土壤微生物包括不同类型的细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物，是土壤生态系统的重要组成成分，其数量巨大，直接或者间接地参与土壤的生物化学转化过程^[1]，对生态系统的养分循环、能量流动都有重要影响^[2]。土壤微生物量是土壤有机质降解和养分转化的动力，为植物提供重要的养分来源和储存库_，^[3]因而直接影响到养分循环及其生物有效性。同时，土壤微生物量C或N转化速率较快，可以作为表征土壤总碳或总氮变化的敏感的生物学指标和土壤质量可持续性演变的重要指标^[4-6]。

藏北高原草地面积达0.42亿hm²，占西藏总草地面积的67.9%，其主体为高寒草原，是青藏高原腹地分布最广泛的生态系统类型^[7]，对中国乃至亚洲整体的生态安全具有重要的屏障作用^[8]。藏北高寒草原存在着不同程度的退化，其生态恢复也受到越来越广泛的关注。施肥是一项传统的农业生产措施，在土壤养分供应受限的自然生态系统上施肥往往能够增加植物群落的生产力，也能显著影响土壤微生物量碳、氮含量^[9-10]。目前国内外关于施肥对微生物量碳氮影响的研究已有大量报道，多集中于水稻^[11-12]、小麦^[13-14]、玉米^[15]等粮田土壤，以及芹菜^[16]等菜地土壤。关于施用无机肥料对于土壤微生物量碳、氮的影响尚无一致的结论。如：在温带森林中Gallardo和Schlesinger^[17]发现添加氮素对微生物生长有促进作用，提高土壤的微生物量，但是另外两个研究的结果却是长期氮素添加降低土壤微生物的生物量与活性^[18-19]，而在农田和草地上也有研究发现氮素的添加对土壤微生物并没有显著影响^[20-21]；添加磷肥对微生物量的研究报道较少，Biederbeck等^[22]发现长期施用磷肥可促进土壤微生物的增长。这些研究结果的差异可能与无机肥的种类、施用方式、土壤及气候类型等有关。

目前对土壤微生物量的研究主要集中于表层0~10 cm和0~20 cm土壤^[23-25]。大量研究表明，施肥对土壤表层的土壤微生物数量、微生物量的影响最为显著^[26]，且影响随着土壤深度的增加而降低^[27-28]。但也有研究表明，随着植物根系向更深层土壤的延伸和肥料随降雨向深层土壤的迁移，施肥可能会对较深层土壤的微生物产生影响^[29]，因此有必要深入探讨不同深度土壤中微生物量碳、氮对施肥的响应。

由于社会经济和工业的发展，全球范围内活性氮的排放量逐渐增加，导致陆地生态系统的大气氮沉降加剧^[30]，已经成为植物群落结构改变的重要因子^[31-32]。氮是限制陆地生态系统生产力的重要元素之一，由于不同植物对氮素增加的响应不同，因此氮沉降对不同植物会产生不同的影响，长期氮沉降将会改变植物群落的结构，进而影响生态系统的结构、功能和稳定性，包括生态系统的碳循环过程。在大气氮沉降增加的背景下，研究包括微生物在内的土壤环境变化过程，有助于全面认识生态系统碳循环对气候变化的响应。尽管国内外开展了不少草地无机养分添加的研究，但是针对藏北高寒草原的养分添加试验还鲜见报道。本研究位于西藏自治区那曲地区班戈县的典型高寒草原，通过连续2个生长季添加不同水平的氮、磷肥，探讨氮、磷添加对高寒草原不同层次土壤微生物量碳、氮含量的影响，以期为退化草原人工恢复及土壤培肥提供科学依据，为高寒草原植物土壤微生物群落结构和功能的演变预测提供支撑。

