蜱属于节肢动物门（Athropoda）蛛形纲（Arachnida）蜱螨亚纲（Acari）寄螨总目（Parasitiformes）蜱目（Ixodida）^[1]，是陆生脊椎动物的专性、非永久性体外寄生虫，是仅次于蚊虫的人兽共患病第二大传播媒介和宿主^[2]，我国10种常见非法定报告传染病中至少有7种为蜱传疾病^[3]。长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）隶属于硬蜱科血蜱属^[4]，全国分布，是我国分布最广泛和最重要的蜱种之一^[5]。该蜱寄生于马、犬、兔、牛、羊、鼠等动物体表，传播无形体（Anaplasma）、巴尔通体（Bartonella）、立克次体（Rickettsiae）、泰勒虫（Theileria）等多种病原体^[6-8]，导致人类和家畜的多种疾病。

蜱形态学研究揭示，蜱的第1对足跗节上存在有化学感觉器——哈氏器（Haller’s organ）^[9-10]，蜱类可借此感受多种气味物质的刺激，在定位宿主、交配繁殖、躲避敌害等方面发挥重要作用。随着触角电位（Electroantennography，EAG）技术运用于蜱类，可以直接检测出蜱对挥发性气味物质的化学信号并以电位差的形式反映出对特定化合物刺激的反应大小。本研究旨在利用EAG技术，分析不同饥饿时间（1和4个月）长角血蜱雌成蜱哈氏器对氨水、冰醋酸，以及对昆明小鼠、新西兰兔和绵羊3种常见血餐动物的血液、粪便提取液、毛皮提取液的EAG反应，为蜱选择宿主机制的相关研究提供基础。

供试长角血蜱（BJ株）采自北京市昌平区，实验室饲养7代以上，饲养温度（25±1）℃，相对湿度（70±10）%，供血动物为昆明小鼠（为幼蜱、若蜱供血）、新西兰兔（为若蜱、成蜱供血），均购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂。选择蜕皮后饥饿处理1和4个月雌成蜱供试。

氨水（分析纯，含量25%，Sigma-Aldrich）、冰醋酸（分析纯，含量 > 99.5%，Amresco）分别用蒸馏水稀释至0.10、1.00、10.00和100.00 μl/ml浓度。

昆明小鼠、新西兰兔、绵羊新鲜血液（购自某农贸市场）。

粪便处理：参照文献[11]，取昆明小鼠（采自实验室供血小鼠）、新西兰兔（采自实验室供血兔）、绵羊粪便（采自北京市昌平区百善镇孟祖村某村民饲养绵羊群）各10 g加入5 ml的丙酮（分析纯，含量≥99.5%），在4 ℃下浸泡12 h后，1 527×g离心5 min取上清液，保存在4 ℃冰箱中备用。

毛皮提取液制备：参照文献[12]，将新收集的昆明小鼠、新西兰兔、绵羊不同部位的毛裁剪为3~6 mm的小段；并将动物1 cm×1 cm大小的皮剪碎，各称取15 g放入加有50 ml二氯甲烷（分析纯，分子质量84.93，Innochem）的烧杯中，用玻璃棒充分搅拌，静置30 min。然后将浸泡液倒入烧杯中，再重复此过程2次（即分3次，每次用50 ml二氯甲烷浸泡30 min）。将收集到的约150 ml浸泡液倒入200 ml烧杯中，过夜蒸发。200 ml烧杯底部会留下提取出的油脂类物质。用解剖刀将此油脂物质刮下称重，再次用二氯甲烷按照8 mg/ml的浓度配置毛皮提取物溶液，并将此提取液置于-20 ℃冰箱保存备用。

参照文献[13-14]，挑选1只长角血蜱雌成蜱用解剖刀将其前足跗节快速切下，两端置于注入适量导电液的玻璃电极上，插入切口的电极为参考电极，与哈氏器接触的电极为记录电极。吸取10 μl待测液均匀滴在5 cm×0.5 cm的滤纸上，放入巴斯德管中，按住封口，让其充分挥发。巴斯德管一端连接气流净化装置，末端插入气流混合管外侧的小孔内，待基线稳定后给予刺激。不同样品的检测次序是任意的，每种样品的检测顺序是按浓度自低而高进行检测。每测定一样品，前后都进行相应的对照测定。氨水、冰醋酸以蒸馏水为对照，粪便提取液、毛皮提取液分别以丙酮、二氯甲烷为对照，取前后两对照的平均值作为该样品的对照值。每个样品6个重复（3只蜱6个足Ⅰ跗节）。实验所用触角电位仪：Syntech kirchzarten，德国，含IDAC-4四通道USB接口数据采集控制器、CS-55刺激气流控制器、MP-15显微操作台、X-Y-Z向可调操作臂及数据记录分析软件。

