蜚蠊是常见的病媒生物，可携带十几种病原体，传播多种肠道疾病^[1]。蜚蠊可以通过贸易、运输、旅游等方式从原产地扩散或者入侵到新的地区和场所，交通工具、集装箱是蜚蠊扩散的主要载体，由于各国口岸环境卫生、管理状况不同，使得蜚蠊成为口岸卫生检疫关注的对象^[2]。

口岸输入性蜚蠊的种类鉴定是口岸卫生检疫的重要工作，2016年在广东口岸一艘大型国际集装箱运输船上检测出60余万只活体蜚蠊，其中大部分为德国小蠊（Blattella germanica），少量为美洲大蠊（Periplaneta americana）^[3]，2016年中山口岸首次截获国内未见分布种斯科特卡蠊（Cartoblatta scorteccii）^[4]，2017年中山口岸在从圭亚那进口原木的集装箱内检出国内未见分布种染色硬翅蠊（Ceratinoptera picta）^[5]。这些口岸输入性蜚蠊种类的检出为口岸病媒生物检疫和消杀工作提供了依据，可预防相关病原体的传播和外来入侵物种的扩散。

口岸输入性蜚蠊分类主要依靠形态学和分子生物学的方法进行种类鉴定，由于形态鉴定局限于成虫完整的形态特征，在口岸检疫中常截获检疫对象是若虫或其残肢，难以从形态上进行种类鉴定，因此分子生物学鉴定在口岸输入性蜚蠊的鉴定中显得尤为重要。本研究利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因作为分子标记，结合形态学的方法对中山口岸截获的2只蜚蠊进行种类鉴定。

2011年11月在中山市中山港航运码头中从尼日利亚进口原木集装箱内截获雌性蜚蠊和蜚蠊若虫各1只。将雌性蜚蠊的第7背板（T7）后部分切下（如果标本干硬，则需要回软），放入含有10% NaOH的离心管中，70 ℃消化大约30 min，直至肌肉组织完全溶解，取出用清水洗涤几次，把残留的NaOH清洗干净。使用解剖针在体视显微镜下进行尾器解剖，解剖后的尾器保存在装有50%甘油水溶液的离心管中。标本其余部分制成针插标本，若虫直接做成针插标本。观察标本保存在国家医学媒介生物监测重点实验室（广东）的标本储藏室。

使用体视显微镜对雌性蜚蠊标本进行观察，按照《中国东南部地区的蜚蠊》中的检索表进行检索^[6]，并依据Shelford^[7]和Borg^[8]对标本进行形态鉴定并描述其形态特征。本文使用的形态特征术语主要参考Roth^[9]和Klass^[10]的描述，翅脉特征术语主要参考Li等^[11]及Kukalová-Peck和Lawrence^[12]的描述。

取雌性蜚蠊和蜚蠊若虫的后足跗节用于基因组DNA的提取，按TIANGEN公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒的使用手册进行基因组DNA提取。

PCR的扩增采用COⅠ^[13]基因片段进行扩增，引物具体信息见表 1，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂从宝生物工程（大连）有限公司购置。

表 1 本研究所用引物序列信息 Table 1 Information of the Primers in this study

表选项

PCR反应体系（50 μl）：10×EX-Taq buffer 5 μl，正向引物（20 μmol/L）2 μl，反向引物（20 μmol/L）2 μl，dNTP（10 mmol/L）2 μl，EX-Taq DNA聚合酶（50 U）0.5 μl，模板DNA 3 μl，无菌水定容到50 μl。PCR扩增条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR扩增完成后，经1%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统分析扩增产物，对有特异性扩增的PCR产物直接送往天一辉远基因科技有限公司（广州）测序。测序后用DNAMAN v9进行序列分析处理，去除测序序列两端引物得到有效序列，并进行同源性分析，提交到GenBank进行BLAST比对分析，用MEGA 6.0软件分析处理有效序列并采用邻接（neighbor-joining，NJ）法生成NJ进化树^[14]。

