蚊虫是重要的医学昆虫，不仅叮咬吸血，骚扰人们工作、学习和休息，而且还是流行性乙型脑炎、疟疾、丝虫病、登革热等多种传染病的传播媒介。蚊虫种类多，生命力顽强，具有快速的生殖周期，是研究生殖调控机制的优秀模式生物。近年来随着基因组学、生物信息学和分子生物学技术发展，人们对于蚊虫生殖调控的研究越来越深入。

保幼激素（juvenile hormone，JH）是调控昆虫生长发育、变态和生殖最重要的激素之一^[1]。在双翅目昆虫中，JH不是刺激卵黄发生，而是调节发育阶段，为随后的卵黄发生和卵发育做好准备。JH调节蚊虫羽化后的营养资源分配，从而导致初级卵泡的成熟和生长^[2-4]。JH还协调蚊虫羽化后脂肪体和中肠的发育，为消化吸收血液做准备^[5]。

随着JH调控昆虫生殖机制研究的深入，大量实验数据表明JH的受体是螺旋-环-螺旋Per/Arnt/Sim（bHLH-PAS）结构的甲氧戊丁酸耐受蛋白（Met）^[1]。Met作为JH的受体，在JH发挥功能效应中扮演着重要角色，研究发现在雌性埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，JH的作用是由JH的受体基因Met介导的^[6-7]。体外合成的AaMet以高亲和力与JH结合，关键预测残基的突变导致JH与其受体的结合大大减少^[8]。RNAi介导的AaMet基因敲除阻止了蚊虫羽化后初级卵泡的JH依赖性生长，这一表型类似于JH剥夺的效果^[7]。在埃及伊蚊羽化后的发育过程中，JH通过其受体Met调控许多基因的表达，引起激活或抑制，影响蚊虫的生殖和吸血行为^[9]。

本文以城市优势蚊种淡色库蚊（Culex pipiens pallens）为研究对象，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测CpMet基因在淡色库蚊不同生长发育阶段、不同组织以及激素处理后的表达特性，采用RNA干扰的方法研究CpMet基因在淡色库蚊生殖中的作用，研究结果对于进一步揭示昆虫JH信号通路调控昆虫生殖的分子机制，开发以Met为作用靶标的新型蚊虫防治药剂具有重要的科学意义。

淡色库蚊敏感品系引自江苏省疾病预防控制中心，扬州大学园艺与植物保护学院养虫室连续多代饲养，饲养条件为温度（27±2）℃，相对湿度（75±5）%，光周期为12 h∶12 h，幼虫期饲喂全营养鼠粮，成虫期饲料为5%蔗糖水，使用小白鼠供蚊虫吸血繁殖。

保幼激素类似物烯虫酯Methoprene购于Sigma-Aldrich公司，HiScript^® Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（反转录试剂）和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购于Vazyme Biotech Co.，Ltd.，蜕皮激素20E购于生工生物工程（上海）股份有限公司，Ambion^® TRIZol^® reagent，三氯甲烷，75%乙醇溶液，异丙醇，RNase-free ddH₂O。

荧光定量PCR仪（伯乐，CFX96），高速冷冻离心机（eppendorf，5415R），显微镜，干式恒温零度金属浴（天根生化科技有限公司）。

在正常饲养条件下收集1日龄卵、2日龄幼虫、5日龄幼虫、8日龄幼虫、11日龄幼虫、1日龄蛹、2日龄雌性成虫。对未吸血的3~5日龄雌性成蚊进行解剖，收集头部、胸部、脂肪体、马氏管、中肠、卵巢。收集的样品包含3个生物学重复。

采用Trizol法提取淡色库蚊不同发育阶段及不同组织的总RNA，利用HiScript^® Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）完成第一链cDNA模板的合成，PCR条件：50 ℃ 15 min，85 ℃2 min。产物-20 ℃保存。

根据已经获得的淡色库蚊Met基因（GeneBank登录号：MK616653）的cDNA序列设计、合成qPCR特异性引物CpMet-qF、CpMet-qR。将淡色库蚊肌动蛋白β-actin基因作为内参基因，合成特异性引物β-actin-F、β-actin-R^[10]。见表 1。

