精氨酸激酶（arginine kinase，AK），是一类在生物体内催化三磷酸腺苷（ATP）转移高能磷酸键的磷酸原激酶，广泛存在无脊椎动物、原生动物和细菌中^[1-6]，能够参与精氨酸和ATP的可逆反应，产生MgADP和磷酸精氨酸，从而在能量代谢和储存有着重要作用^[7]。AK是昆虫体内唯一有效的磷酸原激酶，不仅在能量代谢、免疫调节上扮演重要的角色，而且在逆境胁迫中发挥作用，已逐渐成为害虫防治的新型高选择性潜在靶标^[8]。温度是昆虫正常生长发育环境的重要因子，已有较多关于温度胁迫下AK的响应研究。在逆境胁迫下褐飞虱（Nilaparvata lugens）AK功能研究中，与未沉默AK的对照组相比，沉默AK组的褐飞虱成虫高温下显著加快了死亡速率^[9]。不同温度处理黄野螟（Heortia vitessoides）4龄幼虫，发现高、低温均会使黄野螟AK基因HvAK表达量上调，在4 ℃温度下HvAK的表达上调16.63倍^[10]。通过高低温度、吡丙醚、百草枯、过氧化氢、维生素C、氯化镉、辛硫磷等处理中华蜜蜂（Apes cerana），发现均会使中华蜜蜂AK基因AccAK的反转录水平显著提高^[11]。在西花蓟马（Frankliniella occidentali）和二化螟（Chilo suppressalis）研究中发现，经高温、低温处理后，2种AK mRNA水平均上调^[12]。以上结果表明在昆虫生存的不利条件下，通过调节AK的表达可以缓解逆境胁迫下的应激能量需求。对于蚊虫来说，温度和湿度是关键的环境因子，有研究表明温度、降雨量和相对湿度是影响蚊虫密度的主要气候因素^[13]。越冬是蚊虫应对气候变化产生的一种生理适应现象，吴治明和褚宏亮^[14]在对江苏省城市环境蚊虫越冬状况调查中发现，淡色库蚊（Culex pipiens pallens）的成蚊可在平均温度为9.71 ℃，平均湿度为65.90%的场所越冬。为了明确AK是否参与蚊虫对温度和湿度逆境的适应，比较2种AK对逆境胁迫的响应特性，本文通过模拟淡色库蚊生存环境中温度和湿度的逆境胁迫，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测2种AK基因CpAK1和CpAK2的mRNA和蛋白水平，比较CpAK1和CpAK2对逆境胁迫的响应，为进一步了解2种AK的功能以及蚊虫对逆境胁迫的适应机制奠定基础。

淡色库蚊品系引自江苏省疾病预防控制中心，扬州大学园艺与植物保护学院养虫室连续多代饲养，饲养条件：温度（27±2）℃、湿度（70±5）%、光周期12 h∶12 h，幼虫期饲喂全营养鼠粮，成虫期饲喂5%~10%蔗糖溶液，用小白鼠给血繁殖。

HiScript^® Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购于诺唯赞生物公司，Tissue Protein Extraction Kit试剂盒购于康为世纪公司，10%TGX FastCast Acrylamide Kit、过硫酸氨（APS）、HRP-coupled secondary anti-rabbit、anti-mouse antibodies、Tanon™ High-sig ECL Western Blotting Kit、TRIZol^® reagent，75%乙醇溶液、三氯甲烷、异丙醇、RNase-free ddH₂O。

一抗（2种AK抗体）：分别以CpAK1的C端CIYDISNKRRMGLTE氨基酸序列和CpAK2的C端MASREAFRKYLEGAC氨基酸序列，合成肽段作为抗原注射进兔体内进行多克隆抗体制备，相关制备过程由金斯瑞生物科技公司完成。

二抗：Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody，购于索莱宝生物公司。

ChemiDoc™ Touch Imaging System、CFX96™ real-time PCR Systems、PCR扩增仪Mastercycler nexus GX2、5424R高速冷冻离心机、微量移液器、DYY-6C型电泳仪、DYCP-31CN电泳槽、捷达凝胶成像系统、RXZ型智能人工气候箱。

依据李菊林等^[15]2017年的研究，选取0~5和35~40 ℃进行预实验，发现超过38 ℃和低于4 ℃的处理蚊虫死亡率较高，确定38和4 ℃为胁迫处理温度。选取相对湿度10%、20%和30%进行预实验，发现低于20%的处理死亡率较高，确定相对湿度20%和人工气候箱能设置的最高湿度100%为胁迫处理湿度。

收集羽化3 d后雌性淡色库蚊于干净蚊笼中，实验组置于温度38 ℃恒温气候箱和4 ℃冷藏柜中，保持其他饲养条件不变，同时以正常饲养条件下雌成蚊作为对照组。分别在1、2、6和12 h时收样，每个时间段的处理组设置3个重复，每个重复10只淡色库蚊。

收集羽化3 d后雌性淡色库蚊于干净蚊笼中，置于恒温气候箱中，设置温度25 ℃，相对湿度20%或100%，在1、2、6和12 h时收集样品，同时设立正常饲养条件下雌性成蚊为对照组，每个时间段的处理组设置3个重复，每个重复10只淡色库蚊。

