2026, Vol. 56
2. 中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东 青岛 266100
海洋是生命起源的地方, 约占地球表面积的70%，从浅海潮间带到万米深渊海沟，从热带珊瑚礁到极地冰海，多样独特的生存环境滋养着海绵、珊瑚及微生物繁衍生息，孕育了极其丰富的生物资源[1-3]。其中，海洋真菌作为海洋微生物的重要成员，近年来分离获得的新化合物总量呈逐年递增趋势[4]。这些活性分子既为药物研发提供了丰富的先导化合物资源，也印证了海洋真菌在创新药物分子发现中的核心潜力[5]。
Trichoderma属真菌为海洋真菌的核心类群之一，主要分布于藻类、沉积物、海绵及软珊瑚等载体中[6-7]。迄今为止，已经从海洋源Trichoderma属真菌中发现了445个新的代谢产物，包括萜类、甾体类、聚酮类、肽类、生物碱类等，其中半数以上具有抗病毒、抗菌、细胞毒、抗炎、促血管生成等活性[8]。例如，南海深海沉积物来源的Trichoderma sp. SCSIOW21菌株可产生7种harziane型二萜类化合物，其中5种为首次报道的新化合物，部分化合物对脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)激活的小鼠单核巨噬细胞(Mouse mononuclear macrophage leukemia cells, RAW264.7)一氧化氮释放具有较强抑制活性且无明显细胞毒性，凸显了深海Trichoderma属真菌在抗炎药物研发领域的应用潜力[9]。本研究以1株西北太平洋水深5 km沉积物来源的真菌Trichoderma virens为研究对象，综合运用硅胶色谱、半制备高效液相色谱等分离方法分离鉴定得到8个萜类化合物和2个生物碱类化合物，包括4个Cadinane型倍半萜rhinomilisin B (1)、heptelidic acid chlorohydrin (2)、(5aS, 6R, 9S, 9aS)-9-hydroxy-6-isopropyl-9-(hydroxymethyl)-1, 3, 5a, 6, 7, 8, 9, 9a-octahydro-1-oxobenzoxepine-4-carboxylic acid (3)、trichocadinin A (4)，1个Harziane型二萜harzianone A (5)，2个Carotane型倍半萜CAF-603 (6)、trichocarotin M (7)，2个含硫的Diketopiperazine型生物碱(3S, 6R)-6-(para-hydroxybenzyl)-1, 4-dimethyl-3, 6-bis(methylthio)piperazine-2, 5-dione (8)、didehydrobisdethiobis(methylthio)gliotoxin (9)及1个其他倍半萜ethyl hydroheptelidate (10)。这10个化合物均为首次从西北太平洋5 km深海沉积物来源Trichoderma virens中分离获得。化合物1—10的结构如图 1所示，并对这些化合物进行斑马鱼促血管生成活性测试。测试结果显示, 化合物1—7及9具有一定的促血管生成活性，为开发防治心血管疾病的创新药物提供更多的先导化合物，进一步丰富和完善了海洋来源真菌次级代谢产物的研究。
|
图 1 化合物1—10的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of compounds 1—10 |
RE100-S型旋转蒸发仪(DLAB公司)；YJ/CJ系列超净工作台(苏信环境科技有限公司)；SPX型恒温培养箱(宁波东南仪器有限公司)；LDZY-50KBS型高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；中压液相色谱(天津博纳杰艾尔科技有限公司)；柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)；柱层析ODS(北京金欧亚科技发展有限公司)；Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；色谱柱(YMC-Pack C8，250 mm×10 mm，5 μm，YMC-Pack C18，250 mm×10 mm，5 μm，YMC有限公司)；Bruker-DRX 400型核磁共振仪(TMS为内标，美国Bruker公司)；斑马鱼养殖饲养设备(北京爱生科技公司)；Forma 3111型水套式CO2培养箱(美国Forma公司)；IX73型奥林巴斯倒置显微镜、SZX16型奥林巴斯显微镜及DP2-BSW图像采集系统(日本Olympus公司)；乙腈(色谱纯，美国ACS公司)；色谱纯二甲基亚砜(DMSO试剂，Sigma公司)；色谱甲醇、其他有机试剂如甲醇、二氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯(天津科密欧化学试剂有限公司)，纯净水(娃哈哈集团有限公司)。
1.2 菌株的来源实验菌株分离自西北太平洋水深约5 km的海底沉积物样品，分离培养基为酵母膏蛋白胨葡萄糖海水培养基(Yeast extract peptone glucose marine agar, YPGM)固体培养基。该菌株的基因组DNA处理及内转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)测序工作由青岛睿博兴科生物技术有限公司完成。测序完成后，将所得的序列信息在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库上进行比对，结合该菌株的生长形貌和ITS序列鉴定结果，将该菌株鉴定为Trichoderma virens。目前该菌株通过甘油保种方式冷冻保存于中国海洋大学化学化工学院环境分析化学实验室。
