贝叶经是古印度佛教徒在经过处理的棕榈科叶片上用笔刷书写或铁笔刻写的一种佛教经典，梵语称为pattra，汉语音译为“贝多罗”，简称“贝叶”。早期从印度传入中国的这类文书主要为佛教典籍，因此习惯称为“贝叶经”。贝叶经目前在我国西藏、云南、杭州等地均有收藏，且以西藏所保管的贝叶经数量居多。调查结果显示，仅布达拉宫、罗布林卡、哲蚌寺3处地点就保存了近300函、1 000多部经典论著，内含若干失传已久的梵文原典，具有重要的历史文化价值^[1]。然而，由于自然老化和外界环境因素的作用，保存下来的古代贝叶经已出现不同程度的破损和劣化^[2]，保护修复工作迫在眉睫。近年来，随着贝叶经文物保护工作的日趋深入，已有研究对贝叶经的老化特征^[3]和墨迹脱落的机理^[4]进行了探讨。然而，有关植物种属鉴别的研究仍然缺乏。不同植物来源的叶片结构相差很大，鉴别贝叶植物种属有利于快速明确基体结构及性能，为保护修复工作提供参考。

早在唐代，先民就已熟知制作贝叶经的源植物。杜宝《大业拾遗记》^[5]中“新翻经本从外国来，用贝多树叶，形似枇杷叶而厚大”，记载了贝叶经由贝多树叶制成。段成式《酉阳杂俎》^[6]则记载有“多罗娑力叉贝多、多梨婆力叉贝多、部婆力叉贝多”等3种不同的贝多树叶可以作为贝叶经的原材料。古人所述贝多树即棕榈科植物。棕榈科属于单子叶植物纲，包括181属、约2 600种。其中大部分分布于热带及亚热带地区。在众多棕榈科植物中，古人制作贝叶经的材料主要是贝叶棕(Corypha umbraculifera)和糖棕(Borassus flabellifer)2种植物叶片^[7]。

贝叶经由叶片直接加工而成，工序相对简单，植物学特征得以保存，为鉴别源植物种属提供了依据。贝叶棕和糖棕叶片解剖学结构属间差异明显。Sharma等^[8]对比贝叶棕和糖棕叶片横切面发现，前者具有异面叶结构，后者则兼具异面叶和等面叶2种特征。Freeman^[9]利用显微观察手段发现二者叶脉形态具有明显差异：糖棕属叶片纵脉和横脉在交接处呈直角，形成砖墙状结构；贝叶棕属的横脉从中脉向叶尖分叉，以一定的角度穿过纵脉。

植物解剖学方法尽管可以有效区分上述2种植物，但过程繁琐，样品需求量高，难以满足珍贵文物的检测需求。棕榈叶含有纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质、脂类等成分。Sruyawanshi等^[10]的研究表明，棕榈叶的化学成分中含有大量木质素和纤维素，包括少量二氧化硅和金属成分。另外，植物叶片通常含有多种次生代谢产物，如生物碱类、黄酮类、萜类、固醇类等。这些代谢物受基因调控，在种属和器官间具有明显的特异性，与植物生长发育存在联系。通过探索贝叶棕和糖棕的成分特征，有望对二者进行区分。

热裂解气相色谱质谱联用技术(Pyrolysis gas-chromatography/mass-spectrometry, Py-GC/MS)目前广泛应用于有机高分子文物样品的检测中，具有用量少、速度快、精确度高等优势，可将有机大分子裂解为小分子，便于探究样品分子层面的信息^[11]。该方法目前被广泛应用于古代纸张植物纤维来源的鉴别研究，但尚未见于贝叶经源植物分析^[12-14]。本研究首次结合Py-GC/MS与多元统计分析方法，重点研究贝叶棕和糖棕叶片成分区别，并尝试提供一种新方法区分贝叶经植物属间的差异，为今后鉴定古代贝叶经文物提供参考。