表 1 用于CpMet实时荧光定量PCR扩增的引物 Table 1 Primers used for RT-qPCR of CpMet

表选项

使用诺唯赞荧光定量试剂盒进行RT-qPCR，10 µl反应体系如下：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 µl，正反向引物各0.4 µl，cDNA模板1 µl，无核酸酶水3.2 µl。将反应体系混合均匀、离心，使用CFX96^TM荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）进行RT-qPCR反应，具体反应步骤如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃保温5 min，循环40次。扩增反应的特异性可以通过熔解曲线分析检测。

将JH类似物烯虫酯溶解于丙酮中，配置成浓度为7 500 ng/μl溶液。选取龄期一致的蚊蛹和未吸血未交尾的2~3日龄雌性成蚊，每只蛹/雌蚊注射200 nl，对照组分别为注射等量丙酮的蛹/雌蚊，每个处理30只，3个生物学重复，随机收集注射后6、12和24 h样品提取总RNA，利用RT-qPCR检测烯虫酯处理后CpMet基因的表达量。

将蜕皮激素20E用乙醇溶解，配置成浓度为5 000 ng/μl溶液。选取龄期一致的蚊蛹注射200 nl，对照组注射等量乙醇，每组处理30只，并设置3个生物学重复，随机收集注射后6、12和24 h样品提取总RNA，利用RT-qPCR检测20E处理后CpMet基因的表达量。

使用Premier 5设计带有T7启动子序列的CpMet基因及对照增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因特异性dsRNA合成引物（表 2）。扩增出的片段用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit试剂盒合成dsRNA，经纯化验证后分装保存于-80 ℃冰箱。

表 2 dsRNA合成引物 Table 2 Primers used for dsRNA synthesis

表选项

采用显微注射法，对未交尾的3~4日龄淡色库蚊雌性成虫进行dsRNA注射。将雌蚊低温麻醉后置于冰上，用镊子轻轻夹至已预冷的0 ℃金属浴上，将雌蚊侧卧，注射部位为胸部侧面中部的鳞片缝隙，注射时针头尽量与蚊虫侧面垂直。每个处理注射20~30只雌蚊，设3个生物学重复。注射后每隔24 h收一次样，连续3 d。采用RT-qPCR检测对CpMet干扰后基因的沉默效率。

将刚羽化的雌蚊雄蚊按1∶1.5的比例混合放入干净蚊笼中，喂养5%蔗糖溶液，3~4 d后吸出雌蚊，设置空白对照组、dsEGFP处理组和dsCpMet处理组，处理组进行注射dsRNA干扰，注射后每组试虫单独放入干净蚊笼中，用小白鼠作为血餐，24 h后把未吸血的雌蚊吸出，待笼中剩余雌蚊产卵后记录总产卵块量，在显微镜下统计不同处理组的每个卵块的卵粒数，并把每个卵块做好标记单独放在盛有脱氯水的培养皿中，于4 d后统计每个卵块孵化幼虫数，计算卵孵化率。

RT-qPCR的数据采用2^-△△Ct法分析^[11]目标基因的相对表达量，所有数据都用平均值±标准误表示，采用SPSS 13软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），用Tukey检验进行均值比较，用graphpad.prism.6软件作图。

CpMet在淡色库蚊不同发育阶段的表达量测定结果表明，CpMet在各阶段均表达。卵期CpMet的表达量最高，并且与其他龄期相比差异有统计学意义（F=234.382，P < 0.001），蛹期、成虫期次之，差异亦有统计学意义（P=1.000），CpMet在幼虫各龄期表达量都较低。见图 1。

注：所有数据均为平均值±标准误；不同的字母表示差异有统计学意义；Egg表示1日龄卵；2ndL表示2日龄幼虫；5thL表示5日龄幼虫；8thL表示8日龄幼虫；11thL表示11日龄幼虫；1stP表示1日龄蛹；48hA表示2日龄雌性成虫。 图 1 淡色库蚊不同发育阶段CpMet的mRNA相对表达量 Figure 1 Relative CpMet mRNA expression in different developmental stages of Culex pipiens pallens