1.3 菌株的培养将菌株Trichoderma virens于YPGM固体培养基中复苏3 d，将复苏后的菌落挑取转移至装有300 mL马铃薯葡萄糖液体培养基(Potato dextrose broth，PDB)培养基的1 000 mL锥形瓶中，发酵体积为40 L，一共发酵了134瓶，且每瓶300 mL PDB培养基中均接入4块同等大小的菌落，确保各瓶初始菌体密度一致，于恒温28 ℃条件下，静置培养28 d。PDB培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、海水1 000 mL。
1.4 次级代谢产物的提取与分离将发酵液用300目纱绢分离菌丝体和滤液，滤液用等体积乙酸乙酯萃取4次，菌丝体用植物粉碎机破碎，浸泡在甲醇中，辅以超声提取4次。经高效液相色谱和薄层色谱分析，两部分粗浸膏的主产物相似，故将萃取液合并后浓缩得到46 g粗浸膏。粗浸膏经减压柱层析(拌样硅胶为100~200目，填料硅胶为200~300目)初步分离，先后经过石油醚-丙酮(体积比80∶1—0∶1)和二氯甲烷-甲醇(体积比为15∶1—0∶1)体系进行梯度洗脱，共得到7个粗组分(Crude fraction, Fr.)，编号为Fr.1—7。将Fr.3进行硅胶柱层析(拌样硅胶为100~200目，填料硅胶为300~400目)，流动相为石油醚∶丙酮(体积比40∶1—0∶1)进行梯度洗脱，共得到9个二级部位(Fr.3-1—3-9)。Fr.3-5通过半制备高效液相色谱柱，流动相为50%甲醇-水体系得到化合物1(22.7 mg, tR=75 min)和2(23.6 mg, tR=40 min)。Fr.3-7通过半制备高效液相色谱柱, 流动相为45%乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液体系，从中分离得到化合物3(6.3 mg, tR=70 min)。Fr.3-8通过半制备高效液相色谱柱，流动相为35%乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液体系，从中分离得到化合物4(8.4 mg, tR=43 min)、5(2.8 mg, tR=58 min)、6(32.3 mg, tR=28 min)。Fr.3-9通过半制备高效液相色谱柱，流动相为30%乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液体系，从中分离得到化合物7(2 mg, tR=63 min)。将Fr.4和Fr.5合并进行硅胶柱层析(拌样硅胶为100~200目，填料为300~400目正相硅胶)，流动相为石油醚∶丙酮(25∶1—0∶1)进行梯度洗脱，共得到5个二级部位(Fr.45-1—Fr.45-5)。Fr.45-2通过半制备高效液相色谱柱，流动相为30%乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液体系，从中分离得到化合物8(5.9 mg, tR=53 min)。Fr.45-3通过半制备高效液相色谱柱，流动相为20%乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液体系，从中分离得到化合物9(8.3 mg, tR=25 min)及化合物10(2.2 mg, tR=58 min)。
1.5 化合物生物活性测试使用血管荧光标记的转基因斑马鱼(CZ62品系)作为实验动物，对正常发育至受精后24 h(24 hours post fertilization, 24 hpf)的胚胎，使用1 mg/mL的链霉蛋白酶E溶液除去胚胎膜，移入24孔板里，设置空白对照组(养鱼水)、模型组(PTK787 0.25 μg/mL)和样品处理组(PTK787 0.25 μg/mL+样品25 μmol/L)，每组10条斑马鱼，并设置2重复，加养鱼水至2 mL后，置于(28±0.5)℃恒温光照培养箱让胚胎继续发育。48 hpf时，麻醉斑马鱼，在荧光倒置显微镜下拍摄斑马鱼节间血管荧光情况。利用Image-Pro Plus软件测量斑马鱼的节间血管长度，利用GraphPad Prism 10.0软件对结果进行统计，采用one-way ANOVA分析，统计结果用mean+SEM表示，P＜0.05表明差异具有统计学意义。
2 结果与讨论 2.1 化合物结构鉴定化合物1 无色油状物，分子式C15H23ClO6, ESI-MS给出m/z 357.1[M+Na]+, [α]D20=+41.0(c 3.00, MeOH), UV(MeOH)λmax(lgε): 219(4.23) nm; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 6.05(1H, d, J=10.8 Hz, H-4), 4.28(2H, s, H-3), 4.07(1H, d, J=12.0 Hz, H-15a), 3.91(1H, d, J=12.0 Hz, H-15b), 2.90(1H, dd, J=10.8, 10.8 Hz, H-5), 2.75(1H, d, J=11.6 Hz, H-6), 2.40(1H, dt, J=12.0, 3.6 Hz, H-8a), 1.68(1H, m, H-11), 1.66(1H, m, H-9a), 1.44(1H, dt, J=12.0, 3.6 Hz, H-8b), 1.42(1H, m, H-10), 1.21(1H, m, H-9b), 0.90(3H, d, J=6.6 Hz, H-12), 0.79(3H, d, J=6.6 Hz, H-13);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 173.9(C-14), 168.4(C-1), 143.8(C-4), 134.1(C-2), 71.6(C-7), 59.2(C-6), 55.4(C-3), 49.1(C-15), 45.8(C-10), 40.1(C-5), 34.8(C-8), 27.8(C-11), 21.5(C-12), 20.1(C-9), 15.6(C-13)。以上核磁数据与文献[10]所报道的基本一致，因此确定化合物1为rhinomilisin B。
