蚊虫不仅骚扰吸血，还是登革热、疟疾、流行性乙型脑炎等多种疾病的传播媒介^[1-2]。而白纹伊蚊（Aedes albopictus）是我国登革热的主要传播媒介^[3]。研究蚊虫抗药性、评估杀虫剂药效需要大量敏感或抗性品系蚊虫作为实验材料^[4]，为此需要对这些特定品系的蚊虫进行传代保存。目前蚊虫长期保种主要通过2种方式，一是通过成蚊传代，二是经卵保种。经成蚊传代需要建立严格的蚊类饲养实验室及温湿度控制系统，且人力、物力、能源及设备等成本消耗较高。且长期传代过程中蚊种存在受到污染的可能，难以保证其质量稳定性。而经卵保存是将蚊卵保存在适宜条件下，以延长卵期，尽可能减少不必要的蚊虫饲养工作。是一种经济、便捷、高效和可持续的实验室蚊虫长期保种方式。本研究通过研究不同温度下保存白纹伊蚊卵孵化率的差异，探寻实验室白纹伊蚊卵的适宜保存条件，找到一种简便高效的蚊卵保存方式。

恒温恒湿气候箱（德国MMM公司Climacell 404），体视显微镜（Olympus），数码显微镜（Keyence VHX-6000），9 cm无菌塑料平皿，载卵滤纸，一次性无菌吸管，一次性塑料盒，细头毛笔，纯水，养蚊笼（30 cm×25 cm×30 cm）。

产卵成蚊引进自浙江省疾病预防控制中心（CDC），并已经在杭州市CDC病媒生物实验室饲养并连续繁殖10代以上。

温度（25±1）℃、相对湿度（70±10）%、光照周期（L∶D）=14∶10。

将实验室已收集的蚊卵放入装有脱氯自来水的容器中。蚊卵孵化后，幼虫饲以质量比为1∶3的猪肝粉和酵母粉混合物。幼虫化蛹后吸取蚊蛹置于养蚊笼中。蚊蛹羽化后，成蚊饲以10%葡萄糖溶液，3 d后将小鼠放入养蚊笼使成蚊叮咬吸血24 h。成蚊吸血后3 d，将产卵杯（塑料杯+滤纸）放入养蚊笼中供雌蚊产卵。

准备3张滤纸（双圈定性滤纸，9 cm，慢速），2张叠加对折成波浪形，放入无菌塑料平皿底部提供支撑；另1张滤纸平铺于其上，用吸管取适量纯水将滤纸润湿，用来保存蚊卵。操作过程中佩戴手套，防止手污染滤纸导致保存过程中发霉。

将毛笔头用纯水湿润，用笔尖蘸取适量蚊卵至湿润的载卵滤纸上，挑选形态完整饱满的蚊卵，在体视显微镜下计数，确保各组间蚊卵数目大致相等。对照组蚊卵计数后直接放入水中进行孵化；实验组按保存时间共分为7、14、21、28 d 4组，每组均设置3个重复。

为探索更适宜的蚊卵保存温度，本实验3台恒温恒湿气候箱相对湿度均设置为75%，分别在温度为5、15、25 ℃下保存蚊卵，通过对比不同保存温度下孵化率差异，选择蚊卵孵化率相对较高的保存温度，再细化温度设置。根据前期实验结果，15 ℃保存蚊卵孵化率相对最高，后续实验在相对湿度为75%，温度为10、12.5、20 ℃条件下进行。

蚊卵保存至第7、14、21、28天时，分别取出对应组别的蚊卵，用数码显微镜观察蚊卵状态及完整性，然后入水孵化，孵化环境温度为（25±1）℃、相对湿度为（70±10）%。由于蚊卵孵化时间存在差异，全部孵化需要一段时间，刚孵化的幼虫较小肉眼直接计数时不够准确，故直至最早孵化的幼虫长至3龄时认为所有卵已孵化完毕^[5]，进行计数并计算孵化率。

应用Excel 2019软件对白纹伊蚊卵保存数据进行整理，计算孵化率，并作统计图表进行描述性分析，采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计数资料以率表示，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

白纹伊蚊卵在5、15、25 ℃下分别保存7、14、21、28 d，其中在15 ℃下保存蚊卵的孵化率第7天为67.80%，第14天为50.00%，至第28天仍维持在50.00%左右。5 ℃下保存蚊卵的孵化率在第7天即低至21.88%，之后持续迅速下降，第14天为9.32%，第21天仅为0.26%，至第28天降为0。25 ℃下保存蚊卵的孵化率介于其他2组之间，除第14天出现明显下降外，其他时间均维持在30.00%左右。见表 1。

表 1 不同温度下保存白纹伊蚊卵的孵化率 Table 1 Hatching rate of Aedes albopictus eggs preserved at different temperatures

表选项

白纹伊蚊卵在10、12.5、20 ℃下分别保存7、14、21、28 d，其中在12.5 ℃下保存蚊卵的孵化率第7天为50.11%，第14天为67.08%，至第28天为47.71%。10 ℃下保存蚊卵的孵化率从第7天开始逐渐降低，至第28天降至17.56%。20 ℃下保存蚊卵的孵化率介于其他2组之间，直至第28天始终维持在40.00%左右。见表 1。