图选项

通过RT-qPCR检测了淡色库蚊未吸血的3~5日龄雌性成蚊不同组织部位CpMet的表达量情况，结果表明：CpMet在卵巢中表达量最高，脂肪体表达量次之，与除卵巢外的其他组织表达量差异有统计学意义（F=4 533.999，P < 0.001），表达量从高到低依次是卵巢、脂肪体、胸部、头部、马氏管、中肠。见图 2。

注：所有数据都是平均值±标准误；不同的字母表示不同组织两两比较差异有统计学意义。 图 2 CpMet在淡色库蚊不同组织的mRNA表达 Figure 2 CpMet expression in different tissues of Culex pipiens pallens

图选项

用JH类似物烯虫酯注射淡色库蚊蛹和未吸血未交尾的2~3日龄雌性成虫。结果显示，与对照（丙酮处理）相比，蚊蛹在烯虫酯处理6、12 h后CpMet表达量上调，分别为对照的1.91和1.35倍，而在处理24 h后表达量下调98.05%（图 3A）。成蚊用烯虫酯处理6、12和24 h后CpMet表达水平分别上调1.27、4.15和1.26倍。见图 3B。

注：所有数据均为平均值±标准误；*** 与对照组比较，P < 0.005。 图 3 烯虫酯处理后蛹（A）和成虫（B）CpMet mRNA相对表达量 Figure 3 Relative CpMet mRNA expression in pupae (A) and adult mosquitoes (B) after methoprene treatment

图选项

用20E注射淡色库蚊蛹。结果显示，与对照（乙醇处理组）相比，蚊蛹在20E处理6、12 h后，CpMet表达量与对照差异无统计学意义（F=0.271，P=0.630；F=6.441，P=0.064），而在处理24 h后CpMet表达量是对照组的68.11倍（图 4），表达量显著增加，差异有统计学意义（F=101.227，P < 0.001）。

注：所有数据均为平均值±标准误；**** 与对照组比较，P < 0.001。 图 4 20E处理后蛹CpMet mRNA相对表达量 Figure 4 Relative CpMet mRNA expression in pupae after 20E treatment

图选项

选择未吸血未交尾的3~4日龄雌性成蚊进行dsRNA干扰，每只雌蚊的注射量为200 nl，浓度为1.5 μg/μl。利用RT-qPCR检测基因表达水平，结果显示，与dsEGFP处理（对照）相比，dsCpMet处理组24 h后CpMet表达量下降了50.29%，48 h后转录水平被显著抑制了86.29%，与对照差异有统计学意义（F=9.157，P=0.039）。见图 5。

注：所有数据均为平均值±标准误；* 与dsEGFP比较，P < 0.05；WT表示空白对照；dsEGFP表示注射增强型荧光蛋白基因双链RNA组；dsCpMet表示注射CpMet双链RNA组。 图 5 RNAi后雌蚊CpMet mRNA表达 Figure 5 CpMet mRNA expression in female mosquitoes after RNA interference

图选项

注射1 d后的雌蚊用小白鼠进行24 h供血，统计每个处理组的产卵率、卵块平均含卵数、卵块平均孵化数及孵化率。结果显示，注射dsCpMet组的卵块平均含卵数显著下降了49.89%，与对照组比较差异有统计学意义（F=156.120，P < 0.001）。孵化率方面，注射dsCpMet组孵化率降至73.36%（图 6），与对照组比较差异有统计学意义（F=195.376，P < 0.001）。

注：所有数据均为平均值±标准误；* 与dsEGFP比较，P < 0.05，** P < 0.01；WT表示空白对照；dsEGFP表示注射增强型荧光蛋白基因双链RNA组；dsCpMet表示注射CpMet双链RNA组。 图 6 不同处理雌蚊的产卵情况（A）及孵化率（B） Figure 6 Oviposition (A) and hatching rate (B) of female mosquitoes in different treatment groups