化合物2 棕色油状物，分子式C15H21ClO5, ESI-MS给出m/z 317.1[M+H]+, [α]D20=+3.4(c 1.00, MeOH), UV(MeOH)λmax(lgε): 215(3.90) nm, IR(KBr)νmax: 3 450, 1 720 cm-1; 1H NMR(400 MHz, CDCl3, δH): 7.30(1H, d, J=10.8 Hz, H-12), 5.06(2H, s, H-3), 4.78(1H, d, J=12.1 Hz, H-7a), 3.77(1H, d, J=12.2 Hz, H-7b), 3.54(1H, d, J=12.1 Hz, H-5), 2.54(1H, dt, J=12.0, 6.0 Hz, H-11), 2.44(1H, dt, J=13.1, 3.3 Hz, H-8a), 2.08(1H, qt, J=6.9, 4.5 Hz, H-13), 1.78(1H, dq, J=14.1, 3.8, 3.4 Hz, H-9a), 1.50(1H, bt, H-10), 1.30(1H, m, H-9b), 1.25(1H, m, H-8b), 0.97(3H, d, J=6.8 Hz, H-15), 0.89(3H, d, J=6.8 Hz, H-14);13C NMR(101 MHz, CDCl3, δC): 172.6(C-4), 169.7(C-1), 148.1(C-12), 128.7(C-2), 73.3(C-6), 61.4(C-3), 54.5(C-5), 48.7(C-10), 46.9(C-7), 39.8(C-11), 34.6(C-8), 27.5(C-13), 21.3(C-15), 21.0(C-9), 15.4(C-14)。以上核磁数据与文献[11]所报道的基本一致，因此确定化合物2为heptelidic acid chlorohydrin。
化合物3 无色油状物，分子式C15H22O6, ESI-MS给出m/z 297.1[M-H]-, [α]D20=+102.3(c 1.00, MeOH), UV(MeOH)λmax(lgε): 208(4.04) nm, IR(KBr)νmax: 3 387, 2 956, 1 750, 1 690, 1 229, 1 172, 1 010 cm-1; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 7.05(1H, d, J=4.6 Hz, H-5), 5.22(1H, d, J=14.5 Hz, H-3a), 5.01(1H, d, J=14.5 Hz, H-3b), 4.81(1H, d, J=12.5 Hz, H-14a), 3.91(1H, d, J=12.5 Hz, H-14b), 3.73(1H, d, J=12.0 Hz, H-9a), 2.61(1H, dt, J=12.0, 4.0 Hz, H-5a), 2.47(1H, td, J=13.5, 3.5 Hz, H-8a), 2.11(1H, m, H-11), 1.75(1H, dd, J=13.5, 4.0 Hz, H-7a), 1.58(1H, m, H-6), 1.35(1H, m, H-8b), 1.28(1H, dd, J=10.0, 4.5 Hz, H-7b), 0.91(3H, d, J=6.8 Hz, H-12), 0.86(3H, d, J=6.8 Hz, H-13);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 172.2(C-1), 167.3(C-10), 145.5(C-5), 129.8(C-4), 72.4(C-9), 61.3(C-3), 52.7(C-9a), 48.7(C-6), 48.2(C-14), 39.6(C-5a), 35.5(C-8), 27.5(C-11), 21.6(C-7), 21.2(C-12), 15.7(C-13)。以上核磁数据与文献[12]所报道的基本一致，因此确定化合物3为(5aS, 6R, 9S, 9aS)-9-hydroxy-6-isopropyl-9-(hydroxymethyl)-1, 3, 5a, 6, 7, 8, 9, 9a-octahydro-1-oxobenzoxepine-4-carboxylic acid。
化合物4 无色油状物，分子式C15H22O3, ESI-MS给出m/z 249.1[M-H]-, [α]D22=-164.0(c 0.22, MeOH), UV(MeOH)λmax(lgε): 217(3.98) nm, IR(KBr)νmax: 3 442, 2 959, 2 936, 2 868, 1 689, 1 647, 1 545, 1 264, 1 015, 734 cm-1; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 6.78(1H, br s, H-5), 4.95(1H, br s, H-15a), 4.79(1H, br s, H-15b), 3.81(1H, td, J=9.4, 5.8 Hz, H-2), 2.67(1H, dd, J=17.5, 5.5 Hz, H-3a), 2.30(1H, br d, J=11.5 Hz, H-9a), 2.12(1H, m, H-12), 