白纹伊蚊卵保存7、14、21、28 d，5、15和25 ℃条件下保存蚊卵的孵化率差异有统计学意义（7 d：F=36.688，P < 0.001；14 d：F=166.749，P < 0.001；21 d：F=7.890，P=0.021；28 d：F=19.501，P=0.002），其中15和25 ℃均高于5 ℃保存的孵化率（除25 ℃保存14 d外）（7 d：P < 0.001，P=0.033；14 d：P < 0.001, P < 0.001；21 d：P=0.008，P=0.033；28 d：P=0.001，P=0.007）；在保存7 d时，15 ℃保存蚊卵的孵化率高于25 ℃，差异有统计学意义（P=0.001）。10、12.5和20 ℃保存14和28 d时的孵化率差异有统计学意义（14 d：F=23.700，P=0.001；28 d：F=9.429，P=0.014），12.5和20 ℃均高于10 ℃保存蚊卵的孵化率（14 d：P < 0.001，P=0.017；28 d：P=0.008，P=0.011）。见表 2。

表 2 不同温度下保存不同时间白纹伊蚊卵的孵化率 Table 2 Hatching rate of Aedes albopictus eggs preserved at different temperatures for different days

表选项

另外，从蚊卵保存过程中霉菌生长情况来看，5 ℃下保存蚊卵直至第28天未见霉菌生长，且镜下蚊卵形态完整。15 ℃下保存蚊卵在第14、21、28天均有极少数出现霉菌生长，但蚊卵形态均保持完整。25 ℃下保存蚊卵在第7天已出现霉菌生长，有少量蚊卵出现提前破壳现象，第14、21、28天霉菌开始大量繁殖，镜下可见大量蚊卵提前破壳，一端出现残缺。10、12.5、20 ℃下保存的蚊卵从第21天开始有极少量的蚊卵出现霉菌生长情况，但蚊卵形态均完整。见图 1。

注：A 5 ℃下保存蚊卵；B 15 ℃下保存蚊卵；C 25 ℃下保存蚊卵。 图 1 不同温度及保存时间下白纹伊蚊卵霉菌生长及完整性变化 Figure 1 Mold growth and changes in the integrity of Aedes albopictus eggs preserved at different temperatures for different days

图选项

温度是影响蚊卵保存及孵化的重要因素。王丕玉和董利民^[6]将白纹伊蚊卵置4 ℃冰箱保存7 d后孵化率即降为0，孙传红等^[7]将白纹伊蚊卵在4 ℃冰箱保存10 d后孵化率降为0，表明白纹伊蚊卵不适合低温保存。本研究中5 ℃下保存白纹伊蚊卵的孵化率第7天即降至21.88%，至第28天降为0。虽然低温会导致蚊卵孵化率下降，但5 ℃下保存蚊卵直至第28天未见霉菌生长，且镜下形态完整，提示低温可减少霉菌生长。

湿度也是影响蚊卵保存及孵化的重要条件。有研究表明，较高的相对湿度能够保证蚊卵活力^[8]。杨振洲和陆宝麟^[9]发现白纹伊蚊卵在不同湿度下保存，孵化率随湿度的增加而升高。在75%相对湿度下保存的孵化率最高；当相对湿度达到98%时孵化率却又有所降低，且保存至30 d时卵纸上有霉菌生长，可能是孵化率降低的重要原因。因此，本研究选择75%的相对湿度进行实验。杨翠等^[10]指出白纹伊蚊蚊卵产在滤纸上，所以相比空气湿度，卵纸的湿度对蚊卵发育影响更大。但为了保证卵纸湿度，需每天对其湿度进行测量并做加湿处理，相对较为繁琐。故本实验未对卵纸湿度进行监测，而是选择全程维持卵纸处于湿润状态，保存过程中每隔7 d左右用滴管向平皿底部加2~3滴无菌水即可保持卵纸湿度，无需每天测量卵纸湿度并通风换气。

保存容器也对蚊卵保存及孵化产生影响。Soares-Pinheiro等^[11]使用3种不同存储容器（塑料杯、信封、塑料袋）保存埃及伊蚊（Ae. aegypti）卵，发现塑料杯保存的卵孵化率显著高于其他2种容器，认为是由于用塑料杯保存的蚊卵更易接触到空气。本研究使用的恒温恒湿气候箱是通过风机进行气体交换，若使用敞口塑料杯，卵纸在1 d内即干燥，需每天加水来保持卵纸湿度。本研究选用一次性无菌塑料平皿作为储卵容器，既可减缓水分挥发，又能确保蚊卵与空气的接触。

与其他研究相比，本实验对照组蚊卵孵化率相对较低，分别为71.88%和54.16%，可能与蚊卵的卵粒成熟度有关。蚊卵从排出到成熟再到孵化有一定的时间阶段，不同阶段蚊卵对外环境的抗逆性程度不同。陈小杰^[12]发现不同胚胎发育期的白纹伊蚊卵耐干旱能力有显著差别，完成胚胎发育的卵较未完成的耐干旱能力显著增强。李广宏等^[13]研究发现按蚊卵在8 ℃下会出现寒冷伤害，但此种伤害会随着卵发育时间的延长而减轻，表明蚊卵的耐寒能力也会随发育时间而增强。本研究中蚊虫产卵24 h后，直接将蚊卵计数孵化，未将其置室温下待胚胎发育成熟，可能是导致对照组蚊卵孵化率偏低的原因，但这并未对孵化率的变化趋势造成影响。后续研究可分别选择产卵后室温发育24、48、72 h等不同阶段蚊卵进行实验，以筛选出孵化率较高、更适宜进行蚊卵保存的卵胚胎发育时间。

利益冲突  无