雌性蜚蠊形态学鉴定为小异甲蠊（Diplopterina parva）。形态描述如下：体长9.5 mm，后翅长8.6 mm，前胸背板（长×宽）：2.2 mm×3.3 mm。体深红褐色，表面光滑，头顶外露，具单眼，脸黑，唇基色淡，触角前13节深褐色。前胸背板梯形，后缘圆弧形，具许多细小刻点。前翅半革质，具许多细小刻点，不超过腹部末端。前翅具11根前缘脉，肘脉区网状，臀域具8根腋脉（图 1E）。后翅膜质，肘脉具7根分枝；三角域大，占整个后翅的2/5；中脉在基部分成2条平行的分枝；三角域具主翅脉的延伸脉，三角域被分为上下两部分（图 1C、D）。休息时三角域折叠收起。腹部背板深红褐色，腹部腹板红褐色。肛上板横宽，对称，后缘中间具三角形凹陷（图 1I）。下生殖板后缘圆弧形，中间呈三角形突出（图 1K）。尾须小，3节。前足股节B₀型（图 1F）。各足股节无膝刺，各足胫节的刺粗大（图 1H、J、L），刺内侧具两排小齿（图 1M），后足跗节具爪垫，爪对称，无中爪垫（图 1G）。

注：A 雌虫，背面观；B 雌虫，腹面观；C 左后翅；D 右后翅；E 前翅；F 前足股节；G 爪；H 前足胫节；I 肛上板，背面观；J 中足胫节；K 下生殖板，背面观；L 后足胫节；M 刺具小齿。 图 1 中山港口岸从尼日利亚集装箱截获的雌性小异甲蠊特征图 Figure 1 Characteristics of female Diplopterina parva intercepted in the imported containers from Nigeria at Zhongshan port

图选项

由于蜚蠊若虫缺乏形态学相关资料，无法对其进行形态学鉴定，需要做分子生物学鉴定，图 2为蜚蠊若虫。

注：A 若虫背面观；B 若虫腹面观。 图 2 中山港口岸集装箱截获的1只蜚蠊若虫特征图 Figure 2 Characteristics of a cockroach nymph intercepted in the import containers from Nigeria at Zhongshan port

图选项

查阅异甲蠊属相关资料，目前在全球仅报道2种异甲蠊属昆虫，检索表^{[7-8, 15-16]}如下：

1. 前翅前缘脉11或12根，肘脉区网状，臀域具8根腋脉。后翅肘脉具7根分枝；三角域占整个后翅的2/5

                  ……………………………………………………………………………………小异甲蠊D. parva（Borg，1902）（图 3）

注：A 小异甲蠊后翅（仿Shelford）；B D. conradti后翅（仿Shelford）。 图 3 小异甲蠊和Diplopterina conradti的后翅 Figure 3 Wings of Diplopterina parva and D. conradti

图选项

前翅前缘脉15根，肘脉9根，肘脉区呈扇形。后翅肘脉13根，三角域占整个后翅的1/4 ………… D. conradti（Shelford，1908）

测序后得到的雌性蜚蠊（OM242957.1）和蜚蠊若虫（OM242958.1）的COⅠ有效序列为658 bp，把这2条序列分别提交到GenBank进行BLAST比对分析，2只蜚蠊都未能比对出匹配度超过98.00%的同源物种，但是2条序列在DNAMAN中进行同源性比对，匹配度达到98.48%，如图 4所示，可判定雌性蜚蠊和蜚蠊若虫为同源性物种，结合雌性蜚蠊形态鉴定的结果，该蜚蠊若虫为小异甲蠊若虫。

图 4 中山港口岸集装箱截获的2只蜚蠊细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列相互比对结果 Figure 4 Comparison results of COⅠ sequences of two cockroaches intercepted in the import containers from Nigeria at Zhongshan port