1.97(1H, m, H-3b), 1.94(1H, m, H-9b), 1.80(1H, m, H-6), 1.80(1H, m, H-1), 1.77(1H, m, H-8a), 1.35(1H, br t, J=11.1 Hz, H-7), 1.09(1H, qd, J=12.7, 4.4 Hz, H-8b), 0.92(3H, d, J=6.9 Hz, H-14), 0.74(3H, d, J=6.9 Hz, H-13);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 167.9(C-11), 148.2(C-10), 137.5(C-5), 129.1(C-4), 106.4(C-15), 65.8(C-2), 50.4(C-1), 45.9(C-7), 45.4(C-6), 36.5(C-9), 34.4(C-3), 26.7(C-12), 26.6(C-8), 21.2(C-14), 15.0(C-13)。以上核磁数据与文献[13]所报道的基本一致，因此确定化合物4为trichocadinin A。
化合物5 无色油状物，分子式C20H30O2, ESI-MS给出m/z 303.2[M+H]+, [α]D20=+72.1(c 0.42, MeOH), UV(MeOH)λmax(lgε): 259(3.98) nm, IR(KBr)νmax: 3 400, 2 932, 2 361, 1 669, 1 441, 1 260, 1 150, 1 027 cm-1; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 3.82(1H, d, J=8.5 Hz, H-4), 2.54(1H, q, J=8.0 Hz, H-5), 2.46(1H, d, J=16.5 Hz, H-12a), 2.36—2.27(1H, m, H-3a), 2.36—2.27(1H, m, H-8a), 2.33(1H, d, J=16.5 Hz, H-12b), 2.02(3H, s, H-20), 2.00(1H, t, J=10.5 Hz, H-14), 1.90—1.82(1H, m, H-8b), 1.90—1.82(1H, m, H-15a), 1.76(1H, dd, J=14.0, 7.0 Hz, H-7a), 1.58—1.53(1H, m, H-2), 1.58—1.53(1H, m, H-15b), 1.47(3H, s, H-19), 1.45(1H, d, J=15.0 Hz, H-3b), 1.15(1H, t, J=13.0 Hz, H-7b), 1.05(3H, d, J=7.7 Hz, H-18), 0.80(3H, s, H-17), 0.79(3H, s, H-16);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 198.0(C-11), 150.6(C-10), 145.7(C-9), 71.7(C-4), 59.6(C-12), 51.3(C-14), 49.6(C-6), 45.1(C-1), 40.9(C-2), 40.1(C-5), 39.9(C-3), 39.8(C-13), 28.9(C-8), 28.8(C-7), 28.1(C-15), 24.9(C-16), 22.7(C-17), 22.0(C-19), 21.4(C-20), 21.1(C-18)。以上核磁数据与文献[14]所报道的基本一致，因此确定化合物5为harzianone A。
化合物6 无色油状物，分子式C15H26O2, ESI-MS给出m/z 239.2[M+H]+, [α]D25=-26.2(c 0.50, MeOH), UV(MeOH)无明显特征吸收，仅见末端吸收，IR(KBr)νmax: 3 620, 3 520 cm-1; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 5.42(1H, m, H-9), 3.86(1H, dd, J=7.1, 1.8 Hz, H-3), 2.42(1H, br s, 4-OH), 2.08(1H, br s, 3-OH), 1.99(2H, m, H-7), 1.93(1H, dd, J=14.0, 8.8 Hz, H-10b), 1.78(1H, dd, J=14.0, 8.8 Hz, H-10a), 1.73(3H, br s, H-14), 1.66(1H, sep, J=6.9 Hz, H-11), 1.57(1H, dd, J=14.0, 1.8 Hz, H-2b), 1.54(2H, m, H-6), 1.39(1H, dd, J=14.0, 7.1 Hz, H-2a), 1.32(1H, dd, J=7.9, 5.0 Hz, H-5), 1.19(3H, s, H-15), 0.86(3H, d, J=6.9 Hz, H-12), 0.80(3H, d, J=6.9 Hz, H-13);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 138.8(C-8), 122.8(C-9), 83.1(C-4), 70.7(C-3), 58.2(C-5), 50.4(C-2), 42.9(C-10), 42.2(C-1), 35.1(C-11), 34.7(C-7), 27.8(C-14), 21.4(C-15), 21.3(C-6), 18.2(C-13), 17.7(C-12)。以上核磁数据与文献[15]所报道的基本一致，因此确定化合物6为CAF-603。
