中国媒介生物学及控制杂志  2021, Vol. 32 Issue (6): 666-671

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李博, 崔燕, 刘遵季, 古丽阿依·包凯西, 罗勇军, 麦迪娜·肖开提, 王启果, 雒涛
LI Bo, CUI Yan, LIU Zun-ji, GULIAYI·Baokaixi, LUO Yong-jun, MAIDINA·Xiaokaiti, WANG Qi-guo, LUO Tao
新疆鼠疫菌株多位点可变数目串联重复序列基因分型研究
MLVA genotyping of Yersinia pestis isolates from natural foci in Xinjiang, China
中国媒介生物学及控制杂志, 2021, 32(6): 666-671
Chin J Vector Biol & Control, 2021, 32(6): 666-671
10.11853/j.issn.1003.8280.2021.06.003

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收稿日期: 2021-06-24
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李博, 崔燕, 刘遵季, 古丽阿依·包凯西, 罗勇军, 麦迪娜·肖开提, 王启果, 雒涛. 新疆鼠疫菌株多位点可变数目串联重复序列基因分型研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2021, 32(6): 666-671.
LI Bo, CUI Yan, LIU Zun-ji, GULIAYI·Baokaixi, LUO Yong-jun, MAIDINA·Xiaokaiti, WANG Qi-guo, LUO Tao. MLVA genotyping of Yersinia pestis isolates from natural foci in Xinjiang, China[J]. Chin J Vector Biol & Control, 2021, 32(6): 666-671.
新疆鼠疫菌株多位点可变数目串联重复序列基因分型研究
李博1 , 崔燕1 , 刘遵季2 , 古丽阿依·包凯西1 , 罗勇军1 , 麦迪娜·肖开提1 , 王启果1 , 雒涛1     
1 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心应急鼠防所, 新疆 乌鲁木齐 830001;
2 新疆维吾尔自治区人民医院, 新疆 乌鲁木齐 830001
收稿日期: 2021-06-24
基金项目: 新疆维吾尔自治区自然科学基金（2018D01C089）
作者简介: 李博, 男, 硕士, 主管技师, 主要从事鼠疫实验室诊断研究, E-mail: king-2032169@163.com
通信作者: 雒涛, E-mail: 54773938@qq.com
摘要: 目的 应用多位点可变数目串联重复序列基因分型方法，对新疆维吾尔自治区（新疆）4个类型鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）分离株进行基因分型研究，探析新疆分离株与我国其他鼠疫疫源地分离株之间的遗传进化关系。方法 收集2015-2019年新疆4个类型鼠疫自然疫源地18株分离株，提取鼠疫菌基因组DNA，采用多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）（14+12 VNTR位点）技术、多色毛细管电泳方法进行基因分型，运用BioNumerics 7.6软件对基因分型结果进行聚类分析。结果 18株鼠疫分离株被14位点MLVA分为3个群、12个基因型；被14+12位点MLVA分为3个群、15个基因型，且同类型鼠疫自然疫源地分离株聚为一个分支。不同时期、同类型鼠疫自然疫源地的分离株亲缘关系较近，基因型存在明显的地区聚集性，遗传性相对稳定。结论 新疆4个类型鼠疫自然疫源地分离株基因型呈多态性，遗传性相对稳定；MLVA分型方法适宜新疆鼠疫分离株遗传进化与溯源研究。
关键词: 多位点可变数目串联重复序列分析    多色毛细管电泳    鼠疫耶尔森菌    新疆    
MLVA genotyping of Yersinia pestis isolates from natural foci in Xinjiang, China
LI Bo1 , CUI Yan1 , LIU Zun-ji2 , GULIAYI·Baokaixi1 , LUO Yong-jun1 , MAIDINA·Xiaokaiti1 , WANG Qi-guo1 , LUO Tao1     
1 Institute for Emergency and Plague Control, Xinjiang Uygur Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention, Urumqi, Xinjiang 830001, China;
2 People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi, Xinjiang 830001, China
Supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region of China (No. 2018D01C089)
Corresponding author: LUO Tao, E-mail: 54773938@qq.com.
Abstract: Objective To study the genotypes of Yersinia pestis isolated from four types of the plague natural foci in Xinjiang Uygur Autonomous Region (Xinjiang), China by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA), and to investigate the genetic and evolutionary relationship of the isolates between Xinjiang and other plague natural foci in China. Methods The genomic DNA of 18 Y. pestis isolates from four types of natural foci in Xinjiang from 2015 to 2019 was extracted. MLVA (14+12 VNTRs) and multicolor capillary electrophoresis were used for genotyping, and the BioNumerics 7.6 software was used for cluster analysis. Results The 18 isolates were divided into three groups with 12 genotypes by MLVA 14, and three groups with 15 genotypes by MLVA 14+12. The isolates from the foci of the same type could be clustered into one branch, and the isolates from the same type of foci in different periods had close genetic relationship, with obvious regional clustering of genotypes, exhibiting relatively high genetic stability. Conclusion MLVA analysis shows polymorphism in Y. pestis isolates from four types of the natural foci in Xinjiang, with relatively high genetic stability. MLVA typing is suitable for the phylogenetic and traceable study of Y. pestis isolates in Xinjiang.
Key words: Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis    Multicolor capillary electrophoresis    Yersinia pestis    Xinjiang    

