广东省南雄市位于广东省东北部，境内多为山地，森林资源丰富，属亚热带季风气候区，日照充足，雨量充沛，适合鼠形动物栖息繁衍，因此，当地农田鼠害发生较重。鼠类不仅危害农作物造成经济损失，还可传播鼠疫、肾综合征出血热、钩端螺旋体病等多种人兽共患疾病，严重危害人类健康^[1-3]。鼠种的分类是研究鼠类种群和群落特征的基础，是科学治理鼠害的前提，对鼠传疾病的监测与防控也具有重要意义^[4]。传统形态学分类存在一定的局限性，加之头骨特征和牙齿特征的鉴定极其繁琐耗时，需要丰富的专业分类知识和实践经验^[5]。因此，一种简便、快速、准确的鼠种鉴定工具对于非传统分类学专家正确鉴定鼠类是非常必要的。

DNA条形码（DNA barcoding）是指利用生物体基因组内一段标准的、有足够变异的、易扩增且短的DNA片段来快速鉴定物种的一项分子鉴定新技术^[6]，该技术迅速成为生物多样性、动物生态学和动物流行病学调查等研究的一个有用的工具^[7-9]。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）、线粒体细胞色素B（Cytb）、16S rRNA和线粒体DNA控制区（D-loop）基因序列常作为鼠形动物物种鉴定的DNA条形码^[10-11]。刘蓉蓉等^[12]利用COⅠ基因片段对我国姬鼠属样本进行鉴定，确定了姬鼠属在我国的准确分布。Liu等^[13]结合线粒体Cytb基因及形态学分析明确我国姬鼠属和大鼠属物种多样性。王缠等^[14]研究发现Cytb和ND4基因适合作为鉴定高原鼢鼠（Eospalax baileyi）的DNA条形码。胡群等^[11]比较了COⅠ、Cytb、16S rRNA、D-loop 4种基因对黄毛鼠（Rattus losea）鼠种鉴定的结果，但因只有1个样本，分析相对简单，方法的可靠性还有待进一步研究。本研究以南雄市农区鼠形动物为研究对象，比较分析4种线粒体基因片段（COⅠ、Cytb、16S rRNA和D-loop）鉴定这些鼠种的可靠性，为该地区的鼠形动物科学防治提供基本信息，为鼠形动物分子鉴定提供技术支持。

2019年3－12月在南雄市珠玑镇农田采用夹捕法获得鼠形动物110只。所有样品依据外部形态按照检索表^[15]进行初步鉴定，剪取部分脚趾或者尾巴样品保存于无水乙醇中，置于-20 ℃冰箱中备用。

根据MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒DNA提取步骤制备鼠形动物基因组DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量。所有样品首先选择通用引物BatL5310/R6036R扩增及测序COⅠ基因^[16]，通用引物扩增反应失败时，则选用鸡尾酒引物^[17]，选择Cytb-F/Cytb-R引物扩增Cytb基因片段^[16]，如果扩增失败，改用L14723/H15915引物扩增^[10]，选择16SA-F/16SA-R扩增16S rRNA基因片段^[10]，选择D-loop-F/D-loop-R扩增D-loop基因片段^[16]。4种基因的引物序列见表 1。

表 1 扩增小型兽类4种线粒体基因的PCR引物序列 Table 1 PCR primer sequences for amplifying four mitochondrial genes of small mammals

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在50 μl反应体系中，DNA模板1 μl，正、反向引物各1 μl，Premix Taq酶25 μl，以及ddH₂O 22 μl。COⅠ、D-loop扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。Cytb、16S rRNA基因扩增PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，送生工生物工程（上海）有限公司进行双向测序。Premix Taq酶、DNA分子质量标准（DNA marker）、Gold View核酸染料等均购自生工生物工程（上海）有限公司。