化合物7 无色蜡状固体，分子式C15H26O3, ESI-MS给出m/z 299.2 [M+HCOO]-, [α]D25=+85.9(c 0.71, MeOH); 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 5.50(1H, br d, J=8.2 Hz, H-9), 3.87(1H, t, J=4.5 Hz, H-3), 3.76(2H, s, H-14), 3.60(1H, br s, 4-OH), 2.10(1H, dd, J=14.3, 3.2 Hz, H-7b), 1.99(1H, dd, J=14.4, 8.9 Hz, H-10b), 1.81(1H, m, overlap, H-7a), 1.81(1H, m, overlap, H-10a), 1.69(1H, m, H-11), 1.49(2H, m, overlap, H-2), 1.49(1H, m, overlap, H-6b), 1.36(1H, m, H-5), 1.30(1H, m, H-6a), 0.92(3H, s, H-15), 0.87(3H, d, J=6.7 Hz, H-13), 0.81(3H, d, J=6.9 Hz, H-12);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 142.7(C-8), 121.4(C-9), 82.7(C-4), 70.4(C-3), 66.9(C-14), 57.8(C-5), 50.0(C-2), 42.1(C-10), 41.7(C-1), 34.7(C-11), 30.0(C-7), 21.2(C-6), 21.0(C-15), 17.8(C-12), 17.2(C-13)。以上核磁数据与文献[16]所报道的基本一致，因此确定化合物7为trichocarotin M。
化合物8 无色油状物，分子式C15H20N2O3S2, ESI-MS给出m/z 363.1 [M+Na]+, [α]D22=+11.0(c 0.10, MeOH), IR(KBr)νmax: 3 422, 2 917, 1 647, 1 614, 1 516, 1 434, 1 388, 1 269, 1 244, 734 cm-1; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 7.02(1H, d, J=8.2 Hz, H-8), 7.02(1H, d, J=8.2 Hz, H-4), 6.72(1H, d, J=8.3 Hz, H-5), 6.72(1H, d, J=8.3 Hz, H-7), 4.61(1H, s, H-2), 3.63(1H, d, J=14.2 Hz, H-10a), 3.26(3H, s, H-15), 3.06(1H, d, J=14.2 Hz, H-10b), 3.04(3H, s, H-14), 1.88(3H, s, H-12), 1.41(3H, s, H-13);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 164.2(C-3), 163.6(C-1), 156.7(C-6), 131.2(C-8), 131.2(C-4), 124.8(C-9), 115.3(C-5, 7), 75.7(C-11), 64.2(C-2), 40.2(C-10), 32.8(C-14), 30.1(C-15), 12.1(C-13), 11.9(C-12)。以上核磁数据与文献[17]所报道的基本一致，因此确定化合物8为(3S, 6R)-6-(para-hydroxybenzyl)-1, 4-dimethyl-3, 6-bis(methylthio)piperazine-2, 5-dione。
化合物9 无色针状晶体，分子式C15H18N2O4S2, ESI-MS给出m/z 355.1[M+H]+, [α]D22=-150(c 0.50, MeOH); 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 10.33(1H, s, OH), 7.19(1H, d, J=7.3 Hz, H-7), 6.93(1H, d, J=8.2 Hz, H-8), 6.85(1H, d, J=7.3 Hz, H-6), 4.58(1H, d, J=12.2 Hz, H-15b), 3.99(1H, d, J=12.2 Hz, H-15a), 3.57(1H, d, J=16.7 Hz, H-10b), 3.49(1H, d, J=16.7 Hz, H-10a), 3.07(3H, s, H-14), 2.29(3H, s, H-12), 2.20(3H, s, H-13);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δc): 164.8(C-3), 164.7(C-1), 146.1(C-5), 132.2(C-4), 129.0(C-7), 127.8(C-9), 117.3(C-6), 116.8(C-8), 72.6(C-2), 71.2(C-11), 63.2(C-15), 39.9(C-10), 28.5(C-14), 14.3(C-13), 13.0(C-12)。以上核磁数据与文献[18]所报道的基本一致，因此确定化合物9为didehydrobisdethiobis(methylthio)gliotoxin。
