尘螨是一种体长约0.33 mm的小型节肢动物，是灰尘中过敏原的主要来源，可引发哮喘、皮炎、鼻炎、湿疹及其他变态反应性疾病^[1-2]。变态反应性疾病严重影响人类的健康和生活，随着生活水平的提高，人们对变态反应性疾病越来越重视，许多研究表明尘螨是人类最主要的吸入性变应原^[3-4]，关于尘螨的研究也愈发增多。尘螨主要孳生在室内积尘中，因此在变态反应性疾病与尘螨暴露关系的研究中，收集灰尘是首要环节。灰尘中含有较多杂质，将尘螨从中分离，可进行尘螨检测、活螨纯培养等后续工作。尘螨及其变应原检测可用于评价尘螨孳生数量、分布情况，了解尘螨与变态反应性疾病的关系，为防控尘螨及变态反应性疾病研究奠定理论基础。

1 灰尘收集

目前尚无一种方法可以从所有物体表面均匀地收集灰尘，因此需要根据被采样物品的类型、研究目的等，选择相匹配的灰尘收集方法。研究灰尘污染的学者已经设计出许多被动和主动灰尘采样技术。

1.1 被动采样技术

放置固定装置，然后在固定时间段（例如1周）内累积灰尘，传统的被动采样装置可将集尘瓶、清洁玻璃平皿等容器放置于待检场所进行灰尘收集，根据研究目的制定放置装置数目及位置。Noss等^[5]开发了一种静电集尘装置（electrostatic dust fall collector，EDC），该装置由1个包含了2块或者4块聚酯布的聚丙烯采样器组成，这些静电布为空气中的灰尘提供沉降表面（图 1）。该技术主要优点在于与主动采样技术相比，便于大规模采样且成本较低^[6]。Reboux等^[7]于2018年使用EDC装置收集房屋内的灰尘进行螨虫检测时，发现仓储螨类〔粗脚粉螨（Acarus siro）、家食甜螨（Glycyphagus domesticus）、害嗜鳞螨（Lepidoglyphus destructor）〕孳生程度高于尘螨〔屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）、粉尘螨（D. farinae）〕，提示仓储螨类对健康影响一直被低估。该方法重复性好，可用于长期暴露评估，缺点是无法准确评估灰尘重量，测得过敏原浓度以μg/m²表示，其结果无法与以μg/g作为衡量指标的实验进行比较。

1.2 主动采样技术

主动采样技术包括表面擦拭采样、吸尘器采样、空气净化器采样等。

1.2.1 表面擦拭采样

表面擦拭采样通过使用抹布、纱布、手套等对物品表面进行擦拭以取得灰尘。表面采样可用于评估影响急性或者慢性健康的因素以及对有毒物质的潜在接触。由于通常在许多物品表面上发现的灰尘含量相对较低，因此该方法取得的样品有时候难以识别来源^[8]。由于不同操作者会造成人工擦拭采样重复性较差的情况，Lioy等^[8]于1993和2000年先后发明了Lioy Weisel-Wainman（LWW）灰尘擦拭取样器和Edwards and Lioy（EL）采样器，以消除不同采样人员操作对采样的影响，LWW擦拭取样器可以定量确定同一样品中灰尘的浓度（以μg/g为单位）和表面载荷（以μg/cm²为单位），其应用范围较窄，仅限于对水平或垂直平面进行采样，其表面收集基质为50 mm×55 mm核孔的Perkin-Elmer排水盘（PerkinElmer，Norwalk，CT），经过测试可以收集窗户孔中存在的灰尘；EL采样器的采样表面经过专门设计，可模仿人手表面颗粒尺寸分布，其施加压力与人施加在表面压力相一致，已成功用于从各种物品类表面（例如地板和地毯）收集灰尘并能确定灰尘的量。

