沃尔巴克氏体（Wolbachia）是广泛存在于节肢动物体内，经母系遗传的专性胞内共生菌，属于α-变形菌门^[1]，可自然感染约66%的昆虫种类和28%的蚊虫种类^[2]。研究显示沃尔巴克氏体可操纵宿主的繁殖，引起胞质不相容性，后代产的卵不会孵化^[3]；并且沃尔巴克氏体可影响虫媒病毒的传播潜力，但不同菌株的作用不一致，如wMelPop株沃尔巴克氏体增强西尼罗病毒复制，而wAlbB株抑制西尼罗病毒和登革病毒等复制^[4-5]，同时wAlbB株沃尔巴克氏体抗病毒作用与其密度呈正相关^[6-7]。目前基于沃尔巴克氏体的蚊媒防控策略已在多个国家实施，并被世界卫生组织（WHO）认可^[8-11]。2005年Xi等^[12]将白纹伊蚊（Aedes albopictus）wAlbB株沃尔巴克氏体导入埃及伊蚊（Ae. aegypti）卵内，构建了稳定携带高密度沃尔巴克氏体的WB株埃及伊蚊。研究显示wAlbB株沃尔巴克氏体对埃及伊蚊生活史特征如寿命、繁殖力等影响较小，在野外实验中能很好地侵入蚊虫种群并且维持较高的沃尔巴克氏体密度，对登革热传播有显著抑制作用，可作为良好的生物防治剂^[13]。

作为胞内共生菌，沃尔巴克氏体基因组很小，为0.96~1.70 Mb^[14]，很大程度上依赖宿主的氨基酸和碳水化合物增殖^[15-16]。已有研究发现不同饮食可以影响果蝇（Drosophila）沃尔巴克氏体密度，并且对果蝇卵母细胞和体细胞沃尔巴克氏体密度影响并不完全一致^[17]，而关于饮食对蚊虫体内沃尔巴克氏体密度的研究知之甚少。本研究以WB株埃及伊蚊为研究对象，观察了膳食葡萄糖、白糖和血餐条件下，WB株埃及伊蚊卵巢、脂肪体和其他剩余组织内沃尔巴克氏体密度变化，为研究饮食对蚊虫生殖和非生殖组织沃尔巴克氏体密度调控作用提供基础，并对WB株埃及伊蚊实验室饲养提供数据支持。

实验所用WB株埃及伊蚊由广州威佰昆生物科技有限公司赠予。实验室饲养条件为：温度（25±1）℃，湿度（75±5）%，光照周期（L∶D）=14 h∶10 h。幼蚊喂食专用幼蚊饲料，购于广州威佰昆生物科技有限公司。成蚊按实验要求给予相应饮食。

葡萄糖（天津市科密欧化学试剂有限公司）、白糖（广州华糖食品有限公司）；ICR小鼠[斯贝福（北京）生物技术有限公司]；蛋白酶K（北京索莱宝科技有限公司），TB Green（宝生物工程有限公司）；恒温低温槽（上海菁海有限公司），微量高速冷冻离心机（广州吉迪仪器有限公司），NanoDrop Lite（美国赛默飞世尔科技公司），荧光定量PCR仪（美国ABI7300），体视显微镜（重庆光电仪器有限公司），迷你手持均质仪（杭州米欧仪器有限公司）。

蚊虫羽化后分为葡萄糖组、白糖组和血餐组。葡萄糖组：蚊虫羽化后喂食葡萄糖（1 g葡萄糖溶于10 ml双蒸水中）；白糖组：蚊虫羽化后喂食白糖（1 g白糖溶于10 ml双蒸水中）；血餐组：蚊虫羽化后喂食葡萄糖，3 d时给予血餐2 h，挑选饱腹蚊虫；收集4、4.5、5、6日龄蚊虫。低浓度CO₂麻醉蚊虫，先后在75%乙醇溶液和生理盐水中浸泡10 s，然后在体视显微镜下解剖蚊虫卵巢、脂肪体以及其他剩余组织，将各组织置于含有DNA裂解液的1.5 ml离心管中，卵巢1对/管，脂肪体、其他剩余组织1个/管，-20 ℃保存备用。

1.5 ml离心管中加入150 μl DNA裂解液，电动匀浆器充分研磨组织后，加入10 mg/ml的蛋白酶K溶液5 μl/管，混匀后56 ℃水浴过夜。加入氯仿∶异戊醇（24∶1）溶液150 μl/管，颠倒混匀后4 ℃ 12 000×g离心10 min。取上清液至新的1.5 ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3 mol/L醋酸钠溶液，轻轻颠倒混匀，-20 ℃放置4 h。4 ℃ 12 000×g离心10 min。弃上清，每管加入1 ml 75%乙醇溶液，4 ℃ 12 000×g离心10 min，重复洗涤1次。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。加入10 μl灭菌双蒸水溶解DNA沉淀，-20 ℃保存备用。