化合物10 黄色油状物，分子式C17H26O6, ESI-MS给出m/z 327.2[M+H]+, [α]D25=+40.0(c 0.10, MeOH); 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6, δH): 6.84(1H, d, J=10.9 Hz, H-4), 4.92(1H, s, 7-OH), 4.61(1H, d, J=9.6 Hz, H-14b), 4.26(1H, d, J=11.7 Hz, H-3b), 4.15(2H, q, J=7.2 Hz, H-16), 4.14(1H, d, J=11.6 Hz, H-3a), 4.07(1H, d, J=9.6 Hz, H-14a), 2.71(1H, m, H-5), 2.16(1H, d, J=11.1 Hz, H-6), 2.08(1H, m, H-8b), 1.77(1H, m, H-9b), 1.73(1H, m, H-11), 1.72(1H, m, H-8a), 1.39(1H, m, H-10), 1.31(1H, m, H-9a), 1.28(3H, t, J=7.2 Hz, H-17), 0.94(3H, d, J=6.8 Hz, H-12), 0.75(3H, d, J=6.8 Hz, H-13);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6, δC): 176.7(C-15), 168.3(C-1), 143.1(C-4), 134.0(C-2), 75.0(C-7), 74.6(C-14), 62.0(C-16), 55.4(C-3), 52.2(C-6), 44.6(C-10), 44.3(C-5), 31.9(C-8), 27.8(C-11), 21.5(C-9), 21.4(C-12), 15.4(C-13), 15.0(C-17)。以上核磁数据与文献[19]所报道的基本一致，因此确定化合物10为ethyl hydroheptelidate。
2.2 促血管生成活性测试结果测试10个化合物对斑马鱼节间血管的生长促进作用。各组斑马鱼节间血管代表性图片及化合物1—10对斑马鱼节间血管长度的影响如图 2所示。空白对照组斑马鱼节间血管生长正常，而模型组节间血管的生长明显被抑制(P＜0.000 1)。与模型组相比，化合物1—6及9处理的斑马鱼节间血管长度在浓度为25 μmol/L时显著增加(P＜0.000 1)，化合物7处理的斑马鱼节间血管长度在浓度为25 μmol/L时较为明显增加(P＜0.01)，化合物8和10无任何变化。因此化合物1—7及9具有良好的促血管生成活性。从化合物官能团上取代基的角度来看，对比化合物8与9的结构可知二者均为含硫Diketopiperazine型生物碱，之所以活性会有很大的差异，很可能是因为官能团取代基的种类、位置等不同导致的，推测出硫原子周围的取代基团(如酰基、烷基等)类型或取代位置，是影响其与血管生成相关靶点结合能力的关键因素，从而决定了化合物是否具有促血管生成活性[20]。从构型角度来看，化合物1—4同为Cadinane型倍半萜，化合物6—7同为Carotane型倍半萜，均具有促血管生成活性，可推测出同种类型的倍半萜所共有的构型特征(如环上取代基顺反构型、手性中心构型)可能是活性必需结构，之前已有研究证实手性中心构型可显著影响化合物与靶点的特异性结合，而不同取代基的引入则可能进一步微调活性强度[21]。此外，萜类骨架是促血管生成活性的核心结构基础[22]，本研究所有具有活性的萜类化合物(如Cadinane型倍半萜等)均已验证了这一结论，虽然化合物10也属于萜类化合物，但其却不具备促血管生成活性，推测原因可能是其骨架可能与上述涉及的活性萜类(如Cadinane型倍半萜等)存在显著差异，缺失了活性必需的骨架母核结构，所以才导致无法与血管生成相关靶点形成基础结合界面，也就相应的不具备促血管生成活性了。值得注意的是，深海来源的萜类化合物为适应各种各样的极端环境，往往形成独特的结构特征，而这种结构特异性使其更易呈现出新颖的生物活性特征。
|
((a)为斑马鱼节间血管荧光显微图像；(b)为节间血管长度；与空白对照组(Control)相比，####P＜0.000 1；与模型组(Model)相比，**P＜0.01为差异显著，****P＜0.000 1为差异极显著。(a) Fluorescent microscopic image of zebrafish intersegmental blood vessels; (b) Length of intersegmental blood vessels. Compared with the blank control group (Control), ####P < 0.000 1; compared with the model group (Model), **P < 0.01 indicates significant difference, and ****P < 0.000 1 indicates extremely significant difference. ) 图 2 斑马鱼促血管生成活性结果 Fig. 2 Results of pro-angiogenic activity in zebrafish |
(1) 本文通过对1株西北太平洋深海沉积物来源的真菌Trichoderma virens的次级代谢产物进行研究，从中鉴定了8个萜类化合物和2个生物碱类化合物，包括4个Cadinane型倍半萜(1—4)，1个Harziane型二萜(5)，2个Carotane型倍半萜(6—7)，2个含硫的Diketopiperazine型生物碱(8—9)及1个其他倍半萜(10), 并对化合物1—10进行斑马鱼促血管生成活性测试。测试结果显示, 25 μmol/L化合物1—7及9均有良好的促血管生成活性。
(2) 对深海沉积物来源的真菌Trichoderma virens次级代谢产物的研究报道较少，本研究不仅充实了Trichoderma属真菌次级代谢产物的结构数据库，更可为心血管疾病创新药物的研发提供多元化的先导化合物候选库，助力新型靶向药物的发现。
| [1] |
Haque N, Parveen S, Tang T T, et al. Marine natural products in Clinical Use[J]. Marine Drugs, 2022, 20(8): 528. DOI:10.3390/md20080528 (  0) |