1.2.2 真空吸尘器法

真空吸尘器法用于灰尘收集历史悠久，但由于每种吸尘器的性能、功率各不相同，因此该法所收集灰尘特性也不尽相同，在使用变应原浓度作为暴露指标的研究时，需考虑不同采样器对结果的影响^[9]，并且不同物体表面类型同样对取样能够产生影响。High volume small surface sampler（HSV）是一种改进的大体积小表面真空吸尘器，可以使用旋风分离器收集 > 5 mm的颗粒，Sandel等^[10]使用3种采样方法进行室内灰尘采集，发现使用HSV4采样方法采集灰尘中尘螨变应原浓度最高，提示研究者在进行尘螨暴露研究时可优先选择该方法。真空吸尘器收集尘螨不具有可重复性，因为尘螨会随取样而变少，从生物学方法的研究角度出发，一个相对较低的回收率但具有可重复性的取样方法要优于这种不可重复的取样方法，这种不可重复性也是研究者在使用真空吸尘器法采样时必须考虑的问题。

1.2.3 空气净化器法

Townsend^[11]首先提出了离子推进原理并申请了美国专利，在电晕线施加高压，产生等离子体，使附近粒子带电荷，然后通过电压梯度以相反电位将带电粒子推进电极，该原理后来被广泛应用于商业空气净化器并被众多研究者使用以收集空气中的灰尘进行变应原检测。Gordon等^[12]应用该原理发明了一种新颖、微型的空气采样设备（Inspirotec采样器），其具有优化的气流和针对样品采集进行了优化的电机盒，通过过滤器进行灰尘捕获，以高通量采集空气，可收集亚微米范围的颗粒，该设备可放置在任何环境下且可由患者自行操作，曾有研究者在芝加哥地区使用该装置进行过敏性患者卧室空气中的微生物和过敏原检测^[13]。

1.3 个人暴露采集

通常人们在进行尘螨研究时，会将灰尘采集重点放在床、地毯等这些通常被认为是尘螨暴露的主要场所。Tovey等^[14]发明了一种便携式个人采样装置（图 2），该装置包含一个2 L/min的空气泵，泵安装在塑料午餐盒内置于1个背包中，在背包的前斜肩带安装了1个摄像机和采样口（图中箭头所示位置），他们使用该装置进行尘螨暴露研究时发现床上的暴露仅占总暴露的9.85%，而日常生活中收集的灰尘样品却具有较高尘螨过敏原浓度，证实了大多数尘螨暴露与家庭活动以及他人的亲近有关。因此在进行尘螨暴露相关研究时，个人暴露采集不该被忽视。

2 尘螨分离

取得灰尘样本后，为方便对螨进行研究以及活螨培养，需要将螨从灰尘样本中分离。裴伟^[15]2010年已将螨的分离做了详尽阐述，他将螨分离技术大致分为3大类：第1类利用提取液比重，使螨上浮而达到分离的目的；第2类采用过筛、水洗等方法达到分离目的；第3类利用螨的生活习性达到分离目的。

2.1 比重分离法

根据使用提取液体的介质不同可大致分为饱和盐水法、有机溶剂法、甘油饱和盐水法等。饱和盐水法由Sasa等^[16]发明，他发现螨的比重为1.10，而饱和盐水的比重为1.20，可以利用比重差使螨漂浮于饱和盐水之上达到分离的目的。后来Sakaki等^[17]对该法进行改进，发明了全层盐水分离法，相较于原方法只收集上层部分的螨，该方法回收了上、中、内层和内壁清洗液中的剩余螨，大大提高了回收效率。Spieksma和Spieksma-Boezeman^[18]使用有机溶剂作为提取液，利用有机溶剂产生比重差，从而实现螨分离。Spieksma用饱和盐水、乳酸、四氯化碳配制出不同比重的提取液，经过离心、抽滤获取分离的螨。2020年周鹰等^[19]发明了利用氯仿分离螨的方法，该方法首先将灰尘样本置于蒸馏水中快速搅动，静置后将溶液转移至分液漏斗，在分液漏斗中倒入氯仿，震荡后静置分层，打开分液漏斗，分2次回收分层后的下层溶液，第2次回收下层溶液的体积占下层溶液1/5，将第2次回收的下层溶液静置，吸取悬浮在液面上的螨类。该方法操作简单、可快速、高效地提取螨。