1 材料与方法

传统工艺具有延续性，在一定程度上保留了古代制作技术。本研究以此为标准模拟古代贝叶制作流程，获得一批贝叶棕和糖棕标准样品。利用Py-GC/MS进行分析检测，寻找贝叶棕和糖棕标准样品的区分依据并设置检验组进行验证。检验组由2批新制作(存放时间不超过1年)的贝叶棕贝叶和自然老化10年的贝叶棕贝叶组成。

1.1 实验材料 1.1.1 模拟实验样品

贝叶制作的传统工艺存在地区差异，尤其是在选择叶片的策略上。在印度南部和斯里兰卡，通常选择棕榈树冠中半展开的棕榈叶片^[15-16]；在云南省西双版纳，10年以上的贝叶棕是最佳选择。由于植物发育的次生代谢过程原理复杂，不同成熟度可能对结果产生影响。基于此，在中国科学院西双版纳热带植物园内，我们随机选取具有不同成熟度的糖棕和贝叶棕各3株。分别编号为糖棕组(T) T1、T2和T3；贝叶棕组(B)B1、B2和B3。

在选择的6棵棕榈植株中，糖棕T1、T3和贝叶棕B1、B3树干周长相似，叶片宽大，平均尺寸差异较小，树龄应较为接近。相比之下，T2和B2的树干直径较小，叶片宽度普遍较窄，手感幼嫩，颜色偏浅，树龄相对较小，成熟度低。贝叶棕组和糖棕组最终各选取2棵成熟度相似和1棵成熟度较低的植株进行实验，比较成熟度相似植株叶片不同个体成分是否存在差异；选择成熟度较低的植株叶片探究其对叶片成分所产生的影响。每棵树上均随机截取3片棕榈片进行实验(表 1)。

贝叶制作模拟实验在西双版纳民族风情园内进行。模拟实验方法使用园内传承的古法工艺。为探索加工前后化合物的变化情况，同时设置空白对照组，比较新鲜叶片及处理后叶片成分的区别。

新鲜叶片到成品的转变历经了以下程序：

1) 捆扎。对贝叶棕、糖棕叶片进行编号后，将叶片各扎成1捆；

2) 加液。将水(地下水)和发酵7 d的淘米水分别倒入2口容积约3 L的铁锅内。每锅加入约675 mL淘米水，开始加热；

3) 加酸消煮。待锅内液体沸腾后往2口锅内分别加入贝叶棕和糖棕叶片，随后加入柠檬(Citrus limon)、酸叶胶藤(Urceola rosea)。蒸煮3 h，其间保持炉火旺盛；

4) 清洗。把蒸煮好的贝叶捞出，解捆，并在水流下用毛巾擦洗至光滑；

5) 晾晒。将擦洗干净的成品晾干至表面呈淡绿色或发白；

6) 贮存。制作好的贝叶成品通常以卷轴的形式储存，待需要时取出。

1.1.2 空白对照组

对照组分别设置贝叶棕和糖棕各1组，各选择1片贝叶棕B1植株新鲜叶片和糖棕T1植株新鲜叶片与相同植株上经过处理后的叶片进行比较。

1.1.3 贝叶经检验组

选择2个不同批次制作的贝叶工艺品，源植物均为贝叶棕。第1批次贝叶(P1)工艺品表面偏黄(图 1(a))，第2批次(P2)偏绿(图 1(b))。所选的2批贝叶均为近期制作，存放时间不超过1年。2个批次贝叶各随机挑选3片进行实验。第1批次3个样品编号分别是1-1, 1-2, 1-3，第2批次3个样品编号分别是2-1, 2-2, 2-3。

由于老化作用可能改变贝叶的化学成分组成和物理性能，影响2种棕榈科植物来源判断，本研究将西双版纳民族风情园内存放10年的贝叶经工艺品(D1)纳入研究范围。经过一段时间自然老化的贝叶经颜色较暗(图 1(c))，储存地点同样位于民族风情园内。经园内技艺传承人介绍，10年前贝叶经工艺品的制作工艺与近期不存在明显区别。最后选取3片上述贝叶进行实验，分别编号A-1, A-2, A-3(表 1)。制作完成的贝叶经将存放于储藏柜中。储存条件非人为调控，与当地气候相似。

