恙虫病又称丛林斑疹伤寒，是一种以啮齿动物为主要传染源，恙虫病东方体（Orientia tsutsugamsushi，Ot）为病原体，通过恙螨幼虫叮咬而传播的自然疫源性疾病。Ot为革兰阴性专性胞内寄生的杆菌，属于立克次体目（Rickettsiales）、立克次体科（Rickettsiaceae）、东方体属（Orientia）。目前Ot的分离方法主要是小鼠腹腔接种法，也可通过注射雄性豚鼠睾丸分离。培养方式多采用哺乳动物组织细胞培养^[1]，如L929、Vero、Hela细胞等，目前Ot也有在人类宿主细胞内的传统血液培养基中存活并生长的证据^[2]。Ot也可采用鸡胚卵黄囊培养，鸡胚培养多采用7~9 d的受精卵进行卵黄囊接种。Ot的初始浓度及相关的因素，可能是其分离成功的主要因素^[3]。

以往Ot依靠血清学方法进行分型、吉姆萨染色观察、外斐试验以及酶联免疫吸附试验（ELISA）等方式鉴定，随着分子生物学的发展，可以通过基因测序等方式鉴定。Ot的基因分型主要包括Karp、Kato、Gilliam、TA763、TA678、TA716、Kawasaki、Kuroki和Shimoloshi等，这些基因分型主要通过相对分子质量56 000的表面蛋白基因来区分。Ot的56 kDa型特异性抗原（56-kDa type-specific antigen，56 kDa TSA）基因开放阅读框在1 600 bp左右，含有516~541个氨基酸，是PCR检测最常用的扩增靶基因，巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异度。Ot的16S rRNA和groEL等基因序列相对保守，主要用来进行分类，无法对Ot的遗传多样性研究提供有用的数据^[4]。本文对云南省大理市捕获的啮齿动物进行Ot分离、鉴定并对56 kDa TSA基因分子特性进行了研究，现报告如下。

2020年8月－2021年8月在云南省大理市的银桥、大理、下关和凤仪4个乡（镇），以油炸食物为诱饵，放置鼠夹，采用夹夜法进行啮齿动物调查。捕获的啮齿动物立即带回实验室，进行形态学鉴定，同时利用PCR扩增肝组织DNA的线粒体细胞色素b（mt-Cytb）基因，进行分子生物学鉴定。记录所捕获动物的种类、地理位置、海拔高度及空气湿度。样本进行无菌解剖，分别采集心、肝、脾、肺、肠双份组织样品置于冻存管中，-80 ℃保存，1份用于Ot检测，另1份检测阳性的组织样品用于Ot分离。

Ot检测：无菌剪取用于检测的啮齿动物样品，约0.1 g肝或脾组织放入GeneReady动物PIII粉碎管（杭州遂真生物技术有限公司）中，加入灭菌的500 μl 7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS），再置于GeneReady Ultimate生物样本低温快速制备离心系统（杭州遂真生物技术有限公司）中进行研磨。研磨条件根据说明书的标准程序设定。核酸提取采用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），制备步骤按照说明书进行。Ot的巢氏PCR检测引物按照文献[5]针对Ot的56 kDaTSA基因进行扩增：Ot-Out-F1：5'-TACATTAGCTGCGGGTATGACA-3'；Ot-Out-R1：5'-CCAGCATAATTCTTCAACCAAG-3'；Ot-In-F2：5'-GAGCAGAGCTAGGTGTTATGTA-3'；Ot-In-R2：5'-TAGGCATTATAGTAGGCTGAGG-3'。Ot-Out-F1与Ot-Out-R1配对扩增：306~339 bp；Ot-In-F2与Ot-In-R2配对扩增：150~168 bp。

通过巢氏PCR检测，DNA测序为Ot阳性的标本，取出另1份，将肝、脾各取0.5 g放入研磨管内，加入500 μl的PBS，研磨匀浆。自然沉降匀浆液，腹腔注射ICR（Institute of Cancer Research，ICR，美国肿瘤研究所）小鼠（体质量12~14 g，3周龄），每份样品接种3只，每只200 μl。每日观察小鼠状态，濒死小鼠立即解剖观察其脏器改变，存活小鼠在接种12~14 d后处死。用同样方法盲传2代，健康小鼠腹腔注射等量生理盐水作为实验对照组。

