2016, Vol. 33 
乳清蛋白的主要成分包括β-乳球蛋白(β-Lg)、α-乳白蛋白(α-LA)、血清白蛋白等，其中β-Lg是引起过敏的主要成分，而α-LA起着半乳糖转移酶的调节作用，能催化葡萄糖在乳房细胞中合成乳糖，且因其含有高比例的色氨酸和半胱氨酸，而对人体有很大益处.
近年来，乳品掺假等乳品质量安全事件频频曝光，直接导致消费者对乳品行业的不信任，给企业和国家都带来了不良影响.目前检测牛奶中掺入其他物质的方法报道了许多[1]，而且其中一些方法可以同时检测多种掺加成分，精确度较高.但大多数方法比较复杂，很难掌握，而且对于仪器的要求比较高.这些缺点使得许多方法难以推广，不能保证日常生活中的牛奶质量，所以亟需发展一种简单快速的乳品检测方法.免疫学方法因其快速灵敏等特点已广泛应用在食品工业中，大多数的免疫学方法目前可通过使用不同牛奶蛋白的不同类型的多克隆抗血清[2]来检测掺假的牛奶中使用的β-CN、γ-CN、β-Lg或其他物质，尽管这些方法还不能解决相近物种之间乳蛋白不好区分的问题，比如牛乳和水牛乳.Summer等[3]制备了κ-CN的单克隆抗体，但没有报道κ-CN的ELISA检测.Hurley等[4]还通过测量牛乳IgG含量建立了一种间接竞争ELISA方法来检测牛乳的掺假.
目前用于检测α-LA的方法有高效液相色谱法[5]、聚丙烯酰胺凝胶电泳结合激光扫描、SDS-PAGE电泳、毛细管电泳[6]等.本文建立了一种检测牛乳α-LA的方法，通过使用竞争ELISA技术定性和定量检测牛乳α-LA，可用于测定牛乳α-LA含量和检测牛乳掺入羊乳、水牛乳或其他品种乳中.
1 材料与方法 1.1 实验材料牛α-乳白蛋白标准品(α-LA)和弗氏完全和不完全佐剂，购自美国sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)，购自华美生物工程公司；酶标羊抗兔IgG-HRP和标准兔IgG，购自北京博奥森生物技术有限责任公司；鲜牛乳购于当地农场；免疫兔子为3月龄体质量2.0～2.5kg，雄性健康新西兰大白兔，无前期病史，购自第四军医大学.
1.2 主要仪器设备AKTÄ purifier 10纯化系统、亲和色谱柱(HiTrap rProtein A FF) 和Hoefer miniVE垂直电泳槽，美国通用电气公司；凝胶成像系统，南京捷达科技公司；酶标仪(MK-3)，荷兰Thermo公司；酶标板，华美生物科工程公司.
1.3 实验方法 1.3.1 免疫以标准牛α-LA与等量弗氏佐剂充分乳化后，采用背部皮下多点注射法免疫新西兰大白兔.首次免疫采用弗氏不完全佐剂，加强免疫采用弗氏完全佐剂.5次免疫效价达到要求后，进行颈动脉放血，室温静置1h后2000r/min离心分离血清加防腐剂，存放于-20℃冰箱[7].
1.3.2 抗体分离纯化及特性检测将血清抗体采用饱和硫酸铵50%、40%和33%分级沉淀后，透析微滤经亲和色谱柱(HiTrap rProtein A FF)分离纯化，收集目标峰得到抗α-LA特异性IgG抗体.
使用SDS-PAGE电泳检测抗体纯度，并采用间接ELISA法对抗体进行效价和特异性检测.具体步骤为：稀释抗原包被酶标板，加待测稀释抗体反应，加酶标二抗反应后用TMB显色，测定450nm的吸光度值.抗原最佳包被浓度和酶标二抗最佳工作浓度分别采用间接ELISA法和直接ELISA法确定.
1.3.3 牛α-LA的HRP酶标记采用过碘酸钠氧化法标记抗原[8]：取2.5mg HRP溶于1mL蒸馏水，再加入新鲜配制的0.1mol/LNaIO4溶液0.2mL，室温避光搅拌20min，反应液置于4℃下，1mmol/L(pH 4.4)的醋酸钠缓冲液中透析过夜，再加入0.2mol/L(pH 9.5)碳酸盐缓冲液使pH值上升至9.0～9.5，立即加入1mL抗原.室温避光搅拌2h后，加入0.1mL，4mg/mL的NaBH4溶液终止反应，形成稳定的酶标抗原.