实验数据采用Excel 2019和SPSS 22.0软件进行分析，利用t检验和方差分析进行检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

从表 1可以看出，饥饿1和4个月长角血蜱雌成蜱哈氏器对不同浓度的冰醋酸均有不同程度的电生理变化，且随着浓度的增大，EAG反应值逐渐增大。饥饿1个月的长角血蜱对不同浓度冰醋酸的EAG值差异有统计学意义（F=1 079.697，P < 0.001），两两比较，除0.10和1.00 μl/ml间EAG值差异无统计学意义（P=0.074）外，其余浓度间EAG差异均有统计学意义（均P < 0.05）；饥饿4个月的长角血蜱对不同浓度冰醋酸的EAG值差异有统计学意义（F=501.403，P < 0.001），两两比较，除0.10和1.00 μl/ml间EAG值差异无统计学意义（P=1.000）外，其余浓度间EAG值差异均有统计学意义（均P < 0.05）。在浓度为0.10 μl/ml冰醋酸刺激时，饥饿1和4个月的长角血蜱的EAG反应值均较低，分别为（0.000±0.007）和（0.000±0.010）mV，二者差异无统计学意义（t=-0.296，P=0.773）。在其余浓度时，不同饥饿时间长角血蜱EAG值差异均有统计学意义（t_1.00=3.671，P=0.004；t_10.00=6.546，P < 0.001；t_100.00=9.669，P < 0.001）。

表 1 不同饥饿时间长角血蜱饥饿雌成蜱哈氏器对冰醋酸的触角电位（EAG）反应 Table 1 Electroantennography responses of Haller's organ of Haemaphysalis longicornis with different starvation periods to glacial acetic acid

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从表 2可以看出，饥饿1和4个月长角血蜱哈氏器均对不同浓度的氨水有不同程度的电生理变化，随着浓度的增大，EAG反应值逐渐增大。饥饿1个月的长角血蜱对不同浓度氨水的EAG值差异有统计学意义（F=1 455.295，P < 0.001），且两两比较差异均有统计学意义（均P < 0.05）；饥饿4个月的长角血蜱对不同浓度氨水的EAG值差异有统计学意义（F=257.308，P < 0.001），两两比较，除0.10和1.00 μl/ml间EAG值差异无统计学意义（P=0.160）外，其余浓度间EAG值差异均有统计学意义（均P < 0.05）。在浓度为0.10和10.00 μl/ml的氨水刺激时，饥饿1和4个月蜱间的EAG值差异无统计学意义（t_0.10=1.111，P=0.292；t_10.00=0.785，P=0.451）；在浓度为1.00和100.00 μl/ml的氨水刺激时，不同饥饿时长的蜱间EAG值差异均有统计学意义（t_1.00=3.420，P=0.007；t_100.00=3.834，P=0.003）。

表 2 不同饥饿时间长角血蜱雌成蜱哈氏器对氨水的触角电位（EAG）反应 Table 2 Electroantennography responses of Haller's organ of Haemaphysalis longicornis with different starvation periods to ammonia

表选项

在相同饥饿时长下，蜱哈氏器对同浓度氨水的EAG值均大于对冰醋酸的EAG值（图 1）。饥饿1个月的长角血蜱哈氏器对不同浓度冰醋酸和氨水的EAG反应差异均有统计学意义（t_0.10=-6.290，t_1.00=-9.516，t_10.00=-26.423，t_100.00=-16.827，均P < 0.001）；饥饿4个月的长角血蜱对不同浓度冰醋酸和氨水的EAG反应差异亦均有统计学意义（t_0.10=-2.564，P=0.028；t_1.00=-9.582，t_10.00=-19.483，t_100.00=-9.158，均P < 0.001）。

图 1 不同饥饿时长的长角血蜱雌成蜱哈氏器对冰醋酸、氨水的触角电位（EAG）反应比较 Figure 1 Comparison of electroantennography responses of Haller's organ of Haemaphysalis longicornis with different starvation periods to glacial acetic acid and ammonia

