中国媒介生物学及控制杂志  2021, Vol. 32 Issue (6): 666-671
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鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）引起的一种急性、烈性传染病，在人类历史上，世界各地曾多次发生鼠疫流行，死亡者以亿计[1]。截止到2021年1月，新疆维吾尔自治区（新疆）连续28年未发生人间鼠疫疫情，但动物间疫情从未静息。“十二五”期间，新疆4个类型鼠疫自然疫源地平均检出鼠疫菌22.6株，占全国的17.2%，由动物疫情传播至人间的风险依然存在[2-3]。研究鼠疫分离株的种群遗传特征是掌握鼠疫传播特点、溯源研究的基础，对鼠疫防控工作具有十分重要的意义。多位点可变数目串联重复序列分析（multiple-locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）根据不同菌株基因组间存在不同独立位点可变数目串联重复序列拷贝数进行基因分型，该方法操作简单、重复性好，可比对性强，具有高通量快速分析、网络共享的特点，适于流行病学溯源分析[4-5]。本研究运用14+12可变串联重复序列（VNTR）位点MLVA分型方法对2015-2019年新疆4个类型鼠疫自然疫源地18株分离株DNA进行基因分型，以探讨其与全国其他鼠疫自然疫源地分离株之间的遗传进化关系，为新疆鼠疫防控工作提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 菌株DNA来源收集2015-2019年新疆疾病预防控制中心在鼠疫监测工作中，分离自天山灰旱獭（Marmota baibacina）-长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）鼠疫疫源地、帕米尔高原红旱獭（M. caudata）鼠疫疫源地、昆仑山喜马拉雅旱獭（M. himalayana）鼠疫疫源地和准噶尔盆地大沙鼠（Rhombomys opimus）鼠疫疫源地的鼠疫菌18株（表 1）。运用试剂盒法提取鼠疫菌基因组DNA，基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司（生产批号：69504）。
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96孔梯度PCR扩增仪（Bio-Rad美国）、毛细管电泳仪（ABI美国）、低温高速离心机（SIGMA德国）、水平电泳槽、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、凝胶成像仪（Bio-Rad美国）；分子生物学试剂由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。
1.3 14+12分型方法采用Li等[4]筛选、建立的14+12 VNTR鼠疫MLVA分型方法，26个VNTR位点引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。见表 2。
反应体系总体积为25 μl，其中Premix ExTaq 12.5 μl，正、反向引物（浓度10 μmol/L）各1 μl，模板DNA 1 μl，去离子水9.5 μl。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃ 5 min。
1.5 电泳分析PCR产物进行毛细管电泳，根据电泳测定的产物分子质量大小，计算VNTR的重复拷贝数。采用Excel 2013软件收集18株鼠疫分离株以及已发表的22株全国不同鼠疫疫源地对照菌株（表 3）[4]的26个VNTR重复拷贝数，利用BioNumerics 7.6软件的非加权组平均法（UPGMA）对各VNTR进行聚类分析，以相似度 > 60%的菌株DNA分为1个基因群组，100%相似度的菌株为1个基因型，绘制聚类图。
14 VNTR位点聚类分析结果显示，18株分离株被聚类为3个群（A、B、C）、12个基因型，其中A群13株，分为8个基因型；除2018年分离自准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地分离株与喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地分离株被聚类为一个分支，其他同一类型鼠疫疫源地或同一年度分离株的亲缘关系较近（图 1）。14+12 VNTR位点聚类分析结果显示，18株分离株被聚类为3个群（A、B、C）、15个基因型，其中A群13株，分为11个基因型，同一类型鼠疫疫源地分离株被聚为一个分支。见图 2。
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| 图 1 鼠疫菌分离株14位点多位点可变数目串联重复序列分析分型的聚类分析结果 Figure 1 Cluster analysis results of genotypes of Yersinia pestis isolates by MLVA 14 |
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| 图 2 鼠疫菌分离株14+12位点多位点可变数目串联重复序列分析分型的聚类分析结果 Figure 2 Cluster analysis results of genotypes of Yersinia pestis isolates by MLVA 14+12 |
