淡色库蚊（Culex pipiens pallens）是我国北方入室吸血的主要蚊种，班氏丝虫病的传播媒介，西尼罗热的潜在媒介，流行性乙型脑炎的可能传播媒介^[1]。淡色库蚊不仅传播疾病，且通过刺叮吸血来骚扰人类的日常工作和生活。淡色库蚊的幼虫主要孳生于污水沟、水塘等脏乱且不易清理积水的地方，并且这些地方控制蚊虫主要以杀虫剂为主。但长期、大量、大面积地使用杀虫剂，使得淡色库蚊的抗药性发展迅速。从20世纪60年代开始监测淡色库蚊的抗药性，至今为止多地均已检测出淡色库蚊野外种群存在抗性^[2]，在鲁西南、苏中、东北等地区的淡色库蚊均产生不同程度抗性^[3-6]。拟除虫菊酯类杀虫剂是病媒生物防治中使用最广泛的杀虫剂，其中使用较多的为氯菊酯、溴氰菊酯等^[7]。

为了更科学、高效地防治病媒生物，需要了解其对杀虫剂的抗药性，从而制定更科学有效的杀虫剂使用方案。在抗药性监测中，一般以测定成蚊在诊断剂量下的死亡率表示抗性程度。但是在生物测定敏感性实验中，蚊虫的性别、日龄不同均会对杀虫剂敏感性产生差异，同时由于诊断剂量法仅能获得1个杀虫剂浓度下成蚊的死亡率，无法了解其他浓度时性别对成蚊杀虫剂敏感性的影响。本文通过测定成蚊的半数致死浓度（LC₅₀）制定毒力回归线，研究淡色库蚊成蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂敏感性的影响因素，为淡色库蚊成蚊抗性监测及防控提供依据。

（1）北京品系（BJ）：淡色库蚊实验室品系，由20世纪70年代引入实验室的北京种群，进入实验室后未接触杀虫剂饲养至今。（2）北京敏感品系（BJS）：淡色库蚊实验室选育的敏感品系，由70年代引入实验室的北京种群经敏感性反选育获得。2009－2011年，用溴氰菊酯（F1～F11）、氯菊酯（F12～F16）和高效氯氰菊酯（F17～F22）反选育，获得BJS。（3）天津品系（TJ）：淡色库蚊实验室品系，引自天津种群。

试虫均在温度（25±1）℃、相对湿度（75±5）%、光照周期（L∶D）=14 h∶10 h环境中饲养。其中幼蚊供以猪肝粉和酵母粉，成蚊以10%糖水饲养，用小白鼠供血后产卵。

活虫判定标准：可以正常站立和飞行。

试虫击倒判定标准：停落时不能站立或背面着地时，翅膀和腿有活动能力但不能飞行。

试虫死亡判定标准：没有生命迹象、不能飞行、停落时不能站立和移动。

96.22%氯菊酯，由江苏优嘉植物保护有限公司生产；98.6%溴氰菊酯，由印度TAGROS公司生产。乙醚（分析纯）为天津化学试剂二厂生产，丙酮（分析纯）为北京化工厂生产，液体石蜡（化学纯）为国药集团化学试剂有限公司生产，白糖。DNA提取试剂盒为无锡百泰克生物技术有限公司生产，Taq PCR预混液[2×EasyTaqTMPCR SuperMix（+dye）]为北京全式金生物技术有限公司生产，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

药膜纸、接触筒、电动吸蚊器、移液器、奥克斯E11140型Explorer^TM分析天平（感量为0.1 mg）、SANYO MLR-350型植物光照培养箱、加湿器、电暖器、纱布、棉球等。

采用接触法^[8]，根据世界卫生组织标准方法制做药膜^[9]，每个处理及对照均做3组重复。每次吸取20~25只成蚊，雌蚊与雄蚊分开实验。水平放置接触筒接触1 h，1 h后记录击倒试虫数，并将接触筒中蚊虫转移至恢复筒中，放入培养箱饲养，24 h后计算死亡试虫数。分别计算击倒率和死亡率。