2.2 过筛、水洗法

该方法通过筛网过筛、水洗达到分离尘螨，无需使用有机溶剂，较利用比重分离法更为环保。Natuhara^[20]为获得更好的回收效率对本法进行改进，其在干燥条件下对粉尘样品进行称重，将样品与80 ml的50%乙醇溶液混合，将混合物倒入420 μm与75 μm分样筛，然后将分样筛在流水冲洗30 s，可将残留在420 μm分样筛上的粉尘放入50%乙醇溶液容器中再次过筛提高回收率。将75 μm筛网上的样本放入1%亚甲蓝溶液几秒钟使粉尘染色（不会使螨染色），通过量筒用布氏漏斗过滤，从滤纸用显微镜观察收集螨。该方法的缺点是当有大量螨存在时，耗时太长。

2.3 生活习性分离法

螨对热敏感，可利用这个习性对其适当加热，螨受热出逃，以达到分离的目的。该方法存在一定的局限性，只能用于分离生活史中活动期的螨^[21]。同样，研究者们利用螨对光敏感的习性开发出来避光爬附法、背光钻孔法都被证明了其有效性^[15]。

3 尘螨及其变应原检测

尘螨及其变应原检测，可以用于评价尘螨孳生数量、分布情况，了解尘螨与变态反应性疾病的关系，有助于尘螨防控及变态反应性疾病的相关研究。尘螨及其变应原的检测方法纷繁复杂，可初步将其分成直接针对螨数量检测的显微镜镜检法、针对尘螨变应原含量检测的免疫学及生物化学法、针对尘螨变应原编码基因检测的分子生物学方法。见图 3。

3.1 显微镜镜检法

取定量灰尘样本，将尘螨从灰尘杂质分离出来后直接在显微镜下进行计数，用只/g进行记录，胡慧中和湛孝东^[22]在2016年使用显微镜镜检法对芜湖地区某高校宿舍螨孳生情况进行调查，为当地螨预防提供依据。此种方法成本低廉，但是会因为个人对尘螨形态辨识不足产生误差^[23]，并且单纯尘螨计数会忽略部分尘螨变应原而影响实验结果准确性。显微镜镜检在进行尘螨计数的同时还可以对其进行形态学观察和分类，杨李等^[24]使用超高倍显微镜对腐食酪螨（Tyrophagus putrescentiae）进行了观察鉴定，并认为多功能超高倍显微镜可推广用于其他螨类研究中。

3.2 免疫学及生物化学与分子生物学方法

尘螨研究发展至今，除显微镜镜检外已经发展出很多检测技术可对尘螨进行种类鉴定及含量检测，根据其检测原理可大致分为针对尘螨蛋白质的免疫学检测方法和针对尘螨DNA的分子生物学检测方法，其中尘螨代谢物鸟嘌呤检测、免疫层析技术为半定量检测方法，定量检测方法包括放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射变应原吸附试验（radioallergosorbent test，RAST）抑制实验、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术等。

3.2.1 尘螨代谢物鸟嘌呤检测

螨粪中存在鸟嘌呤，是螨氮代谢的最终产物，可用于间接反应尘螨变应原。van Bronswijk等^[25]于1986年介绍了Acarex实验，可以快速检测灰尘中尘螨变应原。该实验利用鸟嘌呤与重氮化合物偶合时生成的鸟嘌呤偶氮染料从而推断鸟嘌呤含量，根据颜色反应强度可将结果分为强阳性（干燥尘土中至少1.00%的鸟嘌呤）到中度阳性（0.25%）、轻度阳性（0.06%）和阴性（< 0.01%）。van der Brempt等^[26]将Acarex实验结果与ELISA结果进行了比较，证实了Acarex实验在尘螨检测中的有效性。该方法简单、经济，可快速检测出灰尘样本的致敏能力，缺点是无法准确定量检测。

3.2.2 免疫层析技术

免疫层析法将特异性抗体固定于醋酸纤维膜的某一区带，若待检样品中存在相应抗原，则与条带中的抗体特异性结合，使用胶体金或免疫酶染色可出现显色反应，从而实现抗原检测。2002年Tsay等^[27]开发了一种胶体金检测试纸条对环境中尘螨变应原进行检测，并通过研究表明其检测结果与ELISA检测结果具有较好的相关性，证明该方法可用于环境中螨类变应原快速检测。胶体金技术操作简单，仅需10~15 min即可判断结果，可用于家庭尘螨检测，但存在着结果只能用低、中、高表示，不能进行定量检测的缺陷。目前胶体金试纸已经发展出许多新型材料，可使用配套仪器对结果进行分析，显著提高了敏感性并且可以实现定量检测^[28]，因此使用此类新型试纸技术有望改变免疫层析技术在尘螨检测中不能定量分析的缺陷。

