蚊虫属于双翅目（Diptera）蚊科（Culicidae），广泛分布于除南极洲外所有大陆^[1]，目前全世界已报道约3 500种，其中数十种是对公共卫生具有重大意义的病原体的传播媒介^[2]。在长期的进化过程中，蚊虫与种类繁多的微生物形成了密切的共生关系。研究表明，蚊虫肠道微生物中最重要的组成部分是细菌^[3-4]，定植有大量共生微生物的蚊虫肠道组织是蚊虫宿主抵抗外界病原体入侵的第一道免疫屏障^[5]。当感染病原体的血液进入蚊虫的中肠组织时，一些肠道微生物通过分泌蛋白质、酶或者其他小分子导致病原体感染蚊虫中肠上皮细胞，进而调控病原体在蚊虫体内的传播^[6]。肠道共生微生物广泛参与蚊虫各项生命活动，对其生长、发育、繁殖、免疫调节及媒介效能具有很大的作用及影响^[7-8]。利用肠道共生微生物控制和阻断蚊媒疾病的传播是有发展潜力的方法之一，因此研究蚊虫肠道微生物的组成及其功能对理解蚊虫、肠道微生物以及病原体三者之间的关系具有非常重要的意义。

1 肠道微生物的多样性

种类多样、数量繁多的蚊虫肠道微生物在与宿主长期的协同进化过程中起着重要的作用^[9]。近年来，随着肠道微生物的研究方法和测序技术的不断进步，肠道微生物的多样性和生物学特性展现出巨大的应用潜力和研究价值，同时为蚊媒传染病的控制提供了新的思路。

1.1 蚊虫肠道微生物的研究方法

研究蚊虫肠道微生物的方法主要有2种：传统的细菌培养法和非培养依赖法。肠道菌群丰富多样，传统的细菌培养法很难充分模仿复杂的内部条件，大部分细菌不能分离再培养，影响对更多肠道微生物的研究^[10]。非培养依赖法将第二代测序技术（next generation sequencing，NGS）和生物信息学分析结合，在免培养的条件下获得共生微生物的信息，从而提高了我们对共生微生物多样性的认识。非培养依赖法在鉴定特定环境中的全部微生物方面更有优势，但传统培养的方法弥补了测序依赖法的一些局限性^[11]。因此，两者在一定程度上起到互补的作用。

目前，蚊虫肠道微生物组的研究重点表现在DNA、mRNA和微生物培养等方面，主要包括培养组学、代谢组学、转录组学、宏基因组学等^[12-13]。其中，宏基因组学的关键技术是高通量（16S/18S/ITS rRNA基因）测序技术、宏基因组（总DNA）测序技术和宏转录组（总RNA）测序技术。16S rRNA测序技术具有快速地检测出特定环境中细菌（包括未能分离培养的细菌）的种类和数量的优势^[14]。宏基因组具有不受基因拷贝数影响的特点，是分类组成评估最准确的方法。在16S rRNA测序的基础上其将微生物基因组DNA随机切断，经扩增、测序、重组、连接后获得研究对象中所有细菌的基因组序列信息，进而分析结构组成及生物进化，预测基因潜在的功能。宏基因组同16S rRNA测序相比具有显著优点，但宏基因组产生大量的序列数据导致所需成本较高。因此通常先采用16S rRNA测序获得微生物的种类和数量，再筛选出有研究价值的对象进行宏基因组测序^[15]。

1.2 蚊虫肠道微生物的分类

目前研究已经确定了数百种操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）的蚊虫肠道微生物，其中以变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）最为丰富^[16]。常见的菌株包括不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）等^[17]。

1.3 影响蚊虫肠道微生物多样性的因素和方式

影响蚊虫肠道微生物多样性的因素和方式多种多样。通常情况下，肠道微生物种类和数量在蚊虫吸血前后存在明显的差异，以革兰阴性菌为主的肠道微生物菌群在吸血2 d后其数量增加了数百倍^[18]。单只成蚊的肠道微生物数目为10²~10⁴成菌落数（colony-forming unit，CFU）。不同的蚊虫种类，不同的发育阶段以及不同的生活环境，都会对蚊虫肠道微生物多样性产生影响^[19]。

