随着全球人口老龄化的趋势日益明显和饮食结构的变化，心血管疾病发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，已经发展成为威胁生命健康的头号杀手.心肌肥厚，尤其是左心室肥厚是高血压、心瓣膜病、心肌梗死等许多心血管疾病共同的病理过程.持续的心肌肥厚伴随着心肌纤维化增加、心肌细胞凋亡增加、钙离子浓度失衡，最终可导致心力衰竭等多种疾病.因此，预防和治疗心肌肥厚具有十分重要的理论价值和实际意义.

一氧化氮(NO)是体内的一种信号分子，由细胞内L-精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)作用下产生.NO具有舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖和血小板聚集等作用，在调节血压和血管稳态方面发挥重要的生理作用^[1].L-Arg不足、内源性NOS抑制剂产生增多、NOS酶的辅助因子缺乏和氧化应激都会直接或间接地造成NO的生物利用度的下降，引起血管内皮功能失常，进而引发多种心血管疾病^[2].另一方面，在一些病理条件(如心肌缺血再灌注、动脉粥样硬化等)下，NO可以和超氧阴离子(O₂^·-)反应生成氧化性更强的过氧亚硝基(ONOO^-)，进而导致蛋白质、核酸及脂质膜发生氧化损伤，引起细胞凋亡^[3-4].因此，NO在心血管疾病中发挥着“双刃剑”的作用.

已有研究表明，天然抗氧化剂可以清除缺血再灌注损伤时产生的氧自由基，调节和促进NO自由基产生，保护心肌组织，防止缺血再灌注损伤^[4-8].因此我们推测，将天然抗氧化剂和NOS的底物L-Arg进行合理配比，可以达到减少氧化应激，提高NOS酶的活性和NO的生物利用度，保护心血管系统的效果.经过大量试验，我们研制了一种以山楂提取物、知母提取物、虾青素和L-Arg为主要成分的配方ZPF1，发现它能够在多个模型中减少氧化应激，增加NO水平^[9]，但其是否具有心血管保护作用还不清楚.因此，本文在细胞和动物模型中研究这种NO和天然抗氧化剂组合配方ZPF1对心肌肥厚的保护作用.

1 材料和方法 1.1 实验材料

大鼠心肌细胞H9C2购自北京协和细胞资源中心，SPF级8~10周龄雄性C57BL6小鼠购自北京维通利华公司.L-Arg、硝普钠(SNP)、苯肾上腺素(PE)、异丙肾上腺素(ISO)、MTT和DCFH-DA荧光探针购自Sigma公司.SERCA2a和GADPH抗体购自Abcam公司.蛋白酶抑制剂混合物购自Roche公司.山楂提取物、知母提取物和虾青素购自西安清乐生物科技有限公司.将这些天然抗氧化剂和L-Arg按照一定比例混合组成ZPF1，溶于超纯水中，以灌胃的方式喂食动物.其他试剂为国产分析纯，购自北京国药集团.

1.2 实验方法 1.2.1 细胞活力测定

取对数生长期的H9C2细胞，以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔平底培养板上，在37 ℃，5%CO₂中培养24 h，再使用不同浓度的L-Arg、SNP和ZPF1处理24 h，然后每孔加入MTT(终质量浓度为0.5 g/L)，继续培养3 h，弃去培养液，每孔加入200 μL DMSO，振荡1.5 min，在酶标板上测定吸光度值(OD值)，测定波长492 nm.每组设8个平行孔，空白对照组不接种细胞.细胞活力按下列公式计算：细胞活力(%)=(实验组各孔OD值-空白对照OD值)/(正常对照组OD值-空白对照OD值)，对照组细胞活力为100%.

1.2.2 细胞内活性氧水平的检测

以5×10⁴个/孔的密度接种于24孔平底培养板上，继续培养24 h，再用50 μmol/L PE或其他药物处理48 h.更换新鲜培养基，并将DCFH-DA探针(终浓度5 μmol/L)加入孔中，继续在培养箱中孵育30 min后，PBS清洗3遍.用0.4 mol/L NaOH溶液裂解细胞，将细胞裂解液取200 μL加入到96孔黑色微孔板中，使用多功能酶标仪测定DCF荧光强度，同时采用BCA法测定蛋白浓度，用二者的比值表示相对密度蛋白的荧光值.每组设4个平行孔.