3.2.3 RIA与ELISA

RIA原理是使用放射性同位素作为指示剂来标记抗原抗体反应，通过测定放射性同位素含量确定未标记抗原的量。Platts-Mills等^[29]使用RIA测定屋尘螨和粉尘螨1组变应原共有抗原P1，该法不仅可对此抗原进行定性检测，还可通过与标准曲线比较而确定P1的含量。RIA法存在放射性污染，且大多数标记物的同位素半衰期短，因此该方法已逐渐被淘汰。ELISA原理与RIA类似，是一种将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用相结合的检测方法，与RIA相比不再存在核素污染的问题，张淑瑶等^[30]于2018年进行空气净化器去除尘螨效果研究时，使用ELISA对尘螨变应原进行检测，证实了空气净化器可以有效清除空气中尘螨变应原。使用变应原单克隆抗体组装的ELISA试剂盒具有高度的敏感性和特异性、对仪器要求低、适合大批量样本检测等特点^[31-32]。

3.2.4 RAST抑制实验

RAST原理是将包被有变应原的固相载体与血清反应，如果血清中含有针对此变应原的特异性IgE，则会形成与固相载体结合的免疫复合物，冲洗游离的特异性IgE，加酶标抗IgE抗体，再加入底物，根据荧光强度可测定血清中特异IgE含量^[32]。RAST抑制实验是将待检变应原提取液进行倍比稀释，分别与等量特异性IgE阳性血清孵育，再用RAST检测孵育后的血清池特异性IgE含量，由于变应原抑制了特异性IgE含量，由此确定变应原浓度^[33]。1985年Swanson等^[34]在验证一种新型采样装置时，使用RAST抑制实验对空气中变应原进行了检测。RAST技术在国际上使用广泛，也是评价变应原总致敏活性的关键技术，该技术的缺点是依赖人血清。

3.2.5 PCR

PCR技术是一种以少量DNA为模板在体外模拟DNA复制的核酸扩增技术，通过变性退火延伸的多次循环，产生大量目标DNA的过程。实时荧光PCR技术从普通PCR技术基础上发展而来，该技术利用荧光染料或探针，在扩增过程中实时监测荧光信号，并通过制定标准曲线确定样本目的基因的初始拷贝数，从而达到定量检测的目的^[32]。俞黎黎等^[35]于2017年发明了一种快速检测粉尘螨变应原第一组分（Der f 1）含量的实时荧光PCR方法，该方法利用Der f 1重组质粒作为标准品，设计Der f 1的实时荧光PCR引物、TaqMan探针，采用实时荧光TaqMan探针定量PCR方法，构建了Der f 1实时荧光定量PCR标准曲线，达到了对其进行快速定量检测的目的，实时荧光PCR技术直接检测尘螨DNA，比免疫学方法特异性更强。

随着分子生物学发展，基因序列分析、氨基酸序列测定和基因重组等方法被广泛应用于尘螨变应原研究中^[36]，随着大数据技术普及，高通量组学技术逐渐应用到尘螨变应原研究领域，将使其进入新的发展阶段^[37]。

4 结语

尘螨主要孳生在室内积尘中，每克灰尘中含有2 μg的屋尘螨变应原第一组分就可能引起过敏及哮喘，达到10 μg（每克灰尘中含有500只螨虫）就被视为过敏体质者发生急性哮喘的主要风险因素^[38]，因此灰尘采样是研究尘螨与过敏性疾病关系的必要环节。尘螨研究历经数十年发展，从采集到检测过程发展出了许多方法，但其中采样、分离技术大多数方法存在着耗时、可重复性差、难以标准化等缺点。目前的尘螨及其变应原检测技术尚无法把握好精准定量检测与简便操作之间的平衡关系，几乎每种方法都存在一定缺陷，免疫学检测技术存在交叉反应、PCR检测技术存在设备要求高、试剂成本高等缺点。因此标准化、简便化的尘螨收集和检测流程将是尘螨研究的发展方向之一。随着科技进步，我们需努力开发新技术、新方法，以满足未来变态反应性疾病的防控需求。

利益冲突  无