1.3.1 蚊虫的种类

不同的蚊种生活环境不同，其摄取的营养物质以及生活习性存在差异，因此蚊虫肠道菌群的种类也多种多样^[20]。随着蚊虫肠道微生物的研究方法和高通量测序技术的高速发展，更多未知的蚊虫肠道微生物相继被发现。变形菌门是共生细菌最主要的门类，其中丰度最高的是γ-变形菌^[21]。研究发现微生物菌群的相似度在同一蚊种间最高，在同一蚊种间具有特定或较高丰度的微生物菌群^[22]。据报道，假单胞菌属、肠杆菌属、朝井杆菌属（Asaia）、伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）和沙雷菌属（Serratia）等在大多数按蚊中均存在^[23]。当然，不同蚊种间也存在相同的共生细菌。朝井杆菌属、产气单胞菌属（Aeromonas）、西地西菌属（Cedecea）和假单胞菌属等在伊蚊、按蚊和库蚊中均存在；泛菌属（Pantoea）在伊蚊和按蚊中丰度较高；沃尔巴克氏体属（Wolbachia）在伊蚊和库蚊中占比较高，而在按蚊中存在稀少，这可能是与其他共生菌间竞争作用的结果^[24]。

1.3.2 蚊虫的孳生地

蚊虫肠道微生物大部分来自蚊幼虫摄食的过程中，不同孳生地、甚至同一孳生地不同的水层其微生物组成也有差异。因此影响蚊虫肠道菌群组成的重要原因之一是幼虫期孳生地的不同^[25]。伊蚊幼虫主要在废旧的花盆、久置的水缸等小中型器皿中繁殖，库蚊幼虫主要在较浑浊的水域中繁殖，按蚊则与上述2种蚊种存在明显差异，其繁殖地点在像池塘等较干净的中型水体中^[26]。相同种属的蚊虫因生活环境相似，其肠道微生物的组成也基本相似。而不同种属间蚊虫因生活习性的不同，其肠道微生物存在较大的差异，如库蚊和按蚊他们的肠道微生物组成不同。但不同的蚊种也能从类似的环境中获取相同的肠道微生物，如在伊蚊和按蚊中都存在泛菌属、不动杆菌属和肠杆菌属等^[27]。相关研究表明，野外品系蚊虫的肠道共生菌丰度和多样性比实验室常规饲养品系更高^[28]。

1.3.3 蚊虫不同的发育阶段

肠道微生物的多样性在蚊虫从幼虫到成虫发育过程中会有所降低^[29]。蚊是变态发育昆虫，卵、幼虫和蛹这3个阶段生活在水中，而成蚊阶段营陆地生活。蚊虫生活环境、营养物质、生活习性及生理状态的差异使各个发育阶段蚊虫的肠道共生细菌也不相同。蚊虫肠道内微生物菌群在其发育时期的移除和重塑方式主要有外骨骼脱落和围食膜包裹胎粪排出^[30]。刚刚羽化的成蚊几乎无菌，但不动杆菌属、肠杆菌属等共生菌能从蛹传递到成虫^[31-32]。研究人员利用16S rRNA测序方法探究冈比亚按蚊（An. gambiae）发育中菌群的动态变化，研究发现沃尔巴克氏体是一种来自于母代垂直传播的卵期共生细菌^[33]。幼虫期蚊虫的肠道共生细菌与其暴露的环境因素相关，大多来源于孳生地，在此阶段其肠道中却只检测到部分水体菌群，因此肠道微生物的组成具有选择性；羽化为成蚊后，共生菌组成结构以及细菌含量和多样性发生变化，如芽孢杆菌属（Bacillus）在幼虫中占17%，而在成蚊中占不到1%^[34]。在蛹期的细菌主要为产气单胞菌，羽化后随着生活条件的改变微生物组成产生显著差异^[35]。新生蚊虫肠道微生物的组成几乎相同，吸食血液、摄取糖类后，肠道菌群总量迅速增加而多样性下降，这是由于蚊虫对血餐的消化、血红蛋白的水解产生大量的游离血红素引起氧应激以及丰富的营养供给造成的^[35]。