本研究区位于西藏自治区那曲地区班戈县普保镇，GPS方位为90°02″12′E、31°26′36″N，平均海拔4 745 m，属高原亚寒带季风半干旱气候区。气候数据表明：该地区年日照时数3 210.3 h，昼夜温差大，年最高气温21.9 ℃，年最低气温-28.6 ℃。年蒸发量(1 993.4~2 104.1 mm)是年降水量(289~389 mm)的6.9~7.3倍。班戈县地处南羌塘高原湖盆地区，草地广阔，除部分为高山草甸外，多数主要是高山草原^[33]。研究区土壤的基本理化性质见表 1。

Table 1

表 1 土壤基本理化性质 Table 1 Properties of tested soil 深度/ cm 有机质 含量/ (g/kg) 全氮 含量/ (g/kg) 全磷 含量 (g/kg) 碱解 氮/ (mg/kg) 有效磷 含量/ (mg/kg) pH值 0~10 32.53 1.65 0.618 128.17 4.96 6.97 10~20 18.80 1.09 0.741 77.30 3.04 7.04 20~30 20.17 1.16 0.674 67.11 3.24 7.70

表 1 土壤基本理化性质 Table 1 Properties of tested soil

2013年在所选样地设置网围栏，并捡除样地内可见的牛羊粪便以排除试验前放牧带入的动物粪便的影响。试验包括氮肥、磷肥2个因子，其中N设置3个水平(每年施用0、7.5和15 g N/m²)、P设置4个水平(每年施用0、7.5、15和30 g P₂O₅/m²)，共12个处理，每个处理重复5次，共60个小区，采用完全随机区组设计。每个小区面积为5 m×5 m, 相邻小区间隔2 m。试验于2013年8月中旬第1次施肥，施肥量为年施肥量的1/3；2014和2015年每年分2次等量撒施，7月初第1次施肥，在地表看不到肥料颗粒时进行第2次施肥，时间间隔约为一个月。氮肥选用尿素，其含氮量为46.4%；磷肥用重过磷酸钙(Ca(H₂PO₄)₂)，含P₂O₅为46%。为保证施肥效果，施肥时间选择在晴天的傍晚和雨后。

在2015年8月下旬，即植物生长旺盛期，在每个小区中随机设置1个1 m×1 m的样方，齐地面剪取样方框内植物的地上部分后，采用S型采样法在每个样方内选取7个采样点，用直径为2.8 cm的土钻分0~10、10~20和20~30 cm深度采集土壤样品，若碰到鼠洞则重新选点取样。将每个样方同一层次7个点的样品混合为一个土样，去除石砾和植物残根等杂物后混和均匀，过2 mm土壤筛后于4 ℃冰箱内保存，用保温箱(干冰保温)带回北京测定。

土壤微生物量碳、氮含量采用熏蒸浸提-TOC仪测定，计算公式分别为：

式中：B_C为微生物量碳(mg/kg)，E_C为熏蒸土壤与未熏蒸土壤的差值；K_EC为转换系数，取值0.38；B_N为微生物量氮(mg/kg)，E_N为熏蒸土壤与未熏蒸土壤的差值；K_EN为转换系数，取值0.45。

土壤基本理化性质采用常规分析方法^[34]：土壤有机质含量测定采用重铬酸钾容量法，外加热、硫酸亚铁溶液滴定；土壤全氮含量采用半微量凯氏法测定，土样碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以标准酸溶液滴定；碱解氮采用碱解扩散法测定；土壤速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO₃浸提，钼锑抗比色法测定；pH值采用2.5:1水土比，酸度计测定。

用SPSS19.0对试验数据进行统计分析，其中，各施肥处理、氮肥和磷肥对不同土层微生物量碳、氮含量的影响采用One-way ANOVA分析，而处理与土层之间的交互作用、氮磷肥之间的交互作用均采用Two-way ANOVA，方差齐性检验均用Duncan方法检验，显著性水平为P=0.05。图形绘制用Origin 9.1进行绘制。