使用BJS品系的2、3~5、6日龄雌、雄成蚊，按1.4.1的方法分别进行测定，以了解不同日龄淡色库蚊成蚊24 h自然死亡率。

使用TJ品系的3~5日龄雌雄成蚊，按1.4.1的方法分别测定成蚊对氯菊酯的敏感性，以分析性别对成蚊敏感性的影响。

DNA提取及电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channel，VGSC）基因的扩增和测序取单只淡色库蚊成蚊，提取基因组DNA。用正向引物CD1：5'-GAC CTG CCA CGG TGG AAC T-3'，和反向引物CD2：5'-TTG GAC AAA AGC AAG GCT AAG-3'^[10]，扩增VGSC基因结构域S6节段。PCR反应体系为25 μl，包含基因组DNA2 μl，2×Taq PCR预混液12.5 μl，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μl，ddH₂O8.5 μl。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；35个循环94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。将PCR扩增产物测序。

用SPSS 25软件中的Probit回归，获得LC₅₀及其95%置信区间（95%CI）、毒力回归线的斜率b值、χ²值、自由度等。并用SPSS 25软件进行χ²检验，判断不同处理间死亡率的差异，P < 0.05为差异有统计学意义。应用Seqman、MEGA Ⅹ软件对测得的VGSC基因部分序列进行峰图比对和分析，计算击倒抗性基因（kdr）突变频率（kdr频率）。对照组死亡率 < 5%时无需校正，在5%~20%时则需进行校正，> 20%则实验失败。

日龄对淡色库蚊雄成蚊24 h自然死亡率的影响大于雌成蚊（表 1）。在实验室控制条件下，雄蚊2、3~5、6日龄的24 h自然死亡率分别为2.08%、1.39%和89.25%；雌蚊2、3~5、6日龄的24 h自然死亡率均为0。雄成蚊24 h自然死亡率均随着日龄的增加而增加，雄蚊日龄超过5日后，日龄越高，雄蚊越脆弱，差异有统计学意义（χ²=148.415，P < 0.001）。当日龄 > 5日时，其对雄成蚊比雌成蚊24 h自然死亡率的影响更为明显，差异有统计学意义（χ²=110.463，P < 0.001）。而日龄≤5日时，雌成蚊与雄成蚊的差异无统计学意义（χ²=2.100，P=0.147）。

表 1 不同日龄淡色库蚊成蚊24 h自然死亡率 Table 1 The 24-hour natural mortality of adult Culex pipiens pallens at different ages

表选项

不同性别成蚊在相同药物、相同浓度和实验条件下，对杀虫剂雄蚊比雌蚊敏感（表 2）。0.225%氯菊酯时的雌、雄蚊24 h死亡率分别为11.06%和38.85%，差异有统计学意义（χ²=13.483，P < 0.001）；0.506%氯菊酯时的雌、雄蚊死亡率分别为54.13%和96.24%，雄成蚊24 h死亡率大于雌成蚊，差异有统计学意义（χ²=37.122，P < 0.001）。

表 2 不同性别淡色库蚊成蚊对氯菊酯的敏感性 Table 2 The sensitivity of female and male adult Culex pipiens pallens to permethrin

表选项

3个实验室品系中，对氯菊酯的敏感性雌成蚊为BJ≈BJS > TJ、雄成蚊为BJ > BJS≈TJ（≈表示2个品系对杀虫剂的敏感性差异无统计学意义）。雌成蚊对氯菊酯的LC₅₀均大于雄成蚊（表 3）。由毒力回归线的斜率b值来看，BJ雄蚊的b值最大。各品系的相对抗性倍数均 < 3.0。

表 3 实验室淡色库蚊成蚊对氯菊酯和溴氰菊酯的敏感性 Table 3 The susceptibility of laboratory strains of adult Culex pipiens pallens to permethrin and deltamethrin

表选项

BJ、BJS的雌成蚊对氯菊酯的敏感性LC₅₀及其95%CI分别为0.258%（0.222%~0.304%）和0.283%（0.239%~0.334%），置信区间有交集，差异无统计学意义；BJS、TJ的雌成蚊对氯菊酯的敏感性LC₅₀及其95%CI分别为0.283%（0.239%~0.334%）和0.457%（0.413%~0.508%），置信区间无交集，差异有统计学意义。

3个实验室品系中，对溴氰菊酯的敏感性雌成蚊为BJ > BJS≈TJ、雄成蚊BJ≈BJS。并且除了BJ的雌成蚊对溴氰菊酯的LC₅₀小于雄成蚊，其余为雌成蚊对溴氰菊酯的LC₅₀均大于雄成蚊（表 3）。由毒力回归线的斜率b值来看，TJ雌蚊的b值最大。BJS和TJ的雌蚊相对抗性倍数均 > 3.0倍，分别为4.4和5.4倍。