2 蚊虫肠道微生物的功能及应用

微生物群与蚊虫的生长发育、繁衍等生命活动具有密切关系，不仅为蚊虫提供必要的营养物质，还可影响其代谢、免疫等功能，某些特殊菌群还可起到保护蚊虫宿主的作用^[36]。

2.1 参与宿主营养与代谢

蚊虫肠道微生物参与宿主的多种代谢过程。宿主为共生菌提供稳定的生存环境和所需的营养物质，同时共生菌也维持宿主的正常生长发育和各项生理基本平衡。共生菌还能为摄食植物纤维的昆虫提供消化纤维素的酶。肠道微生物对蚊虫营养代谢功能相关领域的研究还有待探索，已有研究表明肠道微生物参与了蚊虫的消化和吸收过程，如肠杆菌能产生利于蚊虫消化的溶血酶^[37]；研究表明鲍氏不动杆菌（A. baumannii）和约氏不动杆菌（A. johnsonii）参与白纹伊蚊（Aedes albopictus）对血液和花蜜的消化吸收。按蚊幼虫期的营养摄取与共生细菌关系紧密，斯氏按蚊（An. stephensi）幼虫在无菌的情况下难以生存，通过添加朝井杆菌合成维生素B为宿主提供营养物质可以恢复其正常发育^[38]。此外，葡萄糖和海藻糖能促进按蚊肠道共生细菌的增殖，通过增加中肠pH值促进蚊虫感染疟原虫^[39]。一些间接证据也表明，糖代谢影响蚊虫传播疟原虫的能力。葡萄糖代谢在蚊虫体内调节疟原虫感染中发挥作用，但其潜在机制尚不清楚。

2.2 参与宿主的免疫与防御

沃尔巴克氏体是一类呈母性细胞质遗传的、在无脊椎动物细胞内专性寄生的细胞质共生菌，属于变形菌门（Proteobacteria）、α亚纲（Alphaproteohacteria）、立克次体目（Rickettsiales）、立克次体科（Rickettsiaceae）的沃尔巴克氏体属，能经卵传播的革兰阴性细菌。研究发现沃尔巴克氏体自然生存于大约65%的昆虫宿主中。该共生菌通过激活天然免疫通路和免疫相关基因的方式抑制或阻断宿主对疟原虫、西尼罗病毒、登革病毒等病原体的感染。还可以通过多种方式影响寄生宿主的生殖与正常发育，如杀雄（male killing）、孤雌生殖（parthenogenesis）以及胞质不相容性（cytoplasmic incompatibility，CI）等^[40-43]。埃及伊蚊（Ae. aegyti）感染沃尔巴克氏体后激活Toll和IMD信号通道诱导蚊虫体内相关基因表达上调并产生抗菌肽等效应因子。这些效应因子阻断病毒在蚊虫肠道内复制和传播，最终降低蚊虫传播病毒的媒介能力^[44]。研究发现，在感染沃尔巴克氏体的埃及伊蚊体内，RNA干扰（RNA interference，RNAi）途径关键因子AGO2（argonaute2）的水平明显增高，在通过小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）技术敲低AGO2后其抗病毒的能力下降。沃尔巴克氏体感染不会降低雄蚊的交配竞争力，但会导致雄蚊与雌蚊胞质不相容，因此正常交配后的蚊卵将在胚胎发育早期死亡，无法孵育出幼虫。我国研究人员将感染沃尔巴克氏体菌株的雄蚊大量放飞从而达到了给蚊群绝育的目的。