| [2] |
马丽丽, 田新朋, 李桂菊, 等. 海洋微生物来源天然产物研究现状与态势[J]. 热带海洋学报, 2021, 40(5): 134-146. Ma L L, Tian X P, Li G J, et al. Current status and trends in research on natural products derived from marine microorganisms[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2021, 40(5): 134-146. ( 0) |
| [3] |
孔维琦, 金鑫, 刘永宏, 等. 羊栖菜共附生真菌Aspergillus sp. GXIMD 02045的次级代谢产物研究[J]. 热带海洋学报, 2025, 44(1): 154-161. Kong W Q, Jin X, Liu Y H, et al. Study on secondary metabolites of Aspergillus sp.GXIMD 02045, a symbiotic fungus of Sargassum thunbergii[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2025, 44(1): 154-161. ( 0) |
| [4] |
刘仟茜, 王茹, 蔡磊, 等. 海洋真菌Aspergillus sp. LW152抗细菌活性代谢产物研究[J]. 中国抗生素杂志, 2024, 49(6): 627-633. Liu Q X, Wang R, Cai L, et al. Study on the antibacterial active metabolites of marine fungus Aspergillus sp. LW152[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2024, 49(6): 627-633. ( 0) |
| [5] |
Jiang M, Chen S, Zhang Z, et al. Structural diversity and bioactivities of marine fungal terpenoids(2020-2024)[J]. Marine Drugs, 2025, 23(8): 300. DOI:10.3390/md23080300 ( 0) |
| [6] |
Carroll A R, Copp B R, Davis R A, et al. Marine natural products[J]. Natural Product Reports, 2023, 40(2): 275-325. DOI:10.1039/D2NP00083K ( 0) |
| [7] |
Guo Q F, Shi L, Wang X Y, et al. Structures and biological activities of secondary metabolites from the Trichoderma genus (covering 2018-2022)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2023, 71(37): 13612-13632. DOI:10.1021/acs.jafc.3c04540 ( 0) |
| [8] |
Song Y P, Ji N Y. Chemistry and biology of marine-derived Trichoderma metabolites[J]. Natural Products and Bioprospecting, 2024, 14(1): 14. DOI:10.1007/s13659-024-00433-3 ( 0) |
| [9] |
Li H, Li X L, Li X, et al. Novel harziane diterpenes from deep-sea sediment fungus Trichoderma sp. SCSIOW21 and their potential anti-inflammatory effects[J]. Marine Drugs, 2021, 19(12): 689. DOI:10.3390/md19120689 ( 0) |
| [10] |
Hu Z B, Tao Y W, Tao X Y, et al. Sesquiterpenes with phytopathogenic fungi inhibitory activities from fungus Trichoderma virens from Litchi chinensis Sonn[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(38): 10646-10652. DOI:10.1021/acs.jafc.9b04053 ( 0) |
| [11] |
Kawashima J, Ito F, Kato T, et al. Antitumor activity of heptelidic acid chlorohydrin[J]. The Journal of Antibiotics, 1994, 47(12): 1562-1563. DOI:10.7164/antibiotics.47.1562 ( 0) |
| [12] |