参考Solarbio吉姆萨原液说明配制吉姆萨工作液，对小鼠的腹膜、脾脏、肝脏和肾脏涂片，甲醇固定后，进行吉姆萨染色，通过光学显微镜观察Ot形态。

将接种的小鼠脏器组织用冰冻切片机（LEICA CM3050 S）切成10 μm左右薄片，将切片室温晾干后，用冰丙酮固定，4 ℃过夜。加入人抗恙虫病的血清抗体（1∶40）作为一抗，湿盒中37 ℃孵育1 h，7.4 PBS洗涤3次。晾干后再加入荧光标记的兔抗人IgG抗体（1∶100）作为二抗，37 ℃孵育1 h，用PBS再次洗涤3次，晾干封片。荧光显微镜（LEICA 329-2）观察结果。

对分离的Ot用引物行走（primer-walking）法进行56 kDa TSA基因全长的扩增。首先根据1.2扩增的部分56 kDa TSA基因序列，通过BLAST比对，下载相似性高的Ot 56 kDa TSA全长序列，再进行ClustalⅩ2比对。用DNAStar 7.1软件设计引物，引物由Invitrogen公司合成（表 1），拼接出Ot 56kDa TSA全长。

表 1 本研究扩增恙虫病东方体56 kDa TSA基因全长所设计的引物 Table 1 Primers designed to amplify full-length 56 kDa type-specific antigen gene of Orientia tsutsugamushi in this study

表选项

根据2×EasyTaq^®PCR SuperMix酶的使用说明、引物的选择和扩增序列的长短不同，因而有不同的扩增条件。共使用3对半巢氏PCR进行扩增：①ICR-Ot-F_1~29与ICR-Ot-R_876~901配对扩增901 bp，ICR-Ot-F_1~29与ICR-Ot-R_876~901配对扩增739 bp；②ICR-Ot-F_265~286与ICR-Ot-R_993~1012配对扩增748 bp，ICR-Ot-F_351~373与ICR-Ot-R_993~1012配对扩增662 bp；③ICR-Ot-F_715~737与ICR-Ot-R_1546~1566配对扩增852 bp，ICR-Ot-F_876~901与ICR-Ot-R_1546~1566配对扩增691 bp。PCR循环扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，55~60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，30次循环；72 ℃延伸10 min。然后将PCR产物进行第2轮PCR，最终扩增出对应的PCR产物为1 566 bp。利用E.Z.N.A^® Gel Extraction Kit试剂盒将PCR产物纯化，进行Easy-T载体克隆，每份样品送3个克隆子到生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序。

序列由SeqMan组装并手动编辑，拼接获得Ot的56 kDa TSA基因组最终序列。

用BLASTN和BLASTX确定核苷酸序列和推导的氨基酸序列与NCBI/GenBank数据库序列的相似性。并用所分离得到的菌株56 kDa TSA全基因序列及其氨基酸序列使用Megalign程序与Karp、Boryong、Kato、TA763、Kawasaki 5标准株以及9株DALIV8相似株进行同一性比较。

将所测得拼接好的序列与GenBank中Ot的核苷酸序列做BLAST分析比较。运用MEGA Ⅹ软件中的邻接法（neighbor-joining method，NJ法）构建系统发育树，自展值取1 000，距离由最大似然数法计算。

在大理市4个乡（镇）共捕获啮齿动物5属6种76只，其中黄胸鼠（Rattus tanezumi）占55.26%（42/76）、褐家鼠（R. norvegicus）占35.53%（27/76）、高山姬鼠（Apodemus chevrieri）占3.95%（3/76）、大绒鼠（Eothenomys miletus）占2.62%（2/76）、针毛鼠（Niviventer fulvescens）占1.32%（1/76）、锡金小鼠（Mus pahari）占1.32%（1/76），黄胸鼠和褐家鼠为优势种。经PCR检测从1只黄胸鼠的肝、脾组织研磨液中扩增出Ot序列，阳性率为2.38%（1/42），其他啮齿动物未扩增出Ot。