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）引起的一种急性、烈性传染病，在人类历史上，世界各地曾多次发生鼠疫流行，死亡者以亿计[1]。截止到2021年1月，新疆维吾尔自治区（新疆）连续28年未发生人间鼠疫疫情，但动物间疫情从未静息。“十二五”期间，新疆4个类型鼠疫自然疫源地平均检出鼠疫菌22.6株，占全国的17.2%，由动物疫情传播至人间的风险依然存在[2-3]。研究鼠疫分离株的种群遗传特征是掌握鼠疫传播特点、溯源研究的基础，对鼠疫防控工作具有十分重要的意义。多位点可变数目串联重复序列分析（multiple-locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）根据不同菌株基因组间存在不同独立位点可变数目串联重复序列拷贝数进行基因分型，该方法操作简单、重复性好，可比对性强，具有高通量快速分析、网络共享的特点，适于流行病学溯源分析[4-5]。本研究运用14+12可变串联重复序列（VNTR）位点MLVA分型方法对2015-2019年新疆4个类型鼠疫自然疫源地18株分离株DNA进行基因分型，以探讨其与全国其他鼠疫自然疫源地分离株之间的遗传进化关系，为新疆鼠疫防控工作提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 菌株DNA来源

收集2015-2019年新疆疾病预防控制中心在鼠疫监测工作中，分离自天山灰旱獭（Marmota baibacina）-长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）鼠疫疫源地、帕米尔高原红旱獭（M. caudata）鼠疫疫源地、昆仑山喜马拉雅旱獭（M. himalayana）鼠疫疫源地和准噶尔盆地大沙鼠（Rhombomys opimus）鼠疫疫源地的鼠疫菌18株（表 1）。运用试剂盒法提取鼠疫菌基因组DNA，基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司（生产批号：69504）。

表 1 2015-2019年新疆维吾尔自治区分离的鼠疫菌株信息 Table 1 Information of Yersinia pestis isolates in Xinjiang, 2015-2019
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1.2 仪器与试剂

96孔梯度PCR扩增仪（Bio-Rad美国）、毛细管电泳仪（ABI美国）、低温高速离心机（SIGMA德国）、水平电泳槽、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、凝胶成像仪（Bio-Rad美国）；分子生物学试剂由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.3 14+12分型方法

采用Li等[4]筛选、建立的14+12 VNTR鼠疫MLVA分型方法，26个VNTR位点引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。见表 2。

表 2 本研究所用引物序列 Table 2 Information of primer sequences used in this study
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1.4 PCR扩增反应

反应体系总体积为25 μl，其中Premix ExTaq 12.5 μl，正、反向引物（浓度10 μmol/L）各1 μl，模板DNA 1 μl，去离子水9.5 μl。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃ 5 min。

1.5 电泳分析

PCR产物进行毛细管电泳，根据电泳测定的产物分子质量大小，计算VNTR的重复拷贝数。采用Excel 2013软件收集18株鼠疫分离株以及已发表的22株全国不同鼠疫疫源地对照菌株（表 3）[4]的26个VNTR重复拷贝数，利用BioNumerics 7.6软件的非加权组平均法（UPGMA）对各VNTR进行聚类分析，以相似度 > 60%的菌株DNA分为1个基因群组，100%相似度的菌株为1个基因型，绘制聚类图。

表 3 对照鼠疫菌株信息 Table 3 Information of control Yersinia pestis isolates
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2 结果 2.1 分离株聚类分析结果

14 VNTR位点聚类分析结果显示，18株分离株被聚类为3个群（A、B、C）、12个基因型，其中A群13株，分为8个基因型；除2018年分离自准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地分离株与喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地分离株被聚类为一个分支，其他同一类型鼠疫疫源地或同一年度分离株的亲缘关系较近（图 1）。14+12 VNTR位点聚类分析结果显示，18株分离株被聚类为3个群（A、B、C）、15个基因型，其中A群13株，分为11个基因型，同一类型鼠疫疫源地分离株被聚为一个分支。见图 2。