图选项

从上述研究得出的同种气味刺激下，饥饿1个月蜱比4个月蜱哈氏器的EAG反应值大，因此选取饥饿1个月蜱测定其哈氏器对3种动物血液、粪便提取液、毛皮提取液的EAG反应。从图 2可以看出，3种动物中，蜱哈氏器对绵羊的粪便提取液、毛皮提取液EAG值均较大，分别为（0.758±0.070）和（0.914±0.150）mV，蜱对3种动物粪便提取液EAG值间差异有统计学意义（F_粪=11.587，P=0.001），对3种动物毛皮提取液的EAG值间差异亦有统计学意义（F_皮=14.237，P < 0.001），对3种动物血液的EAG反应值间差异无统计学意义（F_血=0.002，P=0.998）。在同种动物（鼠、兔和绵羊）内，蜱哈氏器对3种来源（粪便提取液、毛皮提取液和血液）提取物的EAG值间差异均有统计学意义（F_鼠=28.229，F_兔=34.616，F_绵羊=77.722，均P < 0.001），且对粪便提取液、毛皮提取液的EAG值均与血液的EAG值差异有统计学意义（均P < 0.05），绵羊粪便提取液与毛皮提取液间EAG值差异亦有统计学意义（P=0.027），但鼠、兔粪便提取液与毛皮提取液间EAG值差异均无统计学意义（均P > 0.05）。

注：小写字母不同表示触角电位（EAG）反应值差异有统计学意义（P < 0.05）。 图 2 长角血蜱雌成蜱哈氏器对鼠、兔、绵羊不同来源提取物刺激的EAG反应 Figure 2 EAG response of Haller's organ of Haemaphysalis longicornis to the stimulation of different extracts of mice, rabbits, and sheep

图选项

蜱类在寻找宿主的过程中，主要依靠足Ⅰ跗节上的哈氏器感知来自宿主以及周围环境的气味。早在1979年Haggart和Davis^[15]就运用电生理技术，测定了血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）在（0.2~72）×10^-9 mol/sec的NH₃刺激下可引起哈氏器的电位反应；1985年蓝明扬等^[13]通过钨丝电极证明了中华硬蜱（Ixodes sinensis）和缺角血蜱（Ha. inermis）足Ⅰ哈氏器对弱酸和氨均出现明显的应激电位差反应。本文同样选择哺乳动物代谢产物中的主要成分——冰醋酸和氨水，用玻璃电极对不同饥饿时间（1和4个月）长角血蜱雌成蜱哈氏器进行电生理的测定，实验中同种气味物质，饥饿4个月的蜱比1个月蜱EAG反应值小，提示蜱饥饿时间长短可能影响其对气味的感知能力，这种减弱可能与蜱长时间不吸血代谢率和耗氧量下降从而导致呼吸减弱有关^[16-18]。长角血蜱雌成蜱哈氏器对氨水EAG反应值大于冰醋酸，说明其对不同刺激物敏感性不同。

长角血蜱是我国分布最广泛和最重要的媒介蜱种之一，并且寄生于多种动物体表，传播多种疾病，因此对于其引诱剂或驱避剂的开发与研究对其控制具有重要意义。除已知化合物外，本文还选择了在实验室繁殖长角血蜱过程中的供血宿主昆明小鼠、新西兰兔，以及野外长角血蜱的主要宿主绵羊的不同组织及粪便提取物为气味源开展EAG实验。实验中饥饿长角血蜱雌成蜱哈氏器对3种动物血液的电生理反应很弱，且三者之间差异无统计学意义，这可能与未对动物血液挥发物进行提取而导致气味物质浓度较低有关，或者不同动物血液成分相似导致。蜱哈氏器对绵羊的粪便提取液、毛皮提取液EAG反应值均大于鼠和兔，说明可能相对于其他2种动物，长角血蜱更喜欢绵羊体散发的气味。此外，本实验以成蜱为研究对象，而绵羊是成蜱的主要宿主动物之一可能也是导致此结果的重要原因。同种动物中，蜱哈氏器对鼠、兔的毛皮提取液与粪便提取液EAG值间差异无统计学意义，这可能是由于这2种动物均为实验室笼中饲养，动物活动范围小，毛皮沾染了尿液等物质而导致毛皮提取液与粪便提取液许多成分相似；而对羊毛皮提取液与粪便提取液的EAG值间差异有统计学意义，说明动物皮肤分泌物和粪便提取液中对蜱产生刺激的物质及其浓度不尽相同，对于2种提取液中发挥作用的成分，还需结合气相色谱等方法进一步研究探讨。本研究为进一步研究蜱对宿主的选择以及引诱剂或驱避剂的开发提供了一定的参考。

利益冲突  无