将检测阳性的黄胸鼠肝、脾样本研磨接种3只ICR小鼠后盲传2代，共计接种12只，有3只接种后第14天死亡，其余小鼠存活，均观察到闭目、耸肩、毛皮发皱、颤抖、呼吸急促和不喜活动等症状。对接种Ot组与接种生理盐水对照组进行比较发现，感染组出现肝脾肿大，少量腹水。感染小鼠的脾脏体积增大3~5倍，肝脏体积增大1.5~3倍，肝脏、脾脏以及肾脏用肉眼观察出现充血红肿的表征（图 1）。感染小鼠组通过PCR检测阳性，将该分离株命名为DALIV8株。经过吉姆萨染色Ot，呈着色深染的紫红色颗粒，通常围绕在细胞核周围的胞质内（图 2），大小为（0.3~0.5）μm×（1.2~3.0）μm，呈短杆状、圆形等形态，偶在镜下可观察到Ot从细胞内释放的过程。

注：A对照组，未感染恙虫病东方体（Ot）小鼠脾脏；B实验组，感染Ot小鼠的脾脏。 图 1 恙虫病东方体感染ICR小鼠脾脏的比较 Figure 1 Appearances of spleen from ICR mice with and without Orientia tsutsugamushi infection

图选项

注：箭头所示为恙虫病东方体 图 2 恙虫病东方体感染ICR小鼠的肾脏组织涂片镜检结果（吉姆萨染色，×1 000） Figure 2 Microscopic findings of renal smear from ICR mice infected with Orientia tsutsugamushi (Giemsa-stained, ×1 000)

图选项

对2只接种感染Ot的ICR小鼠的肝、脾、肾组织进行冷冻切片，结果与健康ICR小鼠比较发现，Ot抗原颗粒在小白鼠动物模型的肝细胞胞浆内呈散在分布的阳性反应，荧光阳性亮度在脾脏组织内最强，在肾脏组织内最弱（图 3）。通过对比结果发现，Ot抗原颗粒在肾脏内的荧光亮度弱，较少出现在细胞胞浆内，与健康肾脏对比特异性并不明显。

注：A感染恙虫病东方体（Ot）小鼠脾脏组织；B感染Ot小鼠肝脏组织；C感染Ot小鼠肾脏组织；D未感染Ot小鼠脾脏组织；E未感染Ot小鼠肝脏组织；F未感染Ot小鼠肾脏组织。 图 3 ICR小鼠不同组织的间接免疫荧光试验结果（×400） Figure 3 Indirect immunofluorescence results of different tissues of ICR mice (×400)

图选项

通过PCR扩增，拼接获得DALIV8株56 kDa TSA基因核苷酸序列全长为1 566 bp，编码521个氨基酸。通过与表 2中从GenBank下载的14株Ot基因序列进行相似性比较，DALIV8株56 kDa TSA在核苷酸水平与Kawasaki、Boryong、Karp、Kato和TA763基因型相似性为82.30%~98.85%；在氨基酸水平相似性为74.04%~98.28%，该Ot分离株为TA763基因型（GenBank：OM914742）。见表 3。

表 2 本实验中使用的恙虫病东方体菌株背景信息 Table 2 Background information of Orientia tsutsugamushi strains used in this study

表选项

表 3 DALIV8分离株与其他Ot菌株56 kDa TSA全长核苷酸序列和氨基酸序列同源性比对 Table 3 Nucleotide and amino acid sequence alignment results of full-length 56 kDa type-specific antigen gene of DALIV8 strain with other reference Ot strains

表选项

将Ot分离株56 kDa TSA基因全长与TA763基因型最相似的HL03-1、KL0807a、Hualien-14和标准株TA763进行氨基酸比较，结果见图 4。

注：根据同源序列相似性进行上色，黑色为高度相似区域（保守性100%），灰色为相似区域（保守性60%~80%）。 图 4 DALIV8与4株TA763型56 kDa TSA基因氨基酸序列比较 Figure 4 Similarities in amino acid sequence of 56 kDa type-specific antigen gene between DALIV8 strain and four TA763 stains

图选项

将DALIV8株56 kDa TSA全基因序列与GenBank下载的Karp、Boryong、Kato、TA763和Kawasaki基因型的56 kDa TSA基因序列15株，基于核苷酸水平建立了系统发育树。系统发育树上DALIV8分离株与其他TA763聚集成一簇，在同一分支。见图 5。

