2022, Vol. 33扩展功能
文章信息
- 李婷, 廖嵩, 徐业, 王常禄, 王建国
- LI Ting, LIAO Song, XU Ye, WANG Chang-lu, WANG Jian-guo
- 热带臭虫转录组分析
- Transcriptome analysis of Cimex hemipterus (Hemiptera: Cimicidae)
- 中国媒介生物学及控制杂志, 2022, 33(1): 54-61
- Chin J Vector Biol & Control, 2022, 33(1): 54-61
- 10.11853/j.issn.1003.8280.2022.01.010
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文章历史
- 收稿日期: 2021-08-16
2 Department of Entomology, Rutgers, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ 08901, USA
2 Department of Entomology, Rutgers, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ 08901, USA
热带臭虫（Cimex hemipterus）和温带臭虫（C. lectularius）都隶属半翅目（Hemiptera）、臭虫科（Cimicidae）、臭虫属（Cimex），是吸食人血的无翅昆虫，这2种臭虫在我国均有分布[1]。该臭虫通常发生在集体宿舍、火车、宾馆等人员密集或流动性强的环境，藏匿在床板、沙发缝隙处。人被臭虫叮咬后，皮肤常出现红肿、瘙痒等症状，部分严重者可产生全身过敏反应；长期被臭虫叮咬、吸血，还会诱发失眠、焦虑、抑郁等疾病的产生[2-4]。20世纪50－60年代，经过“除四害”活动的大力防治后，臭虫销声匿迹了一段时间。但近10多年来，臭虫在我国部分地区日益常见，存在广泛发生的风险[5-8]；其中尤以珠三角地区最为严重，研究发现该地区的臭虫种类为热带臭虫[9-10]。目前我国有关臭虫的研究相对较少，相较于温带臭虫，热带臭虫的研究相对缺乏，且我国的臭虫研究主要集中在基础生物学、再猖獗原因探讨以及防治应用等方面，关于热带臭虫分子生物学方面的研究相对滞后[11-17]。
近年来，基于高通量测序的转录组分析逐渐成为发掘非模式生物功能基因的一种有效手段[18]。转录组是指在某一生理条件下，细胞或组织内所有转录产物的总和[19]。同一细胞，生长条件或生长周期不同，转录表达也不尽相同。首先进行转录组学方法研究的昆虫是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）[20]，随着新一代测序技术的发展，庆网蛱蝶（Melitaea cinxia）[21]、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）[22]、拟暗果蝇（D. pseudoobscura）[23]等越来越多的昆虫转录组数据被获得，其中热带臭虫相近种，温带臭虫的转录组研究早已拉开序幕。昆虫转录组学的主要研究集中在4个方面：（1）分子遗传方面，如发掘大量的简单重复序列（SSR）位点和单核苷酸多态性（SNP）位点等分子标记[14]。（2）生长发育方面，如昆虫不同发育过程中相关基因的差异表达。（3）环境抗逆方面，如昆虫对低温、农药等不良环境的响应和适应。（4）行为生态学方面和生物间互作方面。从转录组水平研究昆虫，对全面揭示昆虫系统发生与进化、生长发育机制、对环境的适应性以及与其他生物相互作用等均具有重要意义[24]。
为了填补热带臭虫遗传组成信息的缺失，本研究利用高通量测序技术对该臭虫进行转录组测序，并对数据进行拼接、组装、基因功能注释、功能分类和代谢途径分析；分析测序的结果，并描述热带臭虫中可能存在的基因和基因产物属性，对其功能进行预测和分类，为后期相关的研究提供基础的分子生物学信息；并简单探究热带臭虫转录组SSR位点和SNP位点的分布规律，可为后期热带臭虫的SSR和SNP分子标记开发、遗传多样性分析等研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料热带臭虫，采集于广东省深圳市龙华区的一居民楼，收集活体至标本管，带回江西农业大学入侵生物实验室，在室内用去纤维化羊血进行饲养。饲养条件：温度（28±1）℃，相对湿度（60±5）%，光照周期（L∶D）=14 h∶10 h。经过形态学和分子生物学双重鉴定，结果一致，确定该臭虫为热带臭虫。选取1周未喂血饥饿处理后的各龄期臭虫混合样本（1~5龄若虫，雌雄成虫均有），先用RNase-free水冲洗，并吸干表面水分，收集后立即放入液氮保存。