1.2 实验方法

测试无预处理步骤，直接截取贝叶空白处重约0.5 mg样品，放入样品杯中。将样品杯转移至500 ℃的热解器(PY3030D，Frontierlab)中进行热解。气相色谱/质谱仪型号为Shimadz QP2030 NX。气相色谱进样口温度为300 ℃，采用分流进样技术，分流比设置为20 ∶1。使用30 m×0.25 mm i.d. Ultra ALLOY+-5毛细管色谱柱(膜厚0.25 μm)。色谱柱升温程序设置在40 ℃下首先保持3 min，然后以10 ℃/min的速度将炉温升至350 ℃，继续保持5 min。氦气作为载气，以1 mL/min的速度稳定流动。使用质谱仪对分离出的化学物质进行评估。质谱仪设置为电子轰击离子源(EI)模式，电离能量为70 eV。质谱获取范围在m/z 45~550。使用NIST 2017数据库并对照相关文献[17-20]进行质谱鉴别。与数据库质谱图相似度超过80 % 的物质可被认为是正确判断。对峰面积进行归一化处理，占总峰面积百分比大于0.1 % 的峰被纳入研究范围。

1.3 主成分分析法(principal component analysis，PCA)

PCA是一种多元统计分析方法，通过对多个变量进行线性变换，从而筛选出较少的重要变量。具有相同特征的数据集，主成分得分相似。贝叶棕和糖棕木质素的种类受成熟度、生长环境、老化等因素影响，组成多样。然而，结果显示所有样品中均存在10种共有的木质素单体，这些物质应是2种棕榈叶片木质素组成的主要成分。将总离子流色谱图(TIC)中选定峰面积进行归一化处理后，使用IBM SPSS Statistics(v26.0.0) 软件并采用Z-score值法标准化数据后进行PCA。最后采用Origin Pro 2021(v9.8.0.200)绘图软件进行制图。

2 结果与讨论 2.1 贝叶棕和糖棕的成分区别

大量呋喃类、吡喃类、环戊烯酮类等产物在保留时间5.00~14.00 min出现。此类物质主要来源于叶片中的多糖类物质，包括纤维素、半纤维素、果胶和淀粉等。多糖类物质在植物中广泛存在，是植物进行正常生命活动的基础，其由葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成，多数为植物界所共有。

木质素由3种结构单元组成，分别为对-羟基苯基木质素单体(H型)、愈创木基单体(G型)和紫丁香基单体(S型)。木质素经热裂解作用后特定C—C键发生断裂，生成多种酚类化合物。这些简单的酚类化合物仍可在一定程度上还原木质素特征。经过处理的贝叶棕和糖棕叶片裂解结果显示主要木质素单体类型为G型和S型。除2种主要单体类型外，贝叶棕和糖棕还伴随少量H型单体出现。

贝叶棕与糖棕样品中分别检测出19种(H型2种，G型6种，S型11种)与24种(H型4种，G型9种，S型11种)木质素单体(图 2，表 2)。种类差异不仅在种属间存在，同种样品也有所区别，具有低成熟度的叶片中木质素种类数量普遍较少。前人研究发现^[21]，木质素组成受多种条件影响，尤其是成熟度，但总体上同类型样品的木质素组成仍存在一定稳定性。贝叶棕组含共有木质素14种，糖棕15种。对比贝叶棕和糖棕，两者存在10个共有木质素种类，其中G型3种，S型7种。这些木质素在所有样品中均有出现，应是贝叶棕和糖棕木质素中重要的单体类型。

