2026, Vol. 56
, 2. 中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003;
3. 海南热带海洋学院水产与生命学院，海南 三亚 572022;
4. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071
海豚链球菌(Streptococcus iniae)为革兰氏阳性致病菌，属于无运动性的兼性厌氧菌，广泛分布于淡水、海水及半咸水环境中[1-2]。已有研究表明，该菌可感染虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、杂交条纹鲈(Hybrid striper)、尖吻鲈(Lates calcarifer)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、美国红鱼(Sciaenops ocellatus)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等30余种鱼类[3-12]。其传染性强、致死率高，且疾病暴发通常导致急性死亡，每年给全球水产养殖业造成数亿美元经济损失[12]；同时，该菌还可引发人类蜂窝组织炎或菌血症，已被列为新发人兽共患病原[13]。
鱼类感染海豚链球菌后的典型症状包括平衡失调、眼球突出、皮肤溃疡、腹水等[14-15]，病程进展迅速。感染过程始于海豚链球菌接触易感宿主，并在应激因素作用下启动。Cortés等[16]将海豚链球菌感染宿主的过程分为：宿主识别与黏附、入侵、逃逸与转移、增殖与宿主内存活四个阶段。在上述四个阶段中，海豚链球菌的多个毒力基因可能被诱导表达，其中黏附和入侵是海豚链球菌感染宿主的关键步骤，由多种表面蛋白协同完成[17]。如simA基因编码的M家族黏附素，帮助该菌黏附于宿主细胞表面，还能增强对吞噬杀伤的抵抗力，继而侵入上皮细胞并借助宿主细胞的胞吞作用转移至内部组织，功能与α-烯醇化酶(Alpha-enolase)存在部分重叠[17-18]。而α-烯醇化酶是一种广泛存在于多种病原微生物中表面暴露型兼职蛋白(Moonlighting protein)，除了主要功能外，还拥有一种或多种完全不同的、额外的生物学功能)[19]，由eno基因编码，作为进化保守性较高的酶类，可与纤溶酶原结合并分泌至菌体表面及胞外，通过激活血管内纤维蛋白溶解系统促进细菌在宿主组织中的增殖扩散[20]。pdi基因编码的多糖脱乙酰酶(Polysaccharide deacetylases，PDA)也能增强对溶菌酶杀伤的抗性，提升其黏附与侵袭上皮细胞的能力，并帮助逃避血液中吞噬细胞的清除，在感染初期发挥重要作用[21]。
宿主组织损伤主要与sag、cfi基因相关，其中sag基因编码的海豚链球菌溶细胞素(Hemolysin)作为分泌型细胞毒素，可损伤宿主细胞并形成孔隙[22]。cfi基因编码的CAMP因子不但可以通过协同作用裂解红细胞，参与细菌对宿主的损伤过程，还可与免疫球蛋白结合，其表达受双组分信号转导系统sivS/R调控[16]。而在抵御宿主清除与扩散的过程中，pgmA和scpI基因发挥着重要作用。葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase, PGM)由pgmA基因编码，其在维持正常的细胞壁形态、表面荚膜表达以及抵抗宿主免疫系统的清除中发挥作用[23]，细菌荚膜的疏水性细胞壁能抵抗巨噬细胞吞噬，促使其经血液快速扩散至其他组织，还可劫持单核细胞规避宿主其他防御机制，从而延长其在宿主体内的存活时间，最终侵入大脑和中枢神经系统[16, 24-26]。scpI基因编码的C5a肽酶可水解中性粒细胞的补体趋化因子，进而削弱受感染宿主抵御感染的能力，该作用本质上能使微生物避开宿主的中性粒细胞[16]。另外，海豚链球菌穿透上皮细胞后还可经鱼类吞噬细胞内化实现扩散，进而侵入其他组织或细胞并获取代谢所需营养[27-29]。值得一提的是，海豚链球菌还可进入吞噬细胞繁殖并特异性诱导这些吞噬细胞凋亡，该过程被称为“特洛伊木马效应(Trojan horse effect)”[30]。
疫苗免疫是防控海豚链球菌的有力手段，尚忠等[31]用福尔马林灭活的疫苗免疫多纹钱蝶鱼，免疫保护率超过80%。泰国研究者制备的海豚链球菌灭活疫苗在尖吻鲈中取得了77.4%的免疫保护率[32]。有研究者通过在含利福平的环境中连续传代制备尼罗罗非鱼海豚链球菌减毒活疫苗，获得高达95.05%的免疫保护率[33]。此外，利用SpyTag/SpyCatcher系统在神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)类病毒颗粒(Virus-like particles，VLPs)表面展示海豚链球菌α-烯醇化酶制备载体疫苗以及重组表达α-烯醇化酶的亚单位疫苗，均取得了有效的保护效果[34-35]。目前，日本已批准一款针对真鲷(Pagrus major) 虹彩病毒病(Iridoviral disease)和海豚链球菌病(Streptococcosis)的福尔马林灭活疫苗PISCIVACTM Irido Si[36-37]。