图选项

从GenBank中下载硕蠊科甲蠊属的Diploptera punctata、Di. minor、Di. maculata，大光蠊属的Rhabdoblatta marginata、R. nigrovittata、R. sinuata，鳖蠊科真地鳖属的Eupolyphaga sinensis、Ep. yunnanensis，真鳖蠊属的Eucorydia dasytoides、Ec. yasumatsui，异爪蠊科巴蠊属的Balta notulata、B. jinlinorum，硬翅蠊属的Ceratinoptera olmeca、C. picta的COⅠ序列和雌性蜚蠊序列sample 1，蜚蠊若虫序列sample 2共同构建NJ进化树，如图 5所示。雌性蜚蠊与蜚蠊若虫遗传距离 < 0.02且置信度为100，支持这2只蜚蠊为同一物种，并聚于硕蠊科一支，鳖蠊科与异爪蠊科各自聚为一支。

图 5 基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列构建的小异甲蠊NJ进化树 Figure 5 Phylogenetic tree of Diplopterina parva constructed by the NJ method based on COⅠ sequences

图选项

雌性蜚蠊通过形态学鉴定为小异甲蠊，若虫因缺乏分类鉴定资料无法进行形态学鉴定，将2只蜚蠊COⅠ序列进行对比，匹配度 > 98.00%，表明2只蜚蠊为同一物种。2只蜚蠊的COⅠ序列在GenBank数据库中比对，未能比对出匹配度高于98.00%的同源性物种，说明由于该物种在数据库中缺乏序列信息，不能通过分子生物学的结果直接鉴定2只蜚蠊的种类，通过形态学与分子生物学结果结合的方法能有效鉴定2只蜚蠊均为小异甲蠊。物种的形态学分类鉴定是种类鉴定的基础，分子生物学鉴定可以作为辅助手段。

小异甲蠊隶属于蜚蠊目（Blattodea）硕蠊总科（Blaberoidea）硕蠊科（Blaberidae）异甲蠊属，主要分布于非洲的几内亚和喀麦隆。1963年，Princis^[15]建立异甲蠊属，归入Diplopteridea亚科下，将Paraplecta conradti（Shelford，1907）和Eustegasta parva Borg，1902归并为异甲蠊属物种，以小异甲蠊（Borg，1902）作为该属的模式标本，同时证明P. aethiopica Shelford，1907为小异甲蠊的同物异种名。2003年，Roth^[9]将异甲蠊属移出Diplopteridea亚科，独立其他亚科存在，其亚科地位还有待后续研究确定。

输入性病媒生物及其传播的各种疾病是备受关注的公共卫生问题，我国病媒传播疾病占法定报告传染病种类近1/3，病媒生物是虫媒传染病传播中非常重要的一个环节，病媒生物的控制也是虫媒传染病控制的重要手段^[17]。口岸病媒以及病原体检疫和监测能有效预防控制传染病在国际间的传播和流行，从源头上降低了输入性病媒生物与传染病对国家造成的损失^[18]。新发传染病不断出现，加剧了检疫的压力和风险，而目前口岸截获的病媒生物有部分为若虫或者残缺的病媒生物肢体，用传统的形态学方法难以进行物种鉴定，分子生物学鉴定技术弥补了形态学鉴定的不足^[19]，形态学与分子生物学相结合的方法成为输入性病媒种类鉴定的新方向，为口岸检疫提供了有力保障。

近年来全球贸易保护主义有抬头的趋势，输入性病媒生物问题也常被某些国家作为非关税技术壁垒和措施用于本国政治和经济贸易，对我国相关产业和公司造成经济损失和负面影响^[20]。为适应新形势下的检疫工作要求，应当积极发展和提高输入性病媒生物的检测、鉴定技术，进一步提高防控水平和质量，依靠先进技术严把国门，促进对外贸易健康发展。

利益冲突  无