1.2.3 动物实验

将体重和年龄无明显区别的C57BL/6雄性小鼠随机分为3组，每组5~6只小鼠.对照组每天腹腔注射生理盐水，模型组按照每天20 mg/kg的剂量腹腔注射ISO，连续注射14 d，给药组除每天注射同样剂量的ISO外，同时每天给予ZPF1，剂量为100 mg/kg.实验完成后，利用首都医科大学Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统对小鼠进行超声检测，数值取3个心动周期的平均值.所有动物处死前称量体重，断颈处死后迅速取出心脏和肺脏，称重.心脏组织在液氮里速冻后存放于-80 ℃冰箱，用于后续分析.

1.2.4 Western blot检测

对照或药物处理后的细胞样品或心肌组织样品用预冷的RIPA缓冲液(含蛋白酶抑制剂)裂解或高速匀浆处理后，12 000 g离心15 min，收集上清液用于蛋白表达检测.在使用BCA法测定蛋白质浓度后，将相同量的蛋白与电泳缓冲液混合，沸水浴5 min.按常规方法上样、电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭，按照1∶1 000的比例加入一抗，4 ℃过夜.TBS-T缓冲液清洗后，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，在TBS-T缓冲液清洗后曝光显影.

1.3 数据统计

实验数据以平均值±标准误值(mean±SE)表示，2组和多组之间的差异采用SPSS 17.0软件包进行单因素方差分析(one way ANOVA)，使用Tukey Post Hoc检验.P<0.05被认为具有统计学意义.

2 结果 2.1 NO及ZPF1对细胞活力的影响

为研究NO对心肌细胞活力的影响，我们使用不同浓度的NO供体SNP和L-Arg处理H9C2心肌细胞24 h.SNP在溶液中迅速产生高浓度NO，可能会O₂^·-结合诱导细胞凋亡.我们发现，SNP对H9C2细胞活性有明显的抑制作用，尤其在较高浓度(图 1(a)).作为NOS的底物，L-Arg能够以温和的速度持续产生低浓度NO，保护细胞.在低浓度时，L-Arg对细胞活力没有明显影响，而在100 μmol/L时可显著提高细胞活力(图 1(a)).我们也研究了ZPF1对细胞活力的影响，发现在150和200 μg/mL的浓度时，ZPF1处理24 h能够提高50%～250%的细胞活力 (图 1(b)).

2.2 NO及ZPF1对细胞活性氧的影响

为进一步探讨NO和ZPF1在心肌细胞中的保护作用，我们检测了对照和PE处理细胞中的活性氧水平.和对照细胞相比，5 μmol/L SNP、100 μmol/L L-Arg和200 μg/mL ZPF1单独处理48 h对细胞内活性氧水平没有明显影响.50 μmol/L PE处理48 h后细胞内活性氧增加～40%，ZPF1(200 μg/mL)同时处理48 h可以显著降低细胞活性氧水平，而SNP和L-Arg对PE诱导的细胞活性氧增加没有明显影响(图 2)，说明ZPE1减少PE诱导的活性氧主要是通过它的抗氧化剂成分而不是L-Arg.

2.3 ZPF1对ISO诱导的心肌肥大和功能失常的影响

我们发现，ISO注射组心脏重量和心脏体重质量比(mg/g)均明显高于对照组(图 3(a)、图 3(b))，同时，ISO注射组中的肺脏体重和肺脏体重质量比(mg/g)也明显高于对照组(图 3(c)、图 3(d)).这些结果证实ISO诱导的心肌肥厚模型建立成功.我们发现，给小鼠喂食ZPF1可以显著降低心脏/肺脏重量以及心脏/肺脏体重质量比(图 3(a)、图 3(b))，表明ZPF1可以显著抑制ISO诱导的心肌肥厚.

心肌肥厚往往伴随着心脏功能的下降.造模结束后，ISO注射组小鼠的射血分数由对照组的67.5±0.88下降至48.3±0.36，而ISO+ZPF1组小鼠的射血分数为59.4±0.98，显著高于ISO注射组(图 3(e)).这些数据表明，注射ISO可以引起心脏功能失常，而补充ZPF1可以抑制这一过程，提高心脏功能.

2.4 ZPF1对SERCA2a蛋白表达的影响

肌浆网钙泵-2a(Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase-2a，SERCA2a)是心肌细胞中参与Ca²⁺调节的重要蛋白，在心肌细胞钙循环和心肌的收缩/舒张周期中起着关键作用^[10].大量研究显示，在人和小鼠的心力衰竭模型中SERCA2a的蛋白表达和活性有明显降低^[11].为研究ZPF1的心肌保护作用机制，我们分别在细胞和动物模型中检测了SECA2a的蛋白表达.实验发现，50 μmol/L PE处理48 h引起SERCA2a蛋白表达显著下降(图 4(a)).虽然添加200 μg/mL ZPF1不影响正常细胞的SERCA2a蛋白表达，但可以显著抑制PE对SERCA2a的下调(图 4(a)).同样，ISO注射组小鼠心脏组织中SERCA2a蛋白表达和对照组明显降低，而这种下降可以被ZPF1所抑制.这些结果说明，ZPF1的心脏保护作用与维持SERCA2a的蛋白表达水平有关.