图 1 鼠疫菌分离株14位点多位点可变数目串联重复序列分析分型的聚类分析结果 Figure 1 Cluster analysis results of genotypes of Yersinia pestis isolates by MLVA 14
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图 2 鼠疫菌分离株14+12位点多位点可变数目串联重复序列分析分型的聚类分析结果 Figure 2 Cluster analysis results of genotypes of Yersinia pestis isolates by MLVA 14+12
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2.2 分离株与对照菌株聚类分析结果

收集已发表的新疆、青海、甘肃、内蒙古、云南、贵州、宁夏7省（自治区）不同疫源地22株分离株14+12位点MLVA分型结果，与18株分离株MLVA分型结果进行聚类分析，结果显示，除2017年克孜勒苏柯尔克孜自治州（克州）分离菌株以外，2015-2019年新疆鼠疫分离株与同一鼠疫疫源地不同时期分离株可聚为一个分支，其亲缘关系较近；2015-2019年分离株与20世纪同一鼠疫疫源地分离株的部分VNTR位点重复数的差异较大，但近年同一鼠疫疫源地分离株的VNTR位点重复数差异较小，如2017年分离自若羌县的2株菌株，其14+12位点均一致，但与1985年分离自若羌县的菌株相比，存在10个位点的差异。此外，不同省（自治区）但同一鼠疫疫源地分离株的亲缘关系较近。见图 3。

图 3 鼠疫菌分离株与对照菌株14+12位点多位点可变数目串联重复序列分析分型的聚类分析结果 Figure 3 Cluster analysis results of genotypes of Yersinia pestis isolates and control strains by MLVA 14+12
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3 讨论

新疆现有4个类型的鼠疫疫源地，面积为33万km2，约占全疆国土面积的20.00%。新疆各鼠疫疫源地动物鼠疫极为活跃[6-7]，“十二五”期间，共检出鼠疫菌113株。此外，蒙古、哈萨克斯坦等接壤国家频繁发生人间、动物间鼠疫，加剧了远距离传播风险[8-9]。综合上述因素，导致新疆鼠疫防控形势不容乐观。本研究通过对近年新疆不同鼠疫疫源地分离株进行基因分型，以掌握菌株基因遗传特征与分子流行病学信息，探索其与国内其他鼠疫疫源地流行菌株的亲缘关系，对本地区分离株溯源研究和防控疫情具有重要意义。

本研究选取2015-2019年新疆4个类型鼠疫疫源地18株分离株进行14位点和14+12位点MLVA分型，其中14位点将18株分离株聚类为3个群，12个型；XJ-2、XJ-3、XJ-4、XJ-5、XJ-6、XJ-7、XJ-8、XJ-9、XJ-10、XJ-12和XJ-13共11株分离株分属5个基因型，不同分离时间、不同分离来源，但同一鼠疫疫源地的菌株具有相同的基因型。14位点聚类显示，准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地与昆仑山喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地的分离株被聚为一个分支，结合有关准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地分离株与哈萨克斯坦荒漠鼠疫疫源地分离株亲缘关系近的研究推断[10]，提示14位点分型分辨能力较低。采用14+12位点对分离株进行分型，结果显示18株分离株被聚类为3个群，15个型，其中天山灰旱獭-长尾黄鼠鼠疫疫源地、帕米尔高原红旱獭鼠疫疫源地分离株被聚为一个群，相较于准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地，其他3类鼠疫疫源地分离株亲缘关系较近。14+12位点分型方法可以将不同时期准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地分离株聚为一个分支，展现出比14位点分型更高的分辨能力。

2015-2019年新疆18株分离株与不同省份22株对照菌株的14+12位点MLVA分型聚类提示：新疆分离株的基因型与鼠疫自然疫源地的空间分布相关性较强，存在明显的地区聚集性；同一鼠疫疫源地不同分离时期的分离株存在部分VNTR位点重复数差异，但聚类显示该类菌株被聚类为一个分支，如分离自1985年与2017年若羌县的分离株，菌株间存在10个位点的差异，但亲缘关系仍较近，表明新疆分离株基因型与分离时期无明显的相关性，鼠疫菌种群进化存在变异，但遗传相对稳定。

综上所述，本研究利用14+12位点MLVA分型方法，既可进行分离株基因型分型，又可探索鼠疫菌种群进化关系，较为适用新疆突发鼠疫公共卫生事件的溯源研究。研究提示，近年新疆4个类型疫源地鼠疫分离株基因分型存在明显的地区聚集性，遗传相对稳定。但鉴于部分鼠疫疫源地间无天然屏障，存在因宿主动物迁徙导致疫情远距离传播的可能，因此，应充分利用基因分型方法，监测疫情跨鼠疫疫源地传播的风险。

志谢 中国疾病预防控制中心（CDC）传染病预防控制所鼠疫室王宇萌老师给予技术支持，克拉玛依市CDC、乌鲁木齐市米东区CDC、吉木萨尔县CDC给予现场支持，特此志谢

利益冲突   无

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