采用Trizol法对淡色库蚊样品进行RNA提取，将获得的RNA保存于-80 ℃超低温冰箱备用。参照cDNA合成试剂盒（TransScript^®Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）步骤，合成qPCR备用的第一链cDNA模板，保存于-20 ℃。

根据已获得CpAK1（MZ491206）和CpAK2（MZ491207）基因序列设计特异性荧光定量引物，以淡色库蚊的肌动蛋白β-actin基因作为内参基因，合成特异性引物见表 1。

表 1 用于CpAK1和CpAK2实时荧光定量PCR扩增的引物 Table 1 Primers used for RT-qPCR of CpAK1 and CpAK2

表选项

荧光定量10 μl的反应体系：2×SYBR Premix ExTaq Ⅰ 5 μl、正反向引物各0.4 μl、cDNA 1 μl、ddH₂O 3.2 μl。将配置好的溶液，短暂离心混匀。使用CFX96™荧光定量PCR仪（Bio-Rad），反应步骤如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，65 ℃延伸5 s，循环20次。扩增反应的特异性可以通过熔解曲线分析检测。

使用Tissue Protein Extraction Kit试剂盒提取蛋白。实验前取出Tissue Protein Extraction Reagent进行预冷，主要步骤如下：①收集每个时间段逆境处理的淡色库蚊，随后立即进行虫体蛋白提取；②配制1×工作液，取适量预冷的Tissue Protein Extraction Reagent，抽提蛋白2~3 min，按照1∶99比例加入Protease Inhibitor Cocktail；③根据0.1 g组织加入1 ml 1×工作液的比例加入足量工作液，转移至灭菌后匀浆器中，在冰上匀浆处理，随后冰上孵育20 min；④10 000×g离心20 min，转移上清液至新的离心管中，使用BCA试剂盒，进行蛋白浓度测定，稀释同浓度蛋白进行蛋白活性测定。

按照10% TGX FastCast Acrylamide Kit（Bio-Rad）说明书制蛋白胶；将提取的蛋白沸水中煮沸变性10 min，随后蛋白上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）；随后在冰上将蛋白胶置于转膜装置，定流200 mA，90 min；用蒸馏水洗涤聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，将PVDF膜放于5%脱脂牛奶封闭60 min；一抗孵育，置于摇床（60 r/min）室温下1 h或过夜；回收一抗，多次洗涤PVDF膜，二抗孵育，置于摇床（60 r/min）室温下，使用ECL（enhanced chemiluminescence）化学发光底物试剂盒，配置显色液，滴在PVDF膜上，5 min后观察并拍照。

所有数据均以平均值±标准误表示，使用SPSS 13.0软件进行数据分析，采用One-Way方差分析，并用LSD检验对差异性进行分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。

在4 ℃胁迫下CpAK1的mRNA水平在低温处理1、2 h时无显著变化，在6 h出现极显著增加，为对照组（Wild type，WT）的3.53倍（图 1A）。而CpAK2的mRNA水平在4 ℃胁迫下整体呈现显著下降，在6 h时达到最低值，下调至15.19%（图 1B）。进一步对2种AK的蛋白水平验证，在4 ℃胁迫6 h时CpAK1的蛋白水平显著增加，而CpAK2的蛋白水平显著下调（图 2A、B），与mRNA的水平一致。

注：A 4 ℃时CpAK1的相对表达量；B 4 ℃时CpAK2的相对表达量；C 38 ℃时CpAK1的相对表达量；D 38 ℃时CpAK2的相对表达量；所有数据均为平均值±标准误；a表示P < 0.01；b表示P < 0.05；WT为对照组（Wild type）。 图 1 不同温度诱导淡色库蚊精氨酸激酶的mRNA水平 Figure 1 mRNA levels of CpAK1 and CpAK2 induced by different temperatures

图选项

注：A 4 ℃时CpAK1和CpAK2蛋白水平；B 4 ℃时CpAK1和CpAK2蛋白对应的灰度值；C 38 ℃时CpAK1和CpAK2蛋白水平；D 38 ℃时CpAK1和CpAK2蛋白对应的灰度值；所有数据均为平均值±标准误；a表示P < 0.01；b表示P < 0.05；WT为对照组（Wild type）。 图 2 不同温度诱导6 h淡色库蚊精氨酸激酶的蛋白水平 Figure 2 Protein levels of CpAK1 and CpAK2 induced by different temperatures for 6 h

图选项

在38 ℃胁迫下CpAK1的mRNA水平显著提高，且在胁迫6 h内呈现持续上升的趋势，6 h达到峰值，是对照组的3.46倍，在12 h时表达水平出现下降趋势（图 1C）。而CpAK2在逆境胁迫1、2 h时mRNA表达无明显变化，在6、12 h出现极显著的下降（图 1D）。进一步对蛋白水平分析，在不同温度胁迫下6 h提取蛋白，与对照组相比，CpAK1蛋白水平显著上调，而CpAK2的蛋白水平略有下降（图 2C、D）。