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收集已发表的新疆、青海、甘肃、内蒙古、云南、贵州、宁夏7省（自治区）不同疫源地22株分离株14+12位点MLVA分型结果，与18株分离株MLVA分型结果进行聚类分析，结果显示，除2017年克孜勒苏柯尔克孜自治州（克州）分离菌株以外，2015-2019年新疆鼠疫分离株与同一鼠疫疫源地不同时期分离株可聚为一个分支，其亲缘关系较近；2015-2019年分离株与20世纪同一鼠疫疫源地分离株的部分VNTR位点重复数的差异较大，但近年同一鼠疫疫源地分离株的VNTR位点重复数差异较小，如2017年分离自若羌县的2株菌株，其14+12位点均一致，但与1985年分离自若羌县的菌株相比，存在10个位点的差异。此外，不同省（自治区）但同一鼠疫疫源地分离株的亲缘关系较近。见图 3。
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| 图 3 鼠疫菌分离株与对照菌株14+12位点多位点可变数目串联重复序列分析分型的聚类分析结果 Figure 3 Cluster analysis results of genotypes of Yersinia pestis isolates and control strains by MLVA 14+12 |
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新疆现有4个类型的鼠疫疫源地，面积为33万km2，约占全疆国土面积的20.00%。新疆各鼠疫疫源地动物鼠疫极为活跃[6-7]，“十二五”期间，共检出鼠疫菌113株。此外，蒙古、哈萨克斯坦等接壤国家频繁发生人间、动物间鼠疫，加剧了远距离传播风险[8-9]。综合上述因素，导致新疆鼠疫防控形势不容乐观。本研究通过对近年新疆不同鼠疫疫源地分离株进行基因分型，以掌握菌株基因遗传特征与分子流行病学信息，探索其与国内其他鼠疫疫源地流行菌株的亲缘关系，对本地区分离株溯源研究和防控疫情具有重要意义。
本研究选取2015-2019年新疆4个类型鼠疫疫源地18株分离株进行14位点和14+12位点MLVA分型，其中14位点将18株分离株聚类为3个群，12个型；XJ-2、XJ-3、XJ-4、XJ-5、XJ-6、XJ-7、XJ-8、XJ-9、XJ-10、XJ-12和XJ-13共11株分离株分属5个基因型，不同分离时间、不同分离来源，但同一鼠疫疫源地的菌株具有相同的基因型。14位点聚类显示，准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地与昆仑山喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地的分离株被聚为一个分支，结合有关准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地分离株与哈萨克斯坦荒漠鼠疫疫源地分离株亲缘关系近的研究推断[10]，提示14位点分型分辨能力较低。采用14+12位点对分离株进行分型，结果显示18株分离株被聚类为3个群，15个型，其中天山灰旱獭-长尾黄鼠鼠疫疫源地、帕米尔高原红旱獭鼠疫疫源地分离株被聚为一个群，相较于准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地，其他3类鼠疫疫源地分离株亲缘关系较近。14+12位点分型方法可以将不同时期准噶尔盆地大沙鼠鼠疫疫源地分离株聚为一个分支，展现出比14位点分型更高的分辨能力。
2015-2019年新疆18株分离株与不同省份22株对照菌株的14+12位点MLVA分型聚类提示：新疆分离株的基因型与鼠疫自然疫源地的空间分布相关性较强，存在明显的地区聚集性；同一鼠疫疫源地不同分离时期的分离株存在部分VNTR位点重复数差异，但聚类显示该类菌株被聚类为一个分支，如分离自1985年与2017年若羌县的分离株，菌株间存在10个位点的差异，但亲缘关系仍较近，表明新疆分离株基因型与分离时期无明显的相关性，鼠疫菌种群进化存在变异，但遗传相对稳定。
综上所述，本研究利用14+12位点MLVA分型方法，既可进行分离株基因型分型，又可探索鼠疫菌种群进化关系，较为适用新疆突发鼠疫公共卫生事件的溯源研究。研究提示，近年新疆4个类型疫源地鼠疫分离株基因分型存在明显的地区聚集性，遗传相对稳定。但鉴于部分鼠疫疫源地间无天然屏障，存在因宿主动物迁徙导致疫情远距离传播的可能，因此，应充分利用基因分型方法，监测疫情跨鼠疫疫源地传播的风险。
志谢 中国疾病预防控制中心（CDC）传染病预防控制所鼠疫室王宇萌老师给予技术支持，克拉玛依市CDC、乌鲁木齐市米东区CDC、吉木萨尔县CDC给予现场支持，特此志谢利益冲突 无
| [1] |
纪树立. 鼠疫[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1988: 1-7. Ji SL. Plague[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 1988: 1-7. |
| [2] |
杨波, 曹汉礼, 雒涛, 等. "十二五"新疆维吾尔自治区鼠疫防控现状分析[J]. 疾病预防控制通报, 2016, 31(3): 28-31. Yang B, Cao HL, Luo T, et al. Analysis on the situation of plague prevention and control in Xinjiang from 2010 to 2015[J]. Bull Dis Control Prev, 2016, 31(3): 28-31. DOI:10.13215/j.cnki.jbyfkztb.1605010 |
| [3] |