施加不同比例氮磷肥对土壤微生物量碳含量的影响如图 1所示。1)在10~20和20~30 cm土层，各施肥处理的微生物量碳含量与不施肥处理(N₀P₀)之间差异均不显著；氮、磷肥施用主要影响表层土壤的微生物碳含量，0~10 cm土层微生物量碳含量均值分别是10~20 cm和20~30 cm土层的1.67倍和1.28倍。2)0~10 cm土层在N₀(0 g N/m²)和N₁(7.5 g N/m²)水平下，增施磷肥与空白处理(N₀P₀)之间微生物量碳含量差异不显著，这表明低浓度氮下磷不是微生物量碳含量的主要限制因素，此时添加磷肥并不能促进微生物量碳含量的增加。3)在N₂(15 g N/m²)水平下，微生物量碳含量随磷肥施用量的添加逐渐增加，且在施磷15和30 g P₂O₅/m²与不施磷肥处理差异达显著水平。说明当施氮15 g N/m²时，磷元素成为限制因子，添加磷肥有利于微生物量碳含量的增加。4)从处理N₀P₀、N₁P₀和N₂P₀可以看出，在不施磷的条件下添加氮肥降低微生物量碳含量，且在不施氮与施氮15 g N/m²处理之间差异达显著水平。从处理N₀P₃、N₁P₃和N₂P₃可以看出，在施磷30 g P₂O₅/m²条件下增施氮肥，土壤微生物量碳含量逐渐增加，且施氮15和7.5 g N/m²与不施氮之间差异达显著水平。说明微生物量碳含量受土壤磷元素限制，但当施磷达30 g P₂O₅/m²时，氮元素进一步成为限制因子。综合分析，氮、磷肥配施相对于单施氮、磷肥，更有利于0~10 cm土层微生物量碳含量的积累。

Fig. 1

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图 1 各处理不同土层微生物量碳含量 Fig. 1 Microbial biomass carbon content at different treatment levels of nitrogen and phosphorus

不同土层微生物量氮含量对氮、磷添加的响应如图 2所示。1)在0~10 cm土层，除N₂P₃外，各施肥处理之间差异均不显著，说明表层土壤微生物量氮含量对较低的氮、磷施用响应不敏感；10~20和20~30 cm土层的微生物量氮含量总体比0~10 cm土层高。2)对于10~20 cm土层，在N₀水平下增施磷肥，随着磷肥施用量的增加，微生物量氮含量逐渐增加，但差异并不显著；在N₂水平下施加磷肥，各施磷处理都与不施磷处理的差异达显著水平，随磷肥的添加呈先增加后降低趋势，说明施磷促进10~20 cm土层微生物量氮的积累，但施肥过量反而不利于微生物量氮的增加。3)对于20~30 cm土层，在各施氮水平的基础上增施磷肥，各施磷处理与不施磷处理之间差异都未达显著水平。4)比较同一磷水平下各施氮梯度可知：0~10 cm土层在不施磷的条件下增施氮肥，微生物量氮含量呈下降趋势但差异不显著，而在施磷7.5和15 g P₂O₅/m²条件下施氮，微生物量氮含量呈上升趋势但差异不显著；10~20和20~30 cm土层在不施磷的条件下施氮肥15 g N/m²显著低于施氮0 g N/m²，说明单施氮肥并不利于土壤微生物量氮的积累，且过度施氮(15 g N/m²)反而会造成微生物量氮含量显著下降；在适当施加磷肥的基础上增施氮肥，可促进土壤微生物量氮含量的增加。总之，对于土壤微生物量氮，氮、磷配施效果强于单独施用，且施氮7.5 g N/m²更能促进土壤微生物量氮含量的增加。

Fig. 2

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图 2 各处理不同土层微生物量氮含量 Fig. 2 Microbial biomass nitrogen content at different treatment levels of nitrogen and phosphorus