在相对湿度20%下处理淡色库蚊，检测CpAK1和CpAK2的mRNA及蛋白水平。发现相对湿度20%的条件下1~2 h内CpAK1的转录水平无显著变化，随后在6 h转录水平显著上调4.30倍，12 h降低到与对照组相同的转录水平（图 3A）。而CpAK2的mRNA水平在1~2 h无明显变化，在6 h后反转录水平出现下降，在12 h反转录水平显著下降至45.45%（图 3B）。对低湿胁迫6 h的淡色库蚊进行蛋白水平的检测，与对照相比CpAK1蛋白水平略有增加，而CpAK2蛋白水平显著下调（图 4A、4B）。

注：A相对湿度20%时CpAK1的相对表达量；B相对湿度20%时CpAK2的相对表达量；C相对湿度100%时CpAK1的相对表达量；D相对湿度100%时CpAK2的相对表达量；所有数据均为平均值±标准误；a表示P < 0.01；b表示P < 0.05；WT为对照组（Wild type）。 图 3 不同湿度诱导淡色库蚊精氨酸激酶的mRNA水平 Figure 3 mRNA levels of CpAK1 and CpAK2 induced by different humidities

图选项

注：A相对湿度20%时CpAK1和CpAK2蛋白水平；B相对湿度20%时蛋白表达对应的灰度值；C相对湿度100%时CpAK1和CpAK2蛋白水平；D相对湿度100%时蛋白表达对应的灰度值；所有数据均为平均值±标准误；a表示P < 0.05；WT为对照组（Wild type）。 图 4 不同湿度诱导6 h淡色库蚊精氨酸激酶的蛋白水平 Figure 4 Protein levels of CpAK1 and CpAK2 induced by different humidities for 6 h

图选项

在相对湿度100%环境下测定CpAK1和CpAK2的mRNA及蛋白表达水平，结果表明，淡色库蚊CpAK1的mRNA表达水平在12 h内先增后降，但是与对照相比变化不显著（图 3C）。而淡色库蚊CpAK2的mRNA水平总体是下降的，在相对湿度100%处理1和12 h出现极显著下降（图 3D）。在蛋白水平方面，相对湿度100%胁迫6 h时CpAK1的蛋白水平无显著变化（图 4A、4B），而CpAK2的蛋白水平显著下调，结果与反转录水平一致（图 4C、4D）。

维持能量代谢的平衡对生命体至关重要，AK通过催化精氨酸与ATP之间的可逆反应，将能量储存于磷酸精氨酸的高能磷酸键中或将磷酸精氨酸分解产生ATP，生物体应激条件下能通过上调AK的表达，来响应应急条件下的能量需求。关于AK对逆境胁迫的响应，在很多物种上都有报道。盐浓度对水产养殖有重要影响，通过改变养殖环境的盐浓度检测AK表达变化，发现日本沼虾（Macrobrachium nipponense）、斑节对虾（Penaeus monodon）和日本大眼蟹（M. japonicus）低盐胁迫均会使AK表达水平上升^[16-18]。日本囊对虾（M. japonicus）经过4 h的缺氧处理，发现只有在肌肉中ATP水平略微下降，而其体内的磷酸精氨酸含量显著下降，这些数据表明ATP水平可以有效地缓冲磷酸精氨酸体系，AK可促使生成ATP以快速抵抗缺氧胁迫^[19]。脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）研究中，用副溶血性弧菌或嗜水气单胞菌侵染脊尾白虾，检测到肌肉中AK表达水平上调，且均在24 h显著上调，120 h恢复对照组水平^[20]。过氧化氢胁迫处理克氏锥虫（Trypanosoma cruzi），AK基因表达量显著上升，高水平表达的AK组较对照组有更强的生存能力^[21]。以上研究均表明AK在逆境胁迫下，能够提高表达水平维持应激需能，增强对不良生存环境的适应能力，从而延长生命活动。

蚊虫的生命活动受气候因素的影响较大，温度和湿度是影响蚊虫发育和繁殖的主要气象因素^[22]。蚊虫对温度和湿度耐受力的高低是蚊虫种群生存和发展的重要前提。近年来研究发现在冬季气温和湿度相对较低时，蚊虫依然能够正常活动^[14]。AK作为ATP缓冲系统中的重要成员，在能量代谢中起着关键作用^[7]。本文在不同温度和湿度胁迫下检测淡色库蚊AK的表达，发现在38和4 ℃胁迫时CpAK1的mRNA和蛋白水平上调，而CpAK2的mRNA和蛋白水平均下调。在相对湿度100%胁迫下CpAK1的表达未发生显著变化，分析原因可能是淡色库蚊的正常饲养条件湿度达到75%，100%的相对湿度对蚊虫来说属于适宜的湿度，不造成胁迫。本研究结果表明在淡色库蚊应对温度和湿度的逆境时，CpAK1的响应为表达上调，而CpAK2的响应为表达下调，推测两者均参与了逆境胁迫响应，但功能不同，具体的功能要进行进一步的研究。

利益冲突  无