图选项

JH是一种结构独特的倍半萜类激素，是昆虫发育和繁殖的主要调节因子。在幼虫的发育阶段，JH的主要作用是推迟变态，直到幼虫达到适当的阶段和大小。当JH的抗变态作用结束后，晚期蛹再次合成JH，在昆虫的生殖过程中起着至关重要的作用。JH利用多种分子机制在昆虫生命周期的不同阶段发挥不同的作用。

作为JH信号通路上的重要基因，Met基因在昆虫的不同发育阶段和不同组织中都有表达，但其表达模式因昆虫而异。鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）的BmMet基因在胚胎发育期、幼虫发育期和蛹变态期均有表达，并且表达量基本一致，对幼虫解剖后发现BmMet基因在卵巢、精巢和脂肪体中的表达量较高^[12]。半翅目昆虫褐飞虱（Nilaparvata lugens）的NlMet基因在卵期、不同龄期的若虫及成虫中均会有不同程度表达，其中卵期相对较高，对褐飞虱雌雄成虫解剖后发现，翅中NlMet基因的表达量最高^[13]。双翅目昆虫桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）的Met基因在整个发育阶段也会有不同程度的表达，其中幼虫期的表达量明显高于蛹期，对桔小实蝇的3龄幼虫进行解剖，检测发现马氏管和脂肪体表达量较高，其次为中肠和表皮^[14]。本研究发现淡色库蚊在不同发育阶段中，卵期CpMet基因表达量最高，其次是蛹期和成虫期，幼虫期表达量最低。组织表达模式分析结果表明，相对于其他组织，CpMet基因在卵巢、脂肪体中表达量要略高。深入研究发现经JH类似物烯虫酯处理后不同时间的淡色库蚊，雌成虫CpMet基因的表达量均会有不同程度的增加，表明CpMet基因受JH的正调控，在成虫阶段参与JH信号的传导，作为JH的受体调节淡色库蚊的生殖。用蜕皮激素20E处理蚊蛹24 h后，CpMet基因的表达量急剧增加，表明CpMet基因表达受20E的诱导，在家蚕的研究中也有类似的发现，在蜕皮和化蛹期，20E滴度较高时，Met的表达达到峰值^[15]。

Met作为JH的细胞内受体和传感器在昆虫的生长发育、生殖过程中发挥着重要的作用。目前，关于Met的功能研究主要围绕以下几个方面：调控幼虫的生长和变态发育^[16]、翅的分化^[17]、外生殖器的形成^[18]以及对雌性成虫生殖^{[7, 19]}的影响。Met基因对昆虫生殖的影响报道较多，干扰始红蝽（Pyrrhocoris apterus）的Met基因会抑制卵巢发育^[18]；干扰赤拟谷盗（Tribolium castaneum）的Met基因会抑制其卵黄蛋白的合成^[20]，影响其雌性成虫的产卵量并能在卵黄原蛋白中表达^[21]；干扰飞蝗（Locusta migratoria）的Met基因会影响卵母细胞的成熟和卵巢的发育^[22]；干扰太平洋折翅蠊（Diploptera punctata）的Met基因会阻止卵母细胞的生长和卵黄原蛋白的产生，进而影响到卵巢的发育^[23]；干扰埃及伊蚊Met基因会导致埃及伊蚊的产卵量显著降低^[6]；敲除沙漠蝗虫的Scg-Met基因导致雄性副腺的相对重量和相对蛋白质含量降低^[24]。本文利用RNA干扰技术干扰淡色库蚊雌性成蚊的CpMet后，48 h干扰效率最高达到86.29%，雌蚊CpMet被干扰后可以正常交配并产卵，但是卵块不规则且部分无法正常孵化，产卵量和孵化率都有不同程度的下降。研究结果进一步证实了Met基因对蚊虫生殖的调控作用，干扰Met基因后产卵量显著下降，表明将Met作为蚊虫控制的潜在靶标是可行的，但如何运用到蚊虫防治实践中还需要大量的研究工作。

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