Lee M, Cho J Y, Lee Y G, et al. Furan, phenolic, and heptelidic acid derivatives produced by Aspergillus oryzae[J]. Food Science and Biotechnology, 2016, 25(5): 1259-1264. DOI:10.1007/s10068-016-0199-z ( 0) |
| [13] |
Shi Z, Fang S, Miao F, et al. Trichocarotins A-H and trichocadinin A, nine sesquiterpenes from the marine-alga-epiphytic fungus Trichoderma virens[J]. Bioorganic Chemistry, 2018, 81: 319-325. DOI:10.1016/j.bioorg.2018.08.027 ( 0) |
| [14] |
Zhao D L, Yang L J, Shi T, et al. Potent phytotoxic harziane diterpenes from a soft coral-derived strain of the fungus Trichoderma harzianum XS-20090075[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1): 13345. DOI:10.1038/s41598-019-49778-7 ( 0) |
| [15] |
Watanabe N, Yamagishi M, Mizutani T, et al. CAF-603:A new antifungal carotane sesquiterpene. Isolation and structure elucidation[J]. Journal of Natural Products, 2004, 53(5): 1176-1181. ( 0) |
| [16] |
Shi X S, Song Y P, Meng L H, et al. Isolation and characterization of antibacterial carotane sesquiterpenes from Artemisia argyi associated endophytic Trichoderma virens QA-8[J]. Antibiotics, 2021, 10(2): 213. DOI:10.3390/antibiotics10020213 ( 0) |
| [17] |
Shi Z, Miao F, Fang S, et al. Sulfurated diketopiperazines from an algicolous isolate of Trichoderma virens[J]. Phytochemistry Letters, 2018, 27: 101-104. DOI:10.1016/j.phytol.2018.07.005 ( 0) |
| [18] |
Sun B, Li S, Yang D Z, et al. Secondary metabolites of the endophytic fungi Trichoderma virens cultivated in potato medium and their bioactivity[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2025, 61(1): 1-5. DOI:10.1007/s10600-025-04562-0 ( 0) |
| [19] |
Qin C, Hu Z, Xiong Y, et al. A new sesquiterpene derivative from the mangrove endophytic fungus Trichoderma harzianum (Strain No. R1)[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2021, 57(2): 1-3. ( 0) |
| [20] |
张京星, 姚婷婷, 刘晶, 等. 环二肽合酶生物合成途径研究进展[J]. 有机化学, 2019, 39(2): 328-338. Zhang J X, Yao T T, Liu J, et al. Advances in the biosynthetic pathway of cyclodipeptidyl peptidase[J]. Organic Chemistry, 2019, 39(2): 328-338. ( 0) |
| [21] |
Chen Z A, Ke C Q, Zhou S Z, et al. Ten undescribed cadinane-type sesquiterpenoids from Eupatorium chinense[J]. Fitoterapia, 2021, 156: 105091. ( 0) |
| [22] |
王芳, 许平翠, 林炳锋, 等. 白芍对血管的保护作用及谱效关系研究[J]. 中国现代应用药学, 2024, 41(14): 1883-1891. Wang F, Xu P C, Lin B F, et al. Protective effects of white peony root on blood vessels and study on the spectrum-effect relationship[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2024, 41(14): 1883-1891. ( 0) |
2. Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China