2.3 参与宿主对杀虫剂的抗性

蚊虫肠道共生微生物可参与宿主对杀虫剂的抗药性来减轻其对宿主的影响。除直接降解代谢外，还可以通过增加蚊虫体内细胞色素P450氧化酶（cytochrome P450，CYP450）、羧酸酯酶（carboxylesterase, COE）和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST)等解毒酶的活性来改善宿主对杀虫剂的耐药性^[45-46]，同时激活宿主的免疫系统来提高宿主抗性^[47]。通过实时定量PCR技术（qPCR）测定并比较淡色库蚊（Culex pipiens pallens）溴氰菊酯抗性和敏感品系中沃尔巴克氏体表达差异，结果表明抗性品系比敏感品系沃尔巴克氏体表达量高，从侧面表明沃尔巴克氏体表达水平和淡色库蚊溴氰菊酯抗性间存在相关性^[48]。研究发现肠道细菌参与了斯氏按蚊对有机磷杀虫剂的降解^[45]。能够降解溴氰菊酯的菌群中包括10个属：不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、假单胞菌属、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）、红球菌属（Rhodococcus）、曲杆菌属（Ancylobacter）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）和黄色杆菌属（Xanthobacter），其中优势菌属为不动杆菌属和克雷伯氏菌属。研究表明，嗜水气单胞菌（Aeromona shydrophila）通过诱导蚊虫体内CYP450s活性的增强来增强其对溴氰菊酯的抗药性，进一步完善了蚊虫共生菌对宿主杀虫剂抗药性的作用机制，为蚊虫抗性管理和综合治理提供了新策略^[49]。杀虫剂的种类和暴露时间的不同会影响肠道菌群的多样性，因此接触杀虫剂或许会选择杀虫剂代谢细菌，进而导致宿主对杀虫剂产生抗性差异^[50]。

2.4 参与宿主对蚊媒疾病的传播和感染

沙雷菌是按蚊肠道的核心共生菌。黏质沙雷菌（S. marcescens）菌株AS1具有良好的定植能力，其主要特点是通过水平和垂直的传播方式快速播散到整个蚊群中^[51]。具有特异性分子的工程细菌可通过多方面作用抑制疟原虫在蚊虫肠道内的发育阻止疟疾的传播。因此可设计同时表达多个效应分子的细菌来降低甚至避免疟原虫对单效应分子产生耐药性^[51]。虽然工程菌株的抗疟效果比天然抗疟菌株有优势，但在实际应用中面临巨大的挑战。因此，天然抗疟活性共生菌株仍是阻断疟疾传播的主流^[52]。据报道，从中华按蚊（An. sinensis）中分离出的具有天然抗疟活性的新型解脲沙雷菌（S. ureilytica）菌株，基因表达和RNA干扰分析结果表明其通过分泌脂肪酶蛋白Am Lip直接靶向消灭疟原虫，为源头阻断疟疾传播提供了绿色防控手段。研究表明，黏质沙雷菌分泌的蛋白质是使蚊虫对虫媒病毒感染高度敏感的主要效应物，是登革病毒传染性增强的原因^[53]。而且，黏质沙雷菌介导的病毒增强是特异性的，其与蚊媒疾病的传播关系密切。因此，采用编码沙雷菌的遗传信息来控制蚊媒传染病的传播，为蚊媒传染病的防控提供了新方案。

3 展望

蚊虫肠道微生物菌群在与宿主的互利共生过程中，对宿主的生命活动产生了重要影响。传统的研究方法以分离培养为主，随着生物信息学、宏基因组学、分子生物学、高通量测序技术等研究方法的发展，更加深入了对肠道微生物菌群的了解。但是受肠道微生物菌群种类多样及数量庞大等多方面因素的制约，新技术存在一定的局限性。因此，应用传统的研究方法与新技术相结合的方式将成为日后蚊虫肠道微生物研究的主要发展趋势。目前大部分肠道菌群的功能还有待研究，相信未来更多先进技术的出现将为肠道微生物的研究带来便利。同时也可为蚊与蚊媒病的防控提供更多的线索与思路。

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