2022, Vol. 33扩展功能
文章信息
- 孟娇, 陈醒醒, 张霞, 余福勋, 吴家红, 杨光红, 江佳富, 孙毅, 曹务春, 詹琳
- MENG Jiao, CHEN Xing-xing, ZHANG Xia, YU Fu-xun, WU Jia-hong, YANG Guang-hong, JIANG Jia-fu, SUN Yi, CAO Wu-chun, ZHAN Lin
- 贵阳市乌当区宠物中心犬体表寄生血红扇头蜱检出劳氏立克次体
- Detection of Rickettsia raoultii in Rhipicephalus sanguineus parasitized on the body surfaces of dogs in pet centers in Wudang district, Guizhou, China
- 中国媒介生物学及控制杂志, 2022, 33(4): 536-542
- Chin J Vector Biol & Control, 2022, 33(4): 536-542
- 10.11853/j.issn.1003.8280.2022.04.018
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文章历史
- 收稿日期: 2022-02-20
2 贵州省人民医院中心实验室, 贵州 贵阳 550002;
3 贵州省疾病预防控制中心, 贵州 贵阳 550001;
4 军事科学院军事医学研究院, 北京 100001
2 Central Laboratory, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang, Guizhou 550002, China;
3 Guizhou Center for Disease Control and Prevention, Guiyang, Guizhou 550001, China;
4 Academy of Military Medicine, Academy of Military Sciences, Beijing 100001, China
蜱可携带病毒、细菌、寄生虫等病原体，是仅次于蚊虫的第二大传播病原体的媒介。蜱通过叮咬人、动物将病原体传播给人或者动物[1]。立克次体是一种专性细胞内寄生菌，可以引起多种人兽共患病[2]，其中斑点热群立克次体（spotted fever group rickettsiae，SFGR）在世界范围内分布广泛，新种不断被发现和报道，大多数被证明具有致病性，给人类和动物健康带来威胁。目前国内报道的SFGR有20余种，确认对人类致病的有8种[3]，其中包括黑龙江立克次体（Rickettsia heilongjiangensis）、劳氏立克次体（R. raoultii）、新塔拉塞维奇立克次体（Candidatus R. tarasevichiae）、西伯利亚立克次体（R. sibirica）、西伯利亚立克次体BJ-90（R. sibirica sp. BJ-90）、蒙那赛立克次体（R. monacensis）、日本立克次体（R. japonica）、信阳立克次体（Candidatus R. xinyangensis）、立克次体XY99亚种。我国关于SFGR的研究报道中，在叮咬人的全沟硬蜱（Ixodes persulcatus）体内检测到新塔拉塞维奇立克次体[4]，从边缘革蜱（Dermacentor marginatus）中检出劳氏立克次体等[5]，均是对人致病的SFGR。随着分子生物学技术的迅速发展，我国对蜱传立克次体的研究范围不断扩大，我国南方地区已有从媒介蜱检测出SFGR的报道，如2020年Liu等[6]在云南省5种蜱中发现了劳氏立克次体和敬信立克次体。在北方地区，2021年在中国哈尔滨市宠物犬体表寄生的全沟硬蜱及感染犬血液中检出了劳氏立克次体、新塔拉塞维奇立克次体和猫立克次体（R. felis）[7]。在我国新疆维吾尔自治区（新疆）的3属4种蜱中已发现9种立克次体的存在[8]。国外的报道中，2017年从韩国的发热患者中分离出蒙那赛立克次体（R. monacensis）[9]，2019年在意大利中部，研究者在人和动物体内均检测出对人致病的立克次体[10]，2020年韩国首次在犬寄生的长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）中分离出劳氏立克次体[11]，同年在美国的一项研究中，发现立氏立克次体（R. rickettsii）是唯一导致犬感染SFGR的病原体[12]。立克次体种类繁多，目前还有许多未被定种的立克次体对人致病的报道。而已发现立克次体可能只是冰山一角，亟需深入开展大规模流行病学调查及致病性研究。