阿布力克木·阿布都热西提, 贺青松, 王信惠, 等. 2015-2017年新疆青河县山区鼠疫自然疫源地初步调查[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2018, 29(5): 514-517. Abudurexit A, He QS, Wang XH, et al. Investigation on plague foci of natural infection in Qinghe county of Xinjiang Uygur Autonomous Region, 2015-2017[J]. Chin J Vector Biol Control, 2018, 29(5): 514-517. DOI:10.11853/j.issn.1003.8280.2018.05.025 |
| [4] |
Li YJ, Cui YJ, Cui BZ, et al. Features of variable number of tandem repeats in Yersinia pestis and the development of a hierarchical genotyping scheme[J]. PLoS One, 2013, 8(6): e66567. DOI:10.1371/journal.pone.0066567 |
| [5] |
付秀萍, 俞东征, 海荣. 串联重复序列及其在鼠疫菌基因分型中的应用[J]. 中华流行病学杂志, 2004, 25(3): 269-272. Fu XP, Yu DZ, Hai R. Application of tandem repeat sequence in genotyping of Yersinia pestis[J]. Chin J Epidemiol, 2004, 25(3): 269-272. DOI:10.3760/j.issn:0254-6450.2004.03.022 |
| [6] |
李博, 阿扎提·热合木, 王信惠, 等. 新疆乌苏古尔图鼠疫自然疫源地监测分析[J]. 疾病预防控制通报, 2014, 29(6): 30-31, 34. Li B, Rehemu A, Wang XH, et al. Surveillance report on plague in Guertu plague natural focus in Xinjiang[J]. Bull Dis Control Prev, 2014, 29(6): 30-31, 34. DOI:10.13215/j.cnki.jbyfkztb.1403057 |
| [7] |
贵有军, 王启果, 雒涛, 等. 新疆乌苏市古尔图镇2006-2010年动物间鼠疫监测分析[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2019, 30(3): 331-333. Gui YJ, Wang QG, Luo T, et al. Surveillance and analysis of animal plague epidemic in Guertu town, Usu city, Xinjiang from 2006 to 2010[J]. Chin J Vector Biol Control, 2019, 30(3): 331-333. DOI:10.11853/j.issn.1003.8280.2019.03.024 |
| [8] |
龚震宇. 2019年全球鼠疫疫情概况[J]. 疾病监测, 2019, 34(8): 775-776. Gong ZY. Plague of global epidemic in 2019[J]. Dis Surveill, 2019, 34(8): 775-776. DOI:10.3784/j.issn.1003-9961.2019.08.021 |
| [9] |
郭荣, 谢木西丁·艾麦提, 党辉, 等. 中亚边境区域新疆天山南脉、帕米尔高原东部动物鼠疫疫情分析[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2020, 31(1): 16-20. Guo R, Aimaiti X, Dang H, et al. An epidemic analysis of the animal plague in southern Tianshan mountains in Xinjiang, China and eastern Pamir plateau of Central Asia's border areas[J]. Chin J Vector Biol Control, 2020, 31(1): 16-20. DOI:10.11853/j.issn.1003.8280.2020.01.004 |
| [10] |
贵有军, 崔燕, 古丽阿依·包开西, 等. 丝绸之路经济带建设中新疆鼠疫风险及防控对策[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2019, 30(5): 593-596. Gui YJ, Cui Y, Baokaixi G, et al. The risk of plague and its prevention and control strategies in Xinjiang during the development of the Silk Road Economic Belt[J]. Chin J Vector Biol Control, 2019, 30(5): 593-596. DOI:10.11853/j.issn.1003.8280.2019.05.028 |
表1(Table 1)