1.2 方法将液氮处理后的样本用干冰快递至上海凌恩生物科技有限公司。按照试剂盒TRIzol® Reagent（Invitrogen）的说明书操作步骤进行总RNA的提取，并利用DNase I（TaKaRa）去除DNA。通过2100 Bioanalyser（Agilent）测定RNA的浓度（ng/μl），使用Nanodrop 2000（NanoDrop Technologies）对其纯度[吸光度（A）A260/A280比值]进行定量检测。取2 μl RNA用于琼脂糖凝胶电泳，分析其降解程度并确定是否被污染，判断完整性。将满足要求的热带臭虫RNA样本进行转录组测序及原始数据分析。
1.2.1 文库构建和测序取1 μg上述总RNA，采用Illumina（San Diego，CA）公司的TruSeq® RNA Sample Preparation Kit v2试剂盒构建RNA-seq转录组文库。利用磁珠法分离mRNA后，离子打断mRNA。然后进行双链cDNA的合成、补平，3′端加A、连接index接头等程序。用2%琼脂糖对200~300 bp的cDNA目标片段进行筛选，然后用Phusion DNA聚合酶（NEB）扩增15个PCR循环。用TBS380（Picogreen）定量后，用Illumina NovaSeq 6000测序仪（150 bp*2，Shanghai BIOZERON Co.，Ltd）对文库进行高通量深度测序。
1.2.2 数据的组装与功能注释为了保证数据分析质量，使用trimmomatic软件对原始测序数据的低质量序列和接头序列进行过滤，得到有效测序数据（Clean reads）。利用Trinity软件对所有Clean reads进行de novo组装并进行开放阅读框（ORF）预测。按照相似性85%以上为筛选条件，通过2次聚类去冗余后获得unigenes[25]。将热带臭虫的unigenes分别与5个公共数据库[非冗余蛋白数据库（NR）、基因本体论（GO）、京都基因与基金组百科全书（KEGG）、直系同源蛋白分组比对数据库（eggNOG）和注释蛋白数据库（Swiss-Prot）]中的蛋白质序列进行相似性比对，取阈值e≤10-5，从而获得注释信息[26-27]。使用BLAST 2 GO（https://www.blast2go.com/）软件对所有的unigenes进行GO功能分类统计。然后对unigenes进行KEGG代谢途径分析，并使用KOG数据库的在线注释软件eggNOG对unigenes进行功能分类。进一步使用Trinity软件自带的ORF预测模块对所有的unigenes进行编码区序列（coding sequence，CDS）预测，根据准密码子表确定其CDS及编码的氨基酸序列。
1.2.3 SSR及SNP分析按照默认的搜索标准（参数：单碱基重复10次及以上，二碱基重复6次及以上，3~6碱基重复5次及以上）利用MISA软件对热带臭虫转录组中筛选得到的1 kb以上的unigenes进行SSR位点分析，对查找的SSR类型进行特征分析。以组装好的转录本为模板序列，将原始序列与其进行比对，并使用Samtools和GATK软件寻找候选SNP，参数过滤条件为：QD < 2.0、FS > 60.0、MQ < 40.0、SOR > 10.0。
2 结果 2.1 转录组数据的质控、评估以及组装通过Illumina平台测序，共获得73 428 254条原始数据，对其进行过滤处理后获得63 082 102条Clean reads，质控后获得5.49 Gb高质量数据，GC含量为41.00%，Q20、Q30值分别为98.52%和94.79%。进一步组装获得32 496条转录本，平均长度为1 928 bp，总计59 442 215 bp。再一步分析获得21 619个unigenes（图 1），平均长度为1 356 bp，总计29 322 540 bp，最长的unigenes长度达20 900 bp，N50为2 064 bp。
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| 图 1 热带臭虫组装基因序列长度分布图 Figure 1 Length distribution of assembled unigenes of Cimex hemipterus |