由表 2可知，不同土层之间的微生物量碳、氮含量差异显著(P < 0.001)，而处理和土层之间的交互作用对土壤微生物量碳、氮含量无显著影响。

Table 2

表 2 土层及土层与处理之间的交互作用对微生物量碳、氮含量影响的方差分析 Table 2 Two-way ANOVA of soil layer and treatment on microbial carbon and nitrogen 微生物量碳 微生物量氮 F P F P 土层 11.862 < 0.001 9.800 < 0.001 处理*土层 1.102 0.364 1.235 0.245 注：差异显著性用黑体标注(P < 0.05)。

表 2 土层及土层与处理之间的交互作用对微生物量碳、氮含量影响的方差分析 Table 2 Two-way ANOVA of soil layer and treatment on microbial carbon and nitrogen

由表 3可知，施加氮肥对0~10、10~20和20~30 cm土层微生物量碳含量的影响均未达到显著水平；磷肥对0~10 cm土层微生物量碳含量的影响接近显著(P=0.071)，而对10~20和20~30 cm土层无影响；氮、磷之间的交互作用对0~10 cm土层微生物量碳含量的影响达显著水平(P < 0.05)；不同比例的氮、磷处理对0~10 cm土层微生物量碳含量的影响达显著水平(P=0.006)。单施氮、磷肥还是氮、磷之间的互作对于0~10 cm土层微生物量氮含量的影响均未达显著水平；施加磷肥对于10~20 cm土层微生物量氮含量的影响达显著水平(P < 0.05)，且氮、磷肥交互作用显著(P < 0.05);施加氮肥显著影响20~30 cm土层微生物量氮含量；不同比例的氮磷肥处理显著影响10~20和20~30 cm土层的微生物量氮含量(P=0.005，P=0.048)。

Table 3

表 3 氮磷及其互作对不同层土壤微生物量碳含量和微生物量氮含量影响的方差分析 Table 3 Two-way ANOVA of nitrogen and phosphate on microbial biomass carbon and nitrogen contents in different soil layers 微生物量碳含量 微生物量氮含量 0~10 cm 10~20 cm 20~30 cm 0~10 cm 10~20 cm 20~30 cm F P F P F P F P F P F P 氮肥(N) 0.379 0.689 0.686 0.511 0.310 0.736 1.517 0.242 1.179 0.321 6.878 0.004 磷肥(P) 2.715 0.071 0.852 0.477 0.222 0.880 1.131 0.359 2.969 0.048 0.771 0.521 氮肥*磷肥(N*P) 3.086 0.025 0.332 0.914 1.091 0.394 0.506 0.797 4.249 0.003 0.292 0.935 处理(treatment) 3.197 0.006 0.629 0.792 0.845 0.599 1.102 0.396 3.278 0.005 2.147 0.048 注：氮肥各水平之间的比较指每个氮水平下16个重复的平均值之间的比较，磷肥各水平间比较指每个磷水平下12个重复的平均值之间的比较。

表 3 氮磷及其互作对不同层土壤微生物量碳含量和微生物量氮含量影响的方差分析 Table 3 Two-way ANOVA of nitrogen and phosphate on microbial biomass carbon and nitrogen contents in different soil layers