核糖体S6蛋白（ribosomal protein S6，RPS6）为内参基因。引物RPS6-F：GAAGTTGAACGTATCGTTTC；RPS6-R：GAGATGGTCAGCGGTGATTT；沃尔巴克氏体表面蛋白（Wolbachia surface protein，WPS），引物QBREV：AGTTGTGAGTAAAGTCCC；183F：AAGGAACCGAA GTTCATG，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qPCR反应体系20 μl：TB Green 10 μl，正、反向引物各0.8 μl，ROX Reference Dye0.4 μl，ddH₂O 7 μl，DNA模板1 μl。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。沃尔巴克氏体密度定量采用RPS6和WSP基因双标准曲线法计算，RPS6标准曲线为：y=-3.521$ x $+47.862，R²=0.999；WSP标准曲线为：y=-3.485$ x $+45.644，R²=0.999[y为循环阈值（cycle threshold，Ct），$ x $为起始模板浓度的lg值]，以WSP/RPS6的值定量沃尔巴克氏体密度^[18]。

采用SPSS 20.0软件对所有数据进行统计分析，数据用中位数M（P₂₅，P₇₅）表示。采用Kruskal-Wallis H检验，比较3种不同饮食条件和不同日龄时沃尔巴克氏体密度变化的差异，P < 0.05为差异有统计学意义。

在葡萄糖、白糖和血餐条件下，4.5 d时蚊虫卵巢沃尔巴克氏体密度分别为2.149、2.773和0.761，血餐组显著降低，白糖组最高（H=40.754，P < 0.001）；而脂肪体沃尔巴克氏体密度分别为0.859、1.189和1.298，其他剩余组织沃尔巴克氏体密度分别为0.505、0.405和1.012，均为血餐组最高，而葡萄糖组和白糖组差异无统计学意义（H=1.631，P=0.442；H=6.306，P=0.043）。见图 1。

注：与血餐组比较，a P < 0.001；b P < 0.05。 图 1 4.5 d时3种饮食对埃及伊蚊卵巢、脂肪体和其他剩余组织沃尔巴克氏体密度的影响 Figure 1 Effects of three diets on Wolbachia densities in ovary, fat body, and the other tissues of female Aedes aegypti of WB strain on day 4.5

图选项

同一日龄3种饮食条件下，蚊虫卵巢沃尔巴克氏体密度在4、5、6 d时为血餐组较低（表 1），且在4和6 d时白糖组最高（H=14.335，P=0.001；H=22.049，P < 0.001；H=4.963，P=0.084）。脂肪体4和6 d时的沃尔巴克氏体密度及其他蚊虫剩余组织沃尔巴克氏体密度，均表现为血餐组 > 白糖组 > 葡萄糖组（H=7.186，P=0.028；H=10.504，P=0.005；H=16.338，P < 0.001；H=14.083，P=0.001；H=4.266，P=0.118）。

表 1 WB株埃及伊蚊各组织在3种饮食条件下不同日龄的沃尔巴克氏体密度 Table 1 Wolbachia densities in all tissues of female Aedes aegypti of WB strain at different days of age under three diets

表选项

不同日龄同一饮食条件下，葡萄糖组蚊虫卵巢和脂肪体沃尔巴克氏体密度随日龄增加先上升后下降，其他剩余组织沃尔巴克氏体密度随日龄增加呈增加趋势，但差异无统计学意义（H=4.683，P=0.096；H=2.451，P=0.294；H=0.293，P=0.864）；在白糖饮食条件下，蚊虫卵巢和脂肪体沃尔巴克氏体密度随日龄变化有增加趋势，但差异无统计学意义（H=4.731，P=0.094；H=0.390，P=0.823）。血餐条件下，蚊虫卵巢和脂肪体沃尔巴克氏体密度均随日龄先降低后上升，差异有统计学意义（H=20.572，P < 0.001；H=9.675，P=0.008）；而其他剩余组织沃尔巴克氏体密度随日龄增加有增加趋势，但差异无统计学意义（H=0.344，P=0.842）。见表 1。