贵州省独有的喀斯特地貌和山地环境，蜱种和可能携带的病原体情况不明。本研究从与人类密切接触的犬携带寄生蜱入手，通过分子生物学技术进行蜱种和SFGR鉴定，以初步了解犬寄生蜱种类、携带的立克次体情况以及蜱媒病存在的公共卫生风险。
1 材料与方法 1.1 蜱样本采集和DNA提取本研究选取贵州省贵阳市乌当区宠物中心（海拔1 263 m，106°58′12″E，26°46′48″N）进行宠物犬体表蜱检测，这些宠物犬均在宠物中心附近小区活动。于2021年3－5月，从10只宠物犬体表采集蜱；将蜱分别分装于200 μl的PCR管中，肉眼初步观察后大致分类选取数只在体视显微镜下进行拍照，记录蜱的背面观、腹面观等特征。根据蜱的不同发育阶段进行初步形态学鉴定[13]，加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）后用移液枪头捣碎虫体，使蜱DNA充分暴露。
1.2 聚合酶链式反应 1.2.1 蜱种鉴定采获的寄生蜱用分子生物学技术鉴定蜱种，采用PCR技术扩增蜱的线粒体16S rRNA基因片段进行检测，引物为16S-1（5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3'）、16S+1（5′-CTGCTCATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′）。
1.2.2 蜱传立克次体检测对提取的蜱DNA用立克次体特异性柠檬酸合酶基因（gltA）、外膜蛋白酶A基因（ompA）为靶标基因进行PCR扩增，检测蜱携带立克次体病原体的感染情况。引物：CS78（5′-GCAAGTATCGGTGAGGATGTAAT-3′）、CS323（5′-GCTTCCTTAAAATTCAATAAATCAGGAT-3′）；ompA-1F（5′-AAGCCACTTTATTCACCACCTC-3′）、ompA-2R（5′-ATCGGCAGGAGCATCAAA-3′）进行普通PCR（PCR仪，Biometra TADVANCED 96SG德国）。所有的PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司（简称生工）合成。gltA、ompA和16S rRNA基因扩增的反应体系均为：2×San Taq PCR Mix（生工）聚合酶10 μl；正反向引物各0.8 μl（10 μmol/L）；提取的蜱DNA 1 μl作为模板；用7.4 μl双蒸水（生工）补足体系，最终体积为20 μl。在每次反应中，用双蒸水和立克次体阳性样本（军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所提供）分别作为阴性对照和阳性对照。反应条件为：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 1 min变性，51 ℃ 1 min退火，72 ℃ 1 min的延伸温度下进行30个循环；72 ℃延伸5 min。取扩增的产物和DNA分子质量标准marker DL-2000（生工）各5 μl，用1.5%的琼脂糖凝胶经4S核酸染色剂（Gelgreen）染色后，在110 V的电压下电泳35 min（电泳仪，DYY-8C，北京），使用凝胶图像分析系统（Bio-Rad，Gel DocTM XR+，美国）在紫外光下观察结果。
1.3 测序和系统发育分析阳性产物送至生工进行测序，将测序成功的序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）注册的对应基因序列进行BLAST同源性比较，在GenBank数据库中下载参考序列，构建系统发育树并进行遗传进化分析。在MEGA 7.0软件中，通过邻接法（neighbor-joining method，NJ法）得到系统发育树及其稳定性和可靠性。
2 结果 2.1 蜱形态特征和16S rRNA基因的遗传进化分析从贵阳市共采获宠物犬寄生蜱133只，经过形态学特征分析，133只蜱均属于同一蜱种。光学显微镜下观察，有缘垛，假头基六角形，须肢较短，第1、2节腹面内缘刚毛粗大，多，排列紧密。盾板无色斑，刻点细且少，排列不均，有眼。足基节Ⅰ分叉，距裂深（图 1）。形态学具有血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）特征。
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| 图 1 蜱样本在显微镜下观察鉴定为血红扇头蜱 Figure 1 Tick samples identified as Rhipicephalus sanguineus under a microscope |