酶标抗原的分离纯化[9]：将上述标记物用0.15mol/L(pH7.4)PBS透析，再用等体积饱和硫酸铵盐析沉淀离心，沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次后，溶于0.15mol/L(pH7.4)PBS透析过夜去除铵离子，将所得酶标物分装冰冻保存.
按下式分别计算酶标抗原的含量和结合率等：
HRP浓度(mg/mL)=A403×0.42×稀释倍数,
α-LA标记浓度(mg/mL)=(A280－A403×0.3)×0.46×稀释倍数,
(注：根据α-LA 标曲回归方程计算A280=1.0时，α-LA≈0.46 mg)
标记率=A403/ A280×100%,
结合率=(结合物中酶浓度×结合物体积)/加入的酶质量×100%.
通过SDS-PAGE电泳检测酶标抗原的纯度，用HRP和标准牛α-LA作对照，检测酶标抗原标记及分离效果.
酶标抗原效价的测定：采用直接ELISA法，酶标抗原与相应抗体进行反应，阳性值(P)＞0.2且阳性值与阴性值之比(P/N)＞2.1的酶标抗原的最大稀释浓度为其效价.
1.3.4 竞争ELISA实验1) 将特异性抗体用碳酸盐缓冲液(0.2mol/L碳酸钠和0.2mol/L碳酸氢钠，pH 9.6)稀释至最佳包被浓度，以100μL/孔加入96孔酶标板，置4℃冰箱过夜[10].
2) 用洗涤液PBST洗板4次，每次3min.然后加入1%BSA封闭液100μL/孔，置37℃孵育1h，洗板.
3) 将酶标抗原及待测样品分别稀释至最佳工作浓度等体积混合后，以100μL/孔加入96孔酶标板，置37℃孵育2h，洗板.
4) 加入TMB溶液显色，100μL/孔，室温避光反应20min.加入50μL/孔，2mol/L的硫酸终止反应.测定各孔在波长450nm处的吸光度值.
1.3.5 SDS-PAGE检测α-LA含量取鲜牛乳及3种市售的牛乳制品(UHT灭菌乳、婴幼儿配方乳粉、D90乳清蛋白粉)，以GBT 5413.2—1997[11]方法为依据检测α-LA含量.α-LA标准品5mg·mL-1，乳粉样品20mg·mL-1溶解，液态乳离心脱脂处理.将处理后标准品和样品与样品缓冲液等体积混合后点样10μL进行SDS-PAGE.以α-LA标准品总灰度面积为标准计算样品总蛋白含量，根据α-LA条带积分比率计算样品中α-LA含量.再采用竞争ELISA检测α-LA含量，液态乳1∶10稀释，乳粉2mg·mL-1溶解.并与SDS-PAGE所测α-LA含量进行比较.
2 结果与讨论 2.1 抗体特性检测 2.1.1 抗体效价检测采用间接ELISA法[12]测得抗原最佳包被浓度为1.5625μg·mL-1.采用直接ELISA法测得酶标二抗最佳工作浓度为1∶2000.抗体蛋白浓度采用Bradford法测得为0.574mg·mL-1.采用间接ELISA法检测血清抗体效价达1∶80920.
2.1.2 抗体特异性检测anti-α-LA IgG 的交叉反应通过间接ELISA检测，分别将4种蛋白质抗原：α-乳白蛋白、大豆分离蛋白粉、三聚氰胺和明胶以10×2n倍比稀释后包被酶标板，IgG抗体按最佳工作稀释度(1∶80)与包被的蛋白质抗原反应，洗涤后加入酶标羊抗兔IgG-HRP(1∶2000)，孵育后加入底物溶液显色，检测A450nm值，结果见图 1.结果表明anti-α-LA IgG的特异性较高，与其他3种蛋白基本没有交叉反应.本试验建立的ELISA体系特异性良好，可以应用于进一步试验.
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| 图 1 Anti-α-LA IgG与3种蛋白抗原的交叉反应 Fig. 1 Cross-actions of anti-α-LA IgG with three kinds of antigens | |
一般要求酶标记物酶结合率不小于20%[13]，较好的酶标物的标记率在30%～60%之间[14].实验结果表明，当HRP浓度为0.24mg/mL，α-LA标记浓度为0.315mg/mL时，酶结合率为33.53%，酶标记率较高为66.67%.