微生物量碳在很大程度上取决于土壤微生物的数量，在土壤全碳中虽然只占很小比例，但却是其中最为活跃的部分，能够反映土壤养分的生物有效性，对土壤施肥非常敏感，是评价微生物活性的重要指标。本研究结果显示，氮磷添加主要影响0~10 cm土层微生物量碳的含量，而对10~20和20~30 cm土层微生物量碳含量几乎无影响(图 1)。可能原因是，随着土层加深，高寒草原土层温度降低和营养物质供应会减少，因而在该植被下0~10 cm土层微生物量均大于10~20和20~30 cm土层，这与蔡琼和丁贵杰^[35]对马尾松林下土壤微生物量的研究结果一致。由图 1可知，在不施磷肥的条件下单施氮肥，0~10 cm土层微生物量碳含量降低，且施氮15 g N/m²相对于不施氮显著降低60.4%，这与裴雪霞等^[36]研究结果类似。原因可能有：1)施加氮肥导致土壤pH降低，而pH较低的土壤微生物量也较低^[37]；本试验中0~10 cm土层微生物量碳含量与pH之间存在显著的正相关关系。2)施加氮肥加剧土壤有机质的退化，并抑制微生物菌群的活力^[38-39]。但是，在施磷30 g P₂O₅/m²的基础上添加氮肥，微生物量碳含量显著增加，施氮7.5 g N/m²和15 g N/m²相对于不施氮分别增加86.5%和172.8%。这与Gallardo、Hart、Insam等^{[17, 40-41]}的研究类似。另外，在施加氮肥15 g/m²的基础上增施磷肥，微生物量碳含量显著增加，施磷30 g P₂O₅/m²相对于不施磷增加279.9%。原因可能是：1)磷肥的施加促进植物根系及部分微生物对无机氮的同化与吸收，从而减缓pH的下降；2)磷肥添加增加根系生物量及根系分泌物，促进微生物的生长，同时也为微生物提供充足的碳源^[42-43]；本试验中0~10 cm土层微生物量碳含量与全磷和速效磷存在极显著的正相关关系。

土壤微生物量氮作为土壤氮素的重要储备，对土壤氮素循环和转化有着重要的调节功能。虽然土壤微生物量低于植物的吸氮量，但是由于微生物量氮周转率高，因此矿化氮主要来自于土壤微生物量氮^[44-45]。本研究结果表明，施加氮磷肥主要影响10~20和20~30 cm土层的微生物量氮，其含量变化范围分别是52.83~88.94和38.07~75.31 mg/kg(图 2)。可能原因是：1)该地区特有的气候环境条件形成“过云就是雨”的气候现象，且施肥主要选择在傍晚临降雨之前，造成氮肥随雨水向更深的土层迁移^[46-47]。2)高寒草原土壤温度普遍较低，死亡根系未来得及被微生物分解，从而造成深层土壤有机物的累积，为较深层土壤微生物提供食物和碳源。对于10~20和20~30 cm土层，在未施磷肥的基础上单施氮肥，其微生物量氮含量下降，且过量施氮(15 g N/m²)与不施氮处理之间差异显著，原因可能是单施氮肥造成土壤pH的下降，从而不利于微生物的生长与繁殖；在本试验中，10~20 cm土层全氮、全磷与pH之间存在显著的负相关关系，说明施加氮肥造成pH值的下降可能是微生物量氮下降的主要原因。当施氮15 g N/m²时，施加磷肥显著增加10~20 cm土层微生物量氮含量，且施磷7.5、15和30 g P₂O₅/m²相对于不施磷微生物量氮含量分别增加68.35%、53.78%和38.86%。本试验研究表明，氮磷配施时土壤微生物量氮明显高于单施氮、磷肥，说明配施条件下有较多的氮素通过同化作用转入到微生物体内，而被暂时固定，相应地减少了氨挥发和硝态氮的淋失，这对调节土壤氮素供应，提高土壤氮素利用率，保护大气环境都具有重要的意义。但本文中关于施加氮磷肥主要影响0~10 cm微生物量碳含量和10~20 cm土层微生物量氮含量，其原因有待进一步的研究。

本实验研究发现，单施高量氮肥土壤微生物量碳、氮含量显著下降，而单施磷肥对土壤微生物量碳氮含量几乎无影响，这两种施肥方式均不能有效改善高寒草原土壤环境。适量的氮、磷配施能够保持或提高土壤中微生物量碳氮含量，因此，在未来全球氮沉降的大背景下，选择科学合理的氮、磷配施方案，以利于土壤生态环境的改善，增加土壤中的微生物量，从而减少经济和工业发展给脆弱的西藏高寒草原带来的负面影响，这对维持藏北高寒草原的可持续发展和生态系统的平衡具有重要意义。