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扩增蜱线粒体基因16S rRNA，电泳阳性56只，选择31只送测序，其中8个样本测序成功，经BLAST序列比对，证实均为血红扇头蜱。其余23份样本序列存在基线噪音，不能排除干扰峰，但是通过外形鉴定，与测序成功样本形体鉴定特征一致。遗传进化发育树见图 2，本研究蜱序列（基因登录号：OM258177）与南非从犬检出的血红扇头蜱（基因号：KC243835.1）、印度血红扇头蜱（基因号：MH765331.1、MT026919.1、MT026920.1）属于同一分支，序列同源性均高达100%，而与波斯锐缘蜱（Argas persicus）（基因号：KR297208.1）、普通锐缘蜱（A. vulgaris）（基因号：AF001404.1）、粒形硬蜱（I. granulatus）（基因号：AB819235.1）、巴氏硬蜱（I. pavlovskyi）（基因号：AB819245.1）、简蝠硬蜱（I. simplex）（基因号：AB901140.1）的遗传距离较远，存在较大的差异。
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| 注：■本研究检测序列。 图 2 基于16S rRNA基因（362 bp）进行蜱种鉴定的系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of tick species identification based on the 16S rRNA gene (362 bp) |
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本研究采获蜱样本均按照单只一组进行样本核酸提取、序列扩增和鉴定。通过ompA扩增，43份样本有阳性条带，选取23份条带扩增较好样本送测序，仅有1份双向测序拼接成功。通过gltA扩增，50份有阳性条带，选取31份送测序，其中测序成功11份。
2.2.1 立克次体特异gltA基因的遗传进化分析通过立克次体gltA基因片段扩增，阳性扩增子测序成功序列BLAST比对后，在NCBI上选取同源性最高的序列和其他不同种SFGR基因序列构建系统发育树。由系统进化树得出本研究中的蜱立克次体gltA基因片段（基因号：OM275407）与分离自东北的黑龙江立克次体H12株（基因号：KT899087.1）、中国新疆纳氏革蜱（D. nuttalli）携带的斯洛伐克立克次体（R. slovaca）（基因号：MF002528.1）、劳氏立克次体新疆株（基因号：MF002517.1）均处于同一分支上，与该基因序列同源性高达99.71%，均有着较近的遗传进化关系，无法判断该立克次体的分类学位置。此外，本研究中的序列与小蛛立克次体（R. akari）（基因号：U59717.1）、澳大利亚立克次体（R. austrailis）（基因号：U59718.1）、R. asemboensis（基因号：KX544807.1）处于不同的分支，遗传关系较远；与马赛立克次体（R. massiliae）（基因号：U59719.1）和蒙大拿立克次体（R. montana）（基因号：U74756.1）等处于一个大的进化分支。见图 3。
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| 注：▲本研究检测序列。 图 3 基于立克次体gltA基因（339 bp）的系统进化发育分析 Figure 3 Phylogenetic analysis based on the Rickettsia-specific gltA gene (339 bp) |
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由于gltA基因不能准确进行种的鉴定，通过ompA基因片段进一步对立克次体进行分析。扩增阳性后测序成功序列经BLAST比对后，在NCBI上选取与ompA基因同源性最高的序列和其他不同种的SFGR对应序列构建系统发育树。本研究中蜱立克次体ompA基因片段（基因登录号：OM275406）与分离自中国西藏自治区纳氏革蜱携带的劳氏立克次体LYG390株（基因号：JQ792148.1）属于同一姐妹分支，同源性为99.23%；与劳氏立克次体WYG91株（基因号：JQ792163.1）亦处于同一分支，遗传进化关系较近（图 4）。该立克次体序列与从埃及分离的埃立克次体（R. aeschlimannii）（基因号：DQ379982.1）和马赛立克次体（R. massiliae）（基因号：U43799.1）处于同一进化簇；与西伯利亚立克次体（R. siberica）（基因号：U43807.1）、内蒙古立克次体（R. mongolotimonae）（基因号：DQ097082.1）遗传关系较远。