3 讨论

在心血管系统中，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化L-Arg产生的NO能够调节血压、扩张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖.和野生型小鼠相比，心脏特异性过表达eNOS可以显著改善冠脉结扎引起的心肌肥厚和心室功能下降^[12].而给大鼠注射eNOS的抑制剂L-NAME则可以导致高血压和心肌肥厚^[13].近年来, 大量研究证实，来自血管内皮的NO产生减少则是加剧心肌肥厚和心力衰竭发生发展的重要因素^[14-15].因此，恢复和增强eNOS活性，提高eNOS来源的NO含量，在心衰患者的治疗和预防方面具有重要的研究和临床价值.

心肌肥厚和心力衰竭引起心血管NO含量下降的主要原因包括：首先，心肌肥厚过程中产生了大量的氧自由基，特别是O₂^·-，可以和NO发生快速反应生成ONOO^{-[3, 16]}.其次，氧化应激可以氧化eNOS的辅酶BH4，导致eNOS发生解耦联，产生NO的活力下降^[17].最后，心衰过程中，不对称二甲基精氨酸产生增高，能够竞争性地抑制NOS酶的活性^[18].虽然SNP和硝酸甘油等NO供体能够短时间内释放NO，舒张血管，调节冠状动脉血流，改善心脏功能，但长期使用可能会引起可溶性鸟苷酸环化酶sGC发生巯基亚硝基化修饰而失活^[19]，使NO丧失心血管保护功能.我们发现，SNP在较低浓度就可以抑制心肌细胞活力，较高浓度的L-Arg对心肌细胞的活力有促进作用.这说明直接使用NO供体可能对正常的心肌功能不利，而通过添加L-Arg增加内源性NO的产生，可以提高心肌细胞活力.L-Arg对心衰病人的保护作用在临床实验中也得到一定的证实^[20].但L-Arg对心脏肥厚的抑制作用还有一些争论.例如，最近的一项研究发现，在ISO诱导心肌肥厚的模型中，补充L-Arg可以轻微地提高心脏功能，但不能抑制心肌肥厚和心肌纤维化^[21]，说明单纯补充L-Arg的心血管保护作用还不明显.

一些天然抗氧化剂也具有重要的心血管保护功能.例如，山楂提取物可以治疗早期充血性心衰，心绞痛，心律不齐和高血压^[22-23].山楂提取物还可以通过抑制磷酸二酯酶的活性，增加冠状动脉血液流量和心脏的血液输出，减少心脏的耗氧量^[24]，保护心肌免受缺血再灌注损伤.虾青素是存在于鱼、虾和藻类中的一种强抗氧化剂，其抗氧化活性为β-胡萝卜素的10倍、维生素E的100倍^[25].食用富含虾青素的食物能够抑制O₂^·-的产生，提高NO含量，降低血压，改善心血管功能^[26].知母宁是一类含有4个酚羟基的多酚类物质，能够有效清除大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中的氧自由基，减少心肌细胞凋亡，提高心脏功能^[6-7].此外，抗氧化剂还可以通过清除氧自由基抑制NOS的解耦连，提高其活力.基于这些研究成果，我们将一氧化氮合酶底物L-Arg和山楂提取物、知母宁山楂提取物和虾青素等天然抗氧化剂进行合理搭配，能够在多种细胞体系和动物模型中清除氧自由基，增加NO产量，从而发挥协同保护作用^[9].在免疫系统中，抗氧化剂和NO能够协同调节T淋巴细胞、NK细胞的活性以及细胞因子分泌，提高机体免疫力^[27-29].在本研究中，我们发现这种新型配方不仅显著提高心肌细胞活力，降低苯肾上腺素PE诱导的活性氧，还可以在动物模型中显著抑制ISO引起的心肌肥厚和心脏功能失常，说明将天然抗氧化剂和提高内源性NO产量结合起来，可以作为预防和治疗心肌肥厚和心力衰竭的一种新途径.

终上所述，我们发展了一种基于NO和天然抗氧化剂的新配方，可以促进大鼠心肌细胞的增殖，有效降低肥厚心肌细胞的活性氧水平，抑制ISO诱导的心肌肥厚，改善心脏功能，可作为一种潜在的保健食品，用于改善心血管健康.