注：●为本次实验的恙虫病东方体分离株（DALIV8）。 图 5 DALIV8分离株基于56 kDa TSA基因全长的核苷酸水平系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of DALIV8 isolate based on full-length 56 kDa type-specific antigen gene at nucleotide level

图选项

恙虫病在我国广泛分布，2006年后，云南省成为恙虫病的主要高发区之一^[6-7]，以黄胸鼠和褐家鼠为主要宿主动物，地理纤恙螨（Leptotrombidium deliense）为主要传播媒介^[8]。本研究在大理市捕获的啮齿动物中调查发现，虽然只有1只黄胸鼠为Ot PCR检测阳性，通过ICR小鼠仍分离到1株Ot，提示ICR小鼠用于Ot的分离相对比较敏感。

IFA发现小鼠肝细胞胞浆内呈散在分布的阳性反应，提示Ot感染会导致一定程度的肝损伤^[9]。其中脾脏阳性荧光分布最多，脾脏是恙虫病主要的靶器官。有学者研究表明，Ot通过足部感染后，向肺和心脏组织有明显的趋向性^[10]。

全世界已分离出40多种Ot血清型或抗原株^[11]，传统的血清分型是一个复杂的程序，需要参考血清和抗原，也会出现一些非特异性结合干扰结果的判断，因而用血清学方法进行Ot分型受许多因素的影响^[12]。ELISA尽管检测Ot特异性IgM抗体具有良好的敏感性和特异性，但对于诊断时间 < 7 d的早期疾病，PCR是实验室诊断确认的首选方法^[13]。利用分子生物学方法应用于Ot基因分型，可以揭示Ot菌株之间的遗传多样性。

本研究明确了DALIV8分离株为TA763型，TA763型首先从泰国王鼠（R. rajah）中分离到^[14]。我国Ot基因型分布，Karp型和Gilliam型在长江以南地区最为普遍，而Kawasaki型和Gilliam型主要分布在长江以北地区^[15]，云南省主要存在Karp、Kato和Gilliam型流行^[16]，本研究首次分离到TA763型，该基因型在云南省的分布有待于进一步研究。

56 kDa TSA是Ot特有的一种免疫显性外膜蛋白，是Ot特异性抗原。DALIV8分离株Ot在多个氨基酸位点发生改变，如在第37位A（丙氨酸）变为G（甘氨酸）、48位G（甘氨酸）变为S（丝氨酸）、52位A（丙氨酸）变为T（苏氨酸）、60位E（谷氨酸）变为D（天冬氨酸）。这4个突变位点是否影响Ot的抗原性或致病性，有待于进一步研究。

恙虫病是抗生素可治愈的疾病，如不加以适当的治疗，病死率可达30%~50%^[17]。恙虫病主要影响卫生基础设施较差的农村地区，但随着人员流动、旅游等，恙虫病的发病率逐年上升，广东、海南、广西、福建、浙江、云南、四川、湖南、海南和台湾等省（自治区）存在恙虫病自然疫源地，截至2015年，我国的34个省级行政区中，只有青海省和宁夏回族自治区无恙虫病病例报道^[18]，恙虫病已成为我国公共卫生关注问题。恙虫病的临床表现多种多样，包括焦痂、斑疹、肺炎、感染性休克和脑膜脑炎等，与疟疾和登革热等相似，虽然存在有效的治疗方案，但是尚无高效率特异性的诊断方法，在临床上诊断困难，加之目前为止还没有有效的疫苗^[19]，所以研制成功的Ot疫苗是目前急需解决的问题；治疗恙虫病的氯霉素、四环素等抗生素，对孕妇和儿童的副作用大，抗生素已成为一个重大的全球卫生保健问题，持续使用不同的抗生素治疗Ot可能导致多重耐药菌株的产生^[20]，因而有必要研发治疗恙虫病副作用小而又抗耐药的药物。而Ot的分离是相关问题解决的前提。本研究基于Ot的菌株分离，了解其分子特性，为明确恙虫病发病机制及药物和疫苗研发奠定了基础。

利益冲突  无