酶标抗原的效价的检测可用于判定酶标抗原的酶活性和抗原的免疫原性，是进行竞争ELISA实验的决定因素，结果显示酶标抗原效价为1∶640.
SDS-PAGE电泳检测酶标抗原纯度如图 2所示，HRP-α-LA跑出单条带，表明纯度较高.
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| 图 2 SDS-PAGE电泳检测酶标抗原纯度 Fig. 2 SDS-PAGE electrophoretogram of HRP-α-LA | |
抗体最佳包被浓度和酶标抗原最佳工作浓度的确定是进行竞争ELISA法检测的前提.本实验采用棋盘滴定法确定二者条件.测定结果为抗体最佳稀释浓度1∶80，酶标抗原最佳工作浓度为1∶20.
2.3.2 建立标准曲线将标准α-LA按起始浓度为1000μg/mL进行2n倍稀释，抗体包被浓度取1∶80进行竞争ELISA反应，以稀释倍数为横坐标，波长450nm处的吸光值为纵坐标，建立标准曲线如图 3所示.
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| 图 3 竞争ELISA方法检测α-LA标准曲线 Fig. 3 Standard curve of α-LA measurement using competitive ELISA | |
由图 3可以看出，当标准α-LA浓度分别在1.95～500μg/mL时，A450nm值与α-LA的浓度成良好的线性关系，可以用于α-LA在此浓度间的快速检测.
2.3.3 确定样品最佳工作浓度将抗α-LA特异性抗体按最佳工作浓度包被，再将脱脂牛乳分别以2n倍比稀释(起始浓度为1∶10)与1∶10(取最佳工作浓度的2倍)的酶标抗原(HRP-α-LA)等体积混合，按100uL/孔加入酶标板与抗体竞争结合，用TMB显色，具体操作流程按竞争ELISA法进行，酶标抗原与水等体积混合作为阳性对照.分别以牛乳稀释度为横坐标，A450nm值为纵坐标，建立关系图 4.
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| 图 4 脱脂乳的竞争浓度 Fig. 4 Effect of skim milk content on OD450nm value | |
根据A450nm值，选择P/N即阳性对照组与实验组比值最大的脱脂乳稀释度为最佳浓度.从图 4中可以看出，当牛乳的稀释度从1∶10增加到1∶320时，P/N值呈现递减趋势.当脱脂牛乳的稀释度在1∶10时，P/N值相对最大.因此选择脱脂牛乳的竞争浓度为1∶10.
2.3.4 精密度、回收率及准确性试验配制系列浓度的α-LA标准溶液，竞争ELISA法测定A450nm值.用工作曲线计算对应的α-LA测定值，计算回收率和变异系数(CV)，如表 1所示.结果表明，回收率在86.00%～117.50%之间，变异系数在2.63%～4.28%之间.
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表 1 竞争ELISA试验的重复性(n=3) Table 1 Repetition assay of competitive-ELISA(n=3) |
如图 5，对4种样品进行SDS-PAGE，以α-LA标准品为对照，根据α-LA条带积分比率计算4种样品α-LA含量，并与竞争ELISA法所测含量进行比较.
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| 图 5 SDS-PAGE图谱 Fig. 5 SDS-PAGE patterns of 4 samples | |
表 2结果表明所建立竞争ELISA检测结果与电泳法所测结果相差不大，可以用来检测各种牛乳制品中α-LA含量.
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表 2 SDS-PAGE与竞争ELISA检测结果比较 Table 2 Result comparison between SDS-PAGE and competitive-ELISA(n=3) |
制备了抗α-LA的多克隆抗体，所制备的多抗特异性好，与其他3种物质无明显交叉反应.采用过碘酸钠氧化法制备了辣根过氧化物酶标记的α-LA抗原，制备的酶标抗原标记率较高，纯度较高.并在此基础上建立了定量检测α-LA的竞争ELISA法.确定了多抗的最佳包被稀释度为1∶256，酶标抗原工作浓度为1∶20，实验的回收率在86.00%～117.50%之间，变异系数在2.63%～4.28%之间，小于5%.国标检测乳清蛋白方法(GBT 5413.2—1997)电泳分析方法繁琐费时，对电泳条带分析以表明各种蛋白质的相对分布为主，对乳清蛋白的定量难以精确.比较而言，本实验建立的方法对α-LA定量更方便准确，重复性和灵敏度较高，并且cELISA法操作简单快速，能同时对多个样本进行测定，可广泛推广于乳品蛋白的检测.
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