采用Chromas软件^[18]查看测序结果的峰图质量，并对序列进行人工校正，对于较差的结果则重新扩增和测序。然后将测定的序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上进行BLAST核酸序列同源性检索。运用MEGA 5.1软件^[19]，基于Kimura-2-parameter（K2P）模型^[20]计算遗传距离，构建neighbor-joining（NJ）系统发育树。

经过外部形态特征分类鉴定，110只鼠形动物样品分属于2目2科4属5种或者6种，分别为啮齿目鼠科大鼠属的黄胸鼠（R. tanezumi）、黄毛鼠，小鼠属的小家鼠（Mus musculus），板齿鼠属的板齿鼠（Bandicota indica），食虫目鼩鼱科鼩鼱属的臭鼩鼱（Suncus murinus），以及因为残缺无法形态鉴定的不明鼠种1种。

所有样品首先扩增及测序COⅠ基因，经过条形码鉴定后，将数量最多的黄毛鼠保留12个样品，其他鼠种不足10个全部保留，进行其他3种基因的扩增与测序。结果显示：除臭鼩鼱以外，其他鼠种采用通用引物均能成功扩增4种基因序列，臭鼩鼱的COⅠ采用鸡尾酒引物扩增并测序，D-loop基因扩增无条带，而Cytb基因虽有条带，但鉴定结果与形态学鉴定结果和COⅠ不一致，鼠种明显有误。

4种序列经NCBI同源性比对，与NCBI参考序列的同源性均在95%以上，绝大多数相似性 > 97%。其中，黄毛鼠16S rRNA基因片段与屋顶鼠（R. rattus）同源性达到97%以上，而这些样品COⅠ、Cytb及D-loop基因序列均与黄毛鼠一致性最高，同源性在97.38%以上。出现这种鉴定结果不一致考虑可能由于GeneBank数据库中缺乏黄毛鼠16S rRNA序列及黄毛鼠线粒体基因组序列，而且黄毛鼠和屋顶鼠亲缘关系较近，因此，在后续的分析中未选择黄毛鼠16S rRNA基因。

进一步利用MEGA 5.1软件分析样品不同鼠种及不同基因种内和种间遗传距离。如表 2所示，不同鼠种种间遗传距离为4.30%~20.20%，种内遗传距离为0.10%~1.30%，无交叉区间，种间平均遗传距离约是种内平均遗传距离的20倍。从不同基因种内和种间遗传距离的角度分析，如表 3所示，16S rRNA最低种间遗传距离偏小，为4.30%，而D-loop最大种内遗传距离偏大，为2.50%。COⅠ、Cytb、16S rRNA和D-loop基因平均种间与种内遗传距离相差分别为39.58、58.73、54.09及34.00倍。采用NJ法构建4种条形码基因的系统发育树，结果如图 1~4所示。同一鼠种聚为一支，每一大支支持率超过99%。

表 2 广东省南雄市主要农田害鼠4种线粒体基因种内和种间遗传距离 Table 2 Intraspecific and interspecific genetic distances of 4 mitochondrial genes of the main mammal pests in Nanxiong city of Guangdong province

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表 3 广东省南雄市小型兽类4种基因序列种内和种间遗传距离 Table 3 Intraspecific and interspecific genetic distances of 4 gene sequences of small mammals in Nanxiong city of Guangdong province

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图 1 邻接法构建的基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列的广东省南雄市小型兽类系统发育树 Figure 1 Phylogenetic tree of small mammals in Nanxiong city of Guangdong province constructed by the neighbor-joining method based on the CO I gene sequence

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图 2 邻接法构建的基于Cytb序列的广东省南雄市系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of small mammals in Nanxiong city of Guangdong province constructed by the neighbor-joining method based on the Cytb gene sequence

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图 3 邻接法构建的基于16S rRNA序列的广东省南雄市小型兽类系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree of small mammals in Nanxiong city of Guangdong province constructed by the neighbor-joining method based on the 16S rRNA gene sequence