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将测序获得的21 619个unigenes分别在NR、GO、KEGG、eggNOG和Swiss-Prot这5个公共数据库中进行比对，结果显示，共有12 286个unigenes在NR数据库得到注释，10 474个unigenes在GO数据库中得到注释，5 542个unigenes成功注释到KEGG数据库，9 093个unigenes成功注释到eggNOG数据库，7 918个unigenes在Swiss-Prot数据库中得到注释。对该5组数据进行拓扑分析，结果（图 2）表明，共有4 823条unigenes被同时标注成功，占总unigenes数的22.31%。其中，Swiss-Prot数据库有少部分（12条）超出NR数据库范围。
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| 注：NR非冗余蛋白数据库；GO基因本体论；KEGG京都基因与基金组百科全书；SWSS（Swiss-Prot简写）注释蛋白数据库；eggNOG直系同源蛋白分组比对数据库。 图 2 热带臭虫的5个数据库注释韦恩图 Figure 2 Venn diagrams of annotation against five databases of Cimex hemipterus |
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成功注释到GO数据库的10 474个unigenes，划分到生物学过程、细胞成分和分子功能三大类的47个功能中。如图 3所示，生物学过程的21个功能组中，占比最大的是细胞过程（16.83%），如蛋白质水解、碳水化合物代谢过程和氧化还原利用等。细胞组分的15个功能组中，细胞和细胞组分占比最大均为21.34%。在分子功能的11个功能组中，41.19%的序列功能均与结合有关系，其中蛋白结合所占比重最大。
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| 图 3 热带臭虫unigenes的基因本体论分类 Figure 3 GO classification of Cimex hemipterus unigenes |
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在目前的热带臭虫转录组数据库中，根据参与的KEGG代谢通路分为5个分支：代谢、环境信息处理、遗传信息处理、细胞过程和有机系统。其中代谢通路在所注释样本中最活跃，包含的基因数目较多，主要包括碳水化合物代谢（404）、氨基酸代谢（326）、脂质代谢（287）、生物合成代谢（202）、能量代谢（189）、维生素代谢（126）、核苷酸代谢（124）和生物降解代谢（95）。见图 4。
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| 图 4 热带臭虫unigenes的京都基因与基金组百科全书分类 Figure 4 KEGG classification of Cimex hemipterus unigenes |
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通过与eggNOG数据库进行diamond比对，对unigenes进行COG功能注释并进行同源分类[28]。比对结果显示，9 094个unigenes被归类到25类功能组中。其中未知功能（1 681）的注释结果最多，其他依次为信号转导机制预测（1 391），翻译后修饰、蛋白质折叠和分子伴侣（984）以及转录（715），注释最少的是细胞运动（17）。除此之外，其他功能组的表达量各不相同，从eggNOG分组比对结果（图 5）中可以看出，热带臭虫转录组涉及的COG功能组比较全面，涉及到大多数的生命活动。
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| 图 5 热带臭虫unigenes的蛋白质直系同源簇分类 Figure 5 EggNOG classification of Cimex hemipterus unigenes |
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进一步对所有的unigenes序列结果进行分析，其中使用ORF预测模块对unigenes序列进行了编码区预测，共获得10 906条CDS，占全部基因的50.45%。预测CDS的长度统计结果见图 6。
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| 注：CDS表示编码区序列。 图 6 热带臭虫unigenes的CDS长度分布统计结果 Figure 6 Length distribution of coding sequences of Cimex hemipterus unigenes |