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| 注：●本研究检测序列。 图 4 基于立克次体ompA基因（351 bp）的系统进化发育分析 Figure 4 Phylogenetic analysis based on the Rickettsia-specific ompA gene (351 bp) |
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贵州省地处我国西南地区，高原山地居多，为独特喀斯特地貌，植被类型多样，是否适宜蜱的生存繁殖，是否有蜱媒病的传播和流行，至今研究甚少，本底不清。我国对蜱传立克次体的研究和关注由来已久，但以往文献数据记录大多在东北地区，在贵州省报道甚少。2021年在安顺市鉴定出新型立克次体敬信立克次体[14]，提示贵州省安顺地区极可能也是蜱媒病的自然疫源地，但贵州省生境多样，其他生境环境下蜱种和病原体携带情况不明。
本次研究选择与安顺市不同生境的贵州省中部地区进行调查研究，从与人类关系密切的宠物犬入手，发现了宠物犬携带血红扇头蜱。该蜱俗称棕色狗蜱，是广泛分布于犬体表的常见寄生虫，血红扇头蜱通常以犬作为传播病原体的宿主，人类和其他动物为其偶然宿主[15]。血红扇头蜱可传播多种人兽共患疾病的病原体，在意大利的一项研究中血红扇头蜱引起10只犬蜱麻痹疾病的发生[16]，巴西首次在血红扇头蜱中鉴定出Ca. R. asemboensis新型立克次体[17]。我国内蒙古自治区的血红扇头蜱与其他蜱种相比，携带立克次体的感染率最高[18]，我国台湾省于2021年首次发现血红扇头蜱感染R. parkeri、R. honei和R. felis[19]。贵州省既往从黔西南布依族苗族自治州安龙县发现有血红扇头蜱[20]，本次研究从贵州省中部贵阳市发现血红扇头蜱，该结果拓宽了对贵州省蜱分布的认识。
本研究在犬体表的血红扇头蜱中检测出劳氏立克次体DNA，与其他地区报道的劳氏立克次体更多在革蜱属和血蜱属中发现的结果不同，如我国江西省的嗜群血蜱（H. concinna）[21]、四川省的西藏革蜱（D. everestianus）、青海血蜱（H. qinghaiensis）[22]和湖北省的长角血蜱[23]中均曾检测到劳氏立克次体等。研究证实劳氏立克次体对人类具有致病性，感染劳氏立克次体可导致红斑淋巴结病和头皮处形成焦痂[24]，2014年在黑龙江省牡丹江林区医院首次报道2例劳氏立克次体感染病例[25]，2018年从19例患者和7名健康人中检测出劳氏立克次体[26]。在国外的研究报道中，最初发现劳氏立克次体感染人类的病例是在2006年西班牙1例患者血液中检测出DNA，法国于2009年诊断7例感染劳氏立克次体的病例[27]。劳氏立克次体感染人类的病例报道在持续增加，劳氏立克次体的确切分布情况还需更多研究。有研究证实血红扇头蜱主要传播康氏立克次体（R. conorii），可引起的人兽共患疾病是地中海斑疹热[28]，本研究结果揭示血红扇头蜱可能也是劳氏立克次体的潜在媒介。这一发现让我们对劳氏立克次体的潜在传播媒介和分布范围有了更多认识，为后续的研究提供了线索和奠定了基础。
本研究采用PCR对立克次体特异性gltA、ompA基因片段进行分析，配制扩增体系时首先进行试剂分装，确保试剂批次一致并避免污染；在每次扩增反应中，均用双蒸水和立克次体阳性样本作为阴性对照和阳性对照，同时设置空白对照，尽可能地排除实验室污染或假阳性结果。研究通过gltA和/或ompA基因分别扩增电泳阳性即判断为阳性，阳性率为49.62%（66/133）。但测序的部分序列存在基线噪音，不能排除干扰峰，不能通过PCR扩增和序列测定准确地进行阳性率判断。本研究所注册序列是经过重复试验和双向测序验证，避免测序错误造成的误差。由于gltA阳性扩增子测序成功序列经BLAST比对后，与黑龙江立克次体、劳氏立克次体、斯洛伐克立克次体均有相同的覆盖率和一致性，通过选取参考序列建立进化树后均处于同一分支，不能判断其分类学位置，因此本研究通过立克次体ompA基因分析进一步证实所鉴定立克次体为劳氏立克次体。
本研究所捕获蜱为犬体表吸血蜱。因此检测样本阳性并不能明确是蜱自身携带立克次体还是犬血中的立克次体，需进一步验证该蜱在传播劳氏立克次体中的作用。劳氏立克次体阳性提示无论是蜱携带还是犬感染立克次体，都存在立克次体通过宠物犬感染人的风险，应该加大蜱传立克次体的致病性研究和公共卫生调查。
志谢 贵州省人民医院中心实验室老师们对本课题给予支持和帮助，多宝莉宠物中心协助样本采集，一并志谢利益冲突 无
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