基于不同地区变应原的基因多样性，建立高效表达重组过敏原Der p 33的表达载体，进行大量表达和纯化，对研制高纯度的变应原疫苗以及分子免疫诊断有重要意义。

目前变应原特异性检测方法主要有皮肤点刺试验或皮内试验等体内试验，经过鼻黏膜、结膜或气道器官激发实验，血清特异性IgE检测、斑贴试验等^[10]。临床应用最广泛的血清特异性IgE检测安全、有效、便捷。目前商品化的血清特异性IgE检测试剂多采用螨类粗提物作为抗原，由于提取方法、后期处理及保存方法的差异，可能导致粗提物中部分组分丢失，出现假阴性结果。此外，蛋白粗提取物中可能与过敏原有相似抗原表位引起交叉反应，导致假阳性的结果。因可能含有毒性蛋白，故安全性欠佳^[11-12]。因此，了解屋尘螨的变应原成分，制备变应原单组分重组蛋白可为屋尘螨过敏性疾病的快速诊断提供技术手段，为脱敏治疗选择合适的过敏原单组分^[13-14]。屋尘螨粗提物中的多种成分可结合人血清IgE抗体，但患者的发病原因可能只与其中的某种或某些成分有关。重组变应原单组分具备理化性质和免疫学特征明确等优点。基于单组分建立的检验方法，既可精准检测过敏性疾病患者是因哪种组分或是哪些组分致敏，还可鉴别出交叉反应中的变应原单组分。该重组蛋白用于免疫印迹实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿，阳性率为18.75%。本研究获得的重组蛋白拟解决现有尘螨引起的过敏性疾病无法得到精准医学检测的问题。

生物信息学将生命科学与计算机技术结合，有助于进一步认识生物的性质特征^[15]。随着生物信息学的快速发展，利用生物信息学软件对蛋白质结构预测的结果与实际偏差越来越小。生物信息学已成为过敏原研究的重要工具。本研究通过生物信息学方法分析Der p 33的氨基酸序列，表明Der p 33是一种亲水蛋白，有17个丝氨酸激酶，13个苏氨酸激酶及7个酪氨酸激酶。其二级结构由α-螺旋（40.87%）、β-转角（7.17%）、延伸链（17.39%）和无规则卷曲（34.57%）组成。这些生物信息学分析为进一步探讨该变应原免疫生物学特征提供了方向。

利益冲突  无