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利用MISA软件对热带臭虫的转录组数据进行默认检索分析，共获得7 754个SSR位点，出现频率为35.87%。搜索的SSR位点共分布在5 184条序列中，发生频率为23.98%。由表 1可以看出，热带臭虫转录组中主要的SSR重复类型为单核苷酸重复，占总数的75.01%；二、三核苷酸重复占比分别为15.69%和8.54%。四、五、六核苷酸重复占比较少，均 < 1.00%，分别占总数的0.70%、0.04%和0.01%。此外，SSR位点中不同重复类型的重复次数都有偏向性，其中11~14次是单核苷酸重复的主要分布区间，6~11次是二核苷酸重复的主要分布区间，5~8次是三核苷酸重复的主要分布区间，其中5次也是四、五核苷酸重复分布最多的。与温带臭虫相比[14]，热带臭虫SSR中多了六核苷酸重复，且该SRR仅有1种类型，重复13次。见表 1。
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从表 2中可以看出，热带臭虫转录组的SSR位点中，共有31种重复基元，其种类数量变化呈上升又下降的趋势，分别为2、4、10、11、3、1。其中单核苷酸重复的A/T出现最多，占比73.61%；其次出现较多的是二核苷酸重复的AT/AT，占总数的8.58%；三核苷酸重复中AAT/ATT出现较多，占比4.09%；四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复出现的次数都比较少，其中很多重复基元只出现1次，其总共占比为0.75%。
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利用Samtools和GATK软件对21 619条unigenes预测得到33 144条SNPs，其中预测得包括碱基转换类型22 262条（其中A-G类型11 100条，C-T类型11 162条），发生频率为67.17%；碱基颠换10 882条（其中A-T类型3 928条，C-G类型1 571条，A-C类型2 432条，G-T类型2 951条），发生频率为32.83%。见表 3。
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本文通过高通量测序技术对热带臭虫进行转录组测序和分析，获得的数据可为其分子生物学研究提供数据来源。通过序列的拼接和组装共获得32 496条转录本，进一步获得21 619个unigenes，共29 322 504 bp，平均长度为1 356 bp，N50为2 064 bp。N50值越大，反映组装得到的长片段越多，其组装效果越好[29]。从热带臭虫的转录组数据中可以看出，此次序列组装的质量和长度可以满足转录组分析的基本要求。而且该虫的功能注释结果质量也是相当可观，本研究共获得CDS序列10 906条，表明高通量测序技术可以很有效地挖掘热带臭虫的功能基因。今后将进一步对热带臭虫的敏感种群和抗性种群进行比较分析，以期在今后的研究中对重要的基因，如抗性基因，进行挖掘和鉴定，进一步研究其功能表达。
本研究还发现了热带臭虫的7 754个SSR，出现频率为35.87%，远高于半翅目扶桑棉粉蚧（Phenacoccus solenopsis）[30]、温带臭虫（C. lectularius）[14]和蠋蝽（Arma chinensis）[31]等其他昆虫，一定程度上说明热带臭虫SSR标记数量丰富。大量的SSR标记可为热带臭虫后续的相关研究提供参考，如对筛选的SSR进行引物的设计与合成，对该虫做进一步的种群遗传分析研究等[32-33]。与传统的实验室手段开发SSR标记相比，基于转录组测序的SSR分子标记开发更为经济有效。对热带臭虫SNP类型分析发现，转换类型占总数的67.17%（22 262个），颠换类型占总数的32.83%（10 882个），颠换类型明显小于转换类型。在转换类型中，C-T的发生频率和A-G的发生频率相近，这与温带臭虫的SNP挖掘过程中的结论有些不同[14]。发掘热带臭虫的大量SSR和SNP位点，可为其遗传多样性分析、入侵路线等研究奠定基础。
综上所述，本文构建了热带臭虫转录组数据库，并对21 619个unigenes进行组装和功能注释分析，分析该虫的代谢途径，为热带臭虫功能基因的更深入研究提供了大量信息资源。
志谢 吕佳及钟才通提供标本信息，特此志谢利益冲突 无
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