贝叶棕组样品共检测出9种脂肪酸单体(C₁₀~C₁₈)，其中不饱和脂肪酸3种(C_18∶1，C_18∶2，C_18∶3)，饱和脂肪酸6种(C_10∶0，C_12∶0，C_14∶0，C_16∶0，C_17∶0，C_18∶0)。糖棕组样品所检测出的脂肪酸种类与贝叶棕组一致。2种棕榈叶均检测出棕榈酸(C_16∶0)，其在棕榈科植物果皮中广泛存在^[22]。同时，C_14∶0，C_16∶0，C_18∶0这3种脂肪酸组合稳定存在于所有贝叶棕和糖棕中，应与叶片中脂质组成的分布特征有关。

多种长链烷烃及烯烃，长链醇、长链酯在贝叶棕和糖棕中均被检出。这类物质通常是蜡质的特征裂解产物。植物叶片由角质层、表皮、叶肉组织构成，其中角质层的主要成分为蜡质。结果中出现的多个蜡类特征产物，说明经过处理的叶片仍保留有角质层成分。

在保留时间为20.00~40.00 min区间内，大量萜类化合物被检出，以三萜类化合物为主。三萜类物质属于植物的次生代谢物，受植物生理活动影响，二属间存在差别。贝叶棕和糖棕中共检测出化合物18种。其中二者共有化合物9种(1~2, 4~9, 12)，显示出相近的代谢活动特征(图 3，表 3)。值得注意的是，所有糖棕叶片均检出2种羽扇豆烷型三萜类化合物：羽扇豆醇乙酸酯、3β-羽扇豆乙酸酯，以及何帕烷型三萜类化合物。然而，上述3种物质并未在贝叶棕样品中发现。B1和B3贝叶棕在保留时间分别为32.40和33.63 min时检出环桉烯醇衍生物及其异构体，而T1和T3糖棕则在保留时间为32.70 min时检出环鸦片甾烯醇。环桉烯醇衍生物和环鸦片甾烯醇化合物难以在B2和T2中被检出，应与其具有较低的成熟度有关。2种萜类主要在叶片生长后期出现，应为代谢末端产物。因此针对较成熟的棕榈叶，或可通过判断是否存在环桉烯醇衍生物和环鸦片甾烯醇进行种属区分。此外，羽扇豆烷型及何帕烷型三萜类化合物稳定存在于所有糖棕叶片，可作为糖棕的生物标志物。

检验组测试结果显示, 第1批贝叶的3个样品和自然老化贝叶样品中的A-3成功检出环桉烯醇衍生物(图 4(a))，可判断为贝叶棕，与实际相符；第2批贝叶除2-1未成功检出外，其余2个样品均含有环桉烯醇衍生物(图 4(b))。检验组所有贝叶均未检测出糖棕特征化合物。以上结果证明检验组贝叶化合物成分与贝叶棕成分相似，尤其是特征三萜类化合物，通过对比这些物质可初步对贝叶经植物进行属间判别。然而，贝叶棕特征化合物并未在所有样品中检出，对于不含环桉烯醇衍生物的贝叶经，若仅凭未出现糖棕特征化合物进而判断其植物来源，结论欠缺说服力。针对以上情况，需寻找其他方法进行辅助判别。

2.2 贝叶棕和糖棕木质素组成差异

2种棕榈科植物叶片存在特征化合物，但部分物质如环桉烯醇衍生物和环鸦片甾烯醇化合物无法稳定存在于所有样品中，为鉴别工作造成一定困难。Py-GC/MS结果显示贝叶棕组和糖棕组所有样品均含有10种木质素单体(表 2)，表明这些类型木质素具有较强的稳定性。通过比较2种棕榈叶木质素的相对含量特征，或可辅助鉴别贝叶种属。