BJS、TJ的雌成蚊对溴氰菊酯的敏感性LC₅₀及其95%CI分别为0.080%（0.066%~0.099%）和0.098%（0.079%~0.127%），置信区间有交集，差异无统计学意义。

溴氰菊酯对淡色库蚊成蚊的毒力强于氯菊酯，但不同品系的相对毒力倍数不同（表 3）。溴氰菊酯对BJ、BJS、TJ雌蚊的毒力是氯菊酯毒力的10.8、3.5和4.7倍，3个品系均显示溴氰菊酯的毒力强于氯菊酯。

BJ kdr频率高于BJS和TJ。PCR扩增得到大小为513~525 bp片段（图 1）。其中BJ的1014位点存在苯丙氨酸突变成亮氨酸，即由TTA置换为TTT，L1014F型突变（图 2）。BJ成蚊kdr频率为15.96%（表 4），BJS和TJ未检测到突变。

注：M表示marker；1~2北京品系；3北京敏感品系；4天津品系。 图 1 淡色库蚊第Ⅱ结构域S6节段扩增电泳结果 Figure 1 Electrophoretogram of amplification of S6 segment of domain Ⅱ in Culex pipiens pallens

图选项

注：SS敏感基因型；RS杂合子基因型；RR抗性基因型。 图 2 淡色库蚊电压门控钠离子通道基因1014位点测序峰图 Figure 2 Sequencing chromatogram of the 1014 locus of the voltage-gated sodium channel gene in Culex pipiens pallens

图选项

表 4 实验室品系淡色库蚊的kdr基因突变频率 Table 4 The knockdown resistance mutation rates of laboratory Culex pipiens pallens strains

表选项

BJ成蚊与BJS成蚊相对比，对氯菊酯敏感性没有差异。尽管其kdr基因突变频率存在差异，但是这2个品系的成蚊对氯菊酯的敏感性并无差异。其可能原因是：（1）钠离子通道基因不是显性遗传（多为不完全显性，少数为完全隐形）^[11-13]，kdr为第3染色体上的隐形遗传因子^[14]，所以影响生物测定结果主要是抗性纯合子RR。表 4可以看出抗性纯合子的频率很低，因此，2.13%的kdr纯合子突变对BJ的抗性表型贡献很小，尚不能通过生物测定检测出其抗性的表现型。（2）幼蚊抗性与成蚊抗性可能存在差异。BJS在长期的饲养过程中，幼蚊经过了不同世代的溴氰菊酯（F1~F11）、氯菊酯（F12~F16）和高效氯氰菊酯（F17~F22）敏感反选育，2014年检测到BJS幼蚊对3种杀虫剂的敏感性均有所升高，较BJ分别增加了13.88、2.03和4.51倍^[15]。而本文测定的为成蚊敏感性，淡色库蚊的幼蚊阶段和成蚊阶段对拟除虫菊酯的抗性机制可能不同。

通过不同时期对BJ与BJS的VGSC基因检测可见，在淡色库蚊实验室封闭饲养的品系中，淡色库蚊kdr频率是稳定的。本研究所测BJS的kdr频率和2014年张晓越^[15]所测BJS的kdr频率一致。2009年Liu等^[16]所测BJ的kdr频率为17.20%，与本研究中kdr频率（15.96%）接近。2个研究BJ的kdr频率虽相差不大，但是本研究所测RR（%）为2.13%，而Liu等^[16]所测为0，同时本研究RS（%）相对降低，SS（%）相对增大。这可能是因为Liu等所测样本量为47只，而本研究所测样本为94只，可能抗性基因频率较低，47只样本不足以检测到突变纯合子。

除成蚊性别、日龄不同会引起杀虫剂敏感性产生差异外，饲养及实验操作也可能会对实验结果有一定影响：（1）饲料配方会导致代谢酶系发生一定程度的变化。（2）试虫饲养密度高，个体偏小，对杀虫剂的敏感性就会提高。（3）实验操作过程，转移试虫不当，会对蚊虫造成一定程度的机械损伤，也会影响蚊虫的敏感性。（4）饲养温度影响淡色库蚊成蚊的发育周期、体质量、脂肪含量等，进一步影响试虫对杀虫剂的敏感性。

利益冲突  无