埃及伊蚊是重要的蚊媒病毒病传播媒介。目前基于沃尔巴克氏体控制蚊虫的新策略正在全球推广^[19]，而如何维持高密度的沃尔巴克氏体对于其发挥生物防治作用至关重要。研究表明沃尔巴克氏体依赖于宿主资源进行代谢^[20]，在实验室条件下，糖类物质提供维持蚊虫生存所需的能量，血餐提供丰富的蛋白质成分促使卵巢发育^[21-22]，但其对于蚊虫体内沃尔巴克氏体的密度调节并不清楚。

本研究发现卵巢沃尔巴克氏体密度在血餐时较低，而脂肪体和其他剩余组织沃尔巴克氏体密度大致表现为血餐时相对较高。Serbus等^[17]对果蝇研究发现富含酵母饮食，降低果蝇卵母细胞沃尔巴克氏体密度而增高体细胞沃尔巴克氏体密度。因此认为高蛋白饮食对生殖组织和非生殖组织中沃尔巴克氏体密度影响是不同的，与本研究结果类似。已知血餐可刺激大脑释放胰岛素样肽（insulin-like peptide，ILP）和卵巢蜕皮激素（ovary ecdysteroidogenic hormone，OEH）等激素^[23]，血餐中蛋白质分解产生的氨基酸能激活雷帕霉素靶蛋白复合物1（target of rapamycin complex 1，TORC1）^[24]，并且ILP也可以通过激活胰岛素信号促进TORC1的激活^[25-26]。TORC1是自噬的负调节因子，TORC1的激活可抑制自噬的发生^[27]，提示血餐后蚊虫生殖组织和非生殖组织沃尔巴克氏体密度的不同变化可能与自噬有关。近期研究也表明，通过RNA干扰技术抑制果蝇自噬，果蝇生殖细胞沃尔巴克氏体密度降低而体细胞沃尔巴克氏体密度增高，表明自噬对果蝇生殖细胞和体细胞沃尔巴克氏体密度的调节作用相反^[28]。其次本研究发现血餐后蚊虫卵巢和脂肪体沃尔巴克氏体密度随日龄增加表现为先降低后增高，与卵黄蛋白原（vitellogenin，Vg）的表达有相同趋势。研究表明富含蛋白质的血餐、ILP和OEH等共同刺激脂肪体产生Vg，随后Vg运输到卵巢，促进卵巢发育^[29-30]。血餐后24 h脂肪体内Vg达到高峰，36~48 h下降，72 h又轻微上升^[31-32]。对灰飞虱（Laodelphax striatellus）的研究也发现，蚊虫卵巢沃尔巴克氏体密度随Vg变化而改变^[33]。因此，推测血餐后各组织沃尔巴克氏体密度的时间变化可能与激素水平有关。

本研究中喂食埃及伊蚊白糖饮食后各组织沃尔巴克氏体密度除卵巢组织5 d时低于葡萄糖组外，其他均高于葡萄糖饮食。白糖即蔗糖，是由果糖和葡萄糖构成的二糖。有研究发现膳食蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖等二糖都增加果蝇卵母细胞沃尔巴克氏体密度，可能与蔗糖的胰岛素抵抗作用有关，亦或与二糖分子的特异性结构有关^{[17, 34]}。此外本研究中白糖饮食后WB株埃及伊蚊卵巢和脂肪体沃尔巴克氏体密度随日龄增加有升高趋势，与WB株埃及伊蚊整蚊沃尔巴克氏体密度随日龄增加而增加结果较一致^[18]。可能是由于随日龄增加卵泡发育成熟体积变大，沃尔巴克氏体有更大的生存空间^[35]。并且沃尔巴克氏体具有母系遗传、操纵宿主生殖系统等生物学特性^[36]，因此沃尔巴克氏体理论上能够更多的入侵、定植卵巢。但由于检测间隔时间较短，因此各组织中沃尔巴克氏体密度增加并不显著。

本研究发现血餐和糖餐对WB株埃及伊蚊生殖和非生殖组织沃尔巴克氏体密度影响不一，说明饮食对蚊虫体内沃尔巴克氏体密度有不同的调控作用，为进一步研究其具体调控机制提供基础。另外本研究中不同糖餐也影响蚊虫体内沃尔巴克氏体密度，相较于葡萄糖单糖，喂食白糖可获得更高密度的沃尔巴克氏体。而将沃尔巴克氏体应用于控制蚊媒，释放大量能稳定携带高密度沃尔巴克氏体的蚊虫是其关键因素，因此，提示在工厂化生产感染沃尔巴克氏体蚊虫时，可选用白糖饲养，以获得高密度的沃尔巴克氏体。本研究尚未同时用多糖验证其对蚊虫沃尔巴克氏体密度的影响，后续可进一步探究。

利益冲突  无