将总离子图谱中所有峰面积归一化后，选择贝叶棕和糖棕10个共有木质素单体的相对峰面积作为变量进行PCA。分析所有贝叶棕组及糖棕组样品共29个(表 1)，结果生成3个主成分，累积方差解释率达75.5 %。2种棕榈叶片木质素组成存在差异。第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)得分图中(图 5(a))，贝叶棕和糖棕可分为2组。贝叶棕组大部分数据在PC2上得分为负数，而糖棕组数据主要分布于上方。载荷图可体现变量与主成分的关系，反映了原始变量对主成分的贡献程度。PC1和PC2载荷图(图 5(b))显示，S6和S7在PC1上载荷值最高，是影响贝叶棕分布特征的主要因素，贝叶棕叶片在S6和S7上可能拥有更高的含量。相反在PC2上，G1和S8拥有最高载荷值，糖棕叶片在这2个变量上的含量可能具有相对较高的比例。

在前期区分贝叶棕和糖棕化合物组成差异时，并未在A-1、A-2、2-1这3个样品中检测出贝叶棕和糖棕的特征化合物，无法对其进行有效鉴别。然而PCA结果显示三者与贝叶棕组得分距离相近，与糖棕组得分差异明显。结果表明这3个样品具有与贝叶棕相似的木质素组成特征，因此可判断其植物来源为贝叶棕。此外，A-1和A-2为自然老化样品，经过10年老化后木质素特征仍与近期制作的贝叶经相似，说明叶片木质素组成具有一定稳定性，这也为未来利用木质素组成特征鉴别古代贝叶经种属提供了一种可能。

3 加工前后成分组成变化

空白对照组中BL1和BL2分析结果显示加工后的样品Dl-α-生育酚和D-柠檬烯及角鲨烯含量明显减少(图 6，表 4)。Dl-α-生育酚广泛存在于植物的叶绿素中，叶绿素受热易分解^[23]，其含量变化应与叶绿素的减少有关。D-柠檬烯属于二萜类化合物，具有较强的挥发性，角鲨烯是由6个异戊二烯组成的直链多萜类物质，存在多个双键，易氧化。制作过程中蒸煮环节为叶片提供长时间高温酸性条件，持续性的加热行为可能造成D-柠檬烯和角鲨烯在一定程度上流失或氧化。数字所示化合物见表 4。

BL1共检测出木质素18种，所有经过加工的叶片木质素种类均可在新鲜叶片中被检出。贝叶棕特征化合物环桉烯醇衍生物仍然存在于新鲜叶片中；处理过的T1样品共检测出20种木质素，这些物质同样存在于BL2中。除木质素单体外，羽扇豆烷型和环鸦片甾烯醇型化合物被检出，这些物质可被认为是糖棕的特征化合物。以上结果显示，经过处理的样品成分组成并未出现较大变动，三萜类物质的稳定存在也暗示特征化合物在高温酸性环境下具有较强的稳定性。

由贝叶棕组和糖棕组PCA得分图(图 5(a))可看出BL1和BL2均落于各自组别的置信区间范围内，并分别与处理后的样品B1和T1距离相近。空白对照组得分与处理后样品相似，证明处理过程未使木质素含量发生较大变动。结合木质素种类和含量在加工前后仍保持良好的一致性，可认为2种棕榈树叶片的木质素在高温酸性条件下仍具有较强的稳定性。

4 结论

Py-GC/MS分析结果显示，经过加工的糖棕存在3种稳定的特征化合物，分别为2种羽扇豆烷型三萜类化合物：羽扇豆醇乙酸酯、3β-羽扇豆乙酸酯和何帕-22(29)-烯-3-酮。环桉烯醇衍生物仅在贝叶棕中检出，环鸦片甾烯醇化合物仅在糖棕中出现。通过判断特征化合物组合，可初步区分部分近期制作及自然老化的贝叶经工艺品的植物来源。对稳定出现于所有样品中的10种木质素单体含量进行PCA，结果显示贝叶棕组和糖棕组存在区别，未检出特征化合物的贝叶经在PCA结果中均落于正确组别。PCA分析方法结合寻找植物特征化合物，可使贝叶经植物种属鉴别得到良好效果。本研究利用热裂解气质联用法(Py-GC/MS)结合多元统计分析手段，成功对多种贝叶经工艺品源植物进行区分，为鉴别古代贝叶经的植物来源提供了新的思路。