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图 4 邻接法构建的基于D-loop序列的广东省南雄市小型兽类系统发育树 Figure 4 Phylogenetic tree of small mammals in Nanxiong city of Guangdong province constructed by the neighbor-joining method based on the D-loop gene sequence

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经过4种条形码基因序列分析发现，6个样品形态鉴定有误。其中3个样品采集现场形态鉴定为小家鼠，但BLAST比对后与卡氏小鼠（M. caroli）相似性最高，且4种基因序列比对结果一致；1个黄毛鼠与黄胸鼠鉴定混淆；另外，2个样品因肢体残缺形态鉴定为不明鼠种，经NCBI比对，不同基因序列结果均与大足鼠（R. nitidus）相似性最高。结合同源性结果、遗传距离和系统发育树综合分析后修订了形态鉴定结果。

DNA条形码用于鉴定物种的先决条件在于种内变异小于种间变异，且种内变异 < 3%，该技术已经广泛用于啮齿动物的鉴定和检验检疫等^[21-23]。本研究结果显示NJ树中所有鼠种都能形成高支持率独立的分支，种内遗传距离 < 2%，种间遗传距离为4.30%~20.20%，种内遗传距离低于种间遗传距离（表 2、3，图 1~4），由此确认DNA条形码可以准确、有效鉴定广东省南雄市农区小型兽类。Li等^[24]研究发现运用合适的分析方法，如系统发育分析、BLAST比对及BLOG（Barcoding with LOGic），COⅠ基因可以正确鉴定90%以上的鼠科和田鼠科动物。尤其是形态相近的种及隐存种，幼体或者残体，传统分类容易错误鉴定，而DNA条形码能够准确鉴定。例如卡氏小鼠，为野栖鼠，是南方农田的主要害鼠之一，与小家鼠形似，仅在头骨形态上有一些不同，如鼻骨不超过门齿、颧骨板前缘“S”型等^[25]。笔者现场初步形态鉴定为小家鼠，经过条形码分析确定为卡氏小鼠。

2003年，加拿大学者Hebert等^[26]首先提出使用COⅠ基因片段作为动物鉴定的标准DNA条形码。2010年，有学者提出Cytb基因比COⅠ基因能更好地解决哺乳动物分类问题^[27]，对哺乳动物的DNA分析中，Cytb基因是最常用的基因^[21]。Nicolas等^[10]评估了COⅠ、Cytb和16S rRNA用于鉴定普罗米尼族（鼠亚科）啮齿动物的准确性和可行性，综合分析认为3种标记均可用于该族鼠种的分类，但是与16S rRNA相比COⅠ、Cytb是更好的分子标记。一般情况下，适合作为物种鉴定的遗传标记需要满足序列片段易扩增、有足够变异、缺少杂合度、序列比对简单清楚等条件。本研究采用的条形码基因引物大部分为已发表的通用引物，对于臭鼩鼱样本，采用通用引物只有16S rRNA可以鉴定到种，COⅠ基因通过鸡尾酒引物可以扩增并正确鉴定^[17]，而Cytb及D-loop基因片段不能正确地扩增或者测序。另外，本研究中16S rRNA基因片段对于黄毛鼠样品可以正常扩增，但是序列比对不能正确鉴定。可能由于GenBank数据库中尚无黄毛鼠线粒体基因组序列及16S rRNA序列，因此目前16S rRNA还不适用于黄毛鼠的鉴定，该结果与胡群等^[11]研究结果一致。

虽然DNA条形码技术存在缺点和不足，但随着GenBank数据库收录的序列信息的不断完善，及它在隐存种鉴定等方面的高成功率等诸多优点，DNA条形码已经变成一种新兴的快速鉴定和发现物种的分类方法。而且，该技术还在不断完善中，如研究基于高通量测序平台以高效并较低成本获取条形码序列的方法^[28]。总之，形态学、生态学和分子生物学鉴定相结合仍是最为可靠、有效的物种鉴定方法。

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