多纹钱蝶鱼(Selenotoca multifasciata)俗名银鼓鱼，属金钱鱼科(Scatophagidae)、钱蝶鱼属(Selenotoca)，作为兼具观赏与食用价值的高价值经济海水鱼类，其种苗繁育及规模化养殖以海南为核心，已推广至广东、广西、福建、浙江等多地[31, 38]。现有报道及本实验室前期调查发现，海豚链球菌是海南地区多纹钱蝶鱼的主要致病菌，养殖过程中海豚链球菌的感染频繁发生，给养殖带来严重困扰[31, 39]。
鉴于目前该菌感染多纹钱蝶鱼的机制研究及防控技术均较为匮乏，本研究分析了鱼类感染后的7种海豚链球菌毒力相关基因诱导情况，并利用大肠杆菌表达系统表达了α-烯醇化酶重组蛋白(Recombinant alpha-enolase，rENO)，作为亚单位疫苗进行免疫保护效果评价。本研究旨在阐明海豚链球菌致病机制，为开发鱼类病害防控技术及相关疫苗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验菌株为本实验室分离自多纹钱蝶鱼的海豚链球菌菌株DFSM，培养于脑心浸液(Brain heart infusion，BHI)培养基，培养温度28 ℃。用于攻毒及免疫的多纹钱蝶鱼购自三亚某养殖场。攻毒试验用鱼体重为(95.0±4.1) g。免疫试验用鱼体重为(51.0±2.1)g。暂养于150 L小型海水循环水系统，水温(26±1) ℃，每日按体重的1%进行投喂，实验开始前随机取5尾鱼采血并解剖，取肝脏、脾脏和肾脏涂布平板，确定无病原感染。
实验用到的试剂及仪器的信息如下：BHI培养基购自北京索莱宝科技有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)和PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；海洋动物组织DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；His标签蛋白纯化试剂盒购自Cytiva；PCR仪、NanoDrop购自赛默飞世尔科技公司；电泳仪购自北京六一仪器厂；凝胶成像系统购自Analytik Jena ChemoStudio公司；细胞超声破碎仪购自新芝生物科技股份有限公司。
1.2 海豚链球菌感染条件下毒力基因表达检测利用Primer Premier 5设计毒力基因(eno、simA、sag、cfi、pgmA、scpI、pdi)及内参基因(gyrB)引物，引物序列如表 1所示。
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表 1 引物序列 Table 1 Sequences of the primers |
以海豚链球菌DFSM菌株DNA为模板，分别采用eno、simA、sag、cfi、pgmA、scpI、pdi以及gyrB基因引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接至pCE2 TA/Blunt-Zero载体构建标准质粒。RT-qPCR扩增程序：95 ℃预变性30 s；然后95 ℃10 s，61 ℃30 s，72 ℃15 s，共40个循环。对不同稀释倍数质粒的Ct值进行数据分析，计算各引物扩增效率。
将菌株接种于BHI琼脂培养基中，28 ℃培养后，收集菌体制成1×105 cfu/mL的菌悬液，浸泡多纹钱蝶鱼60 min，对照组用同等体积的无菌磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffer saline，PBS)浸泡相同时间，实验设3个平行组，每组80尾。在0、24、48、72、96、120、144和168 h取发病鱼肝脏冻存于-80 ℃。
使用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent提取肝脏组织RNA，HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)进行反转录。以各时间点(0、24、48、72、96、120、144和168 h)3尾多纹钱蝶鱼肝脏组织的cDNA为模板，分别使用eno、simA、sag、cfi、pgmA、scpI和pdi 7种毒力基因引物，以gyrB作为内参基因进行RT-qPCR检测。根据毒力基因和内参基因的Ct值并使用2-ΔΔCt法计算毒力基因的相对表达量，本文中毒力基因的表达变化倍数(Fold change，FC)的计算方法为将毒力基因在肝脏组织中的相对表达量和cfi基因攻毒后48 h在肝脏组织中的相对表达量求比值，得到基因的表达变化倍数，公式如下：
| $ F C_x=R E_x / R E_{c f i-48 \mathrm{~h}}。$ |
式中：FCx为毒力基因在相应时间点的表达变化倍数；REx为毒力基因在攻毒后相应时间点的相对表达量，REcfi-48 h为cfi基因在攻毒后48 h在肝脏组织中的相对表达量。
1.3 在培养条件下海豚链球菌的毒力基因表达分析振荡培养至菌液OD600=0.5时进行取样，提取RNA并进行反转录，按照1.2的方法测定毒力基因表达，毒力基因在培养条件下相对表达量的计算同1.2。
1.4 海豚链球菌DFSM菌株在肝脏组织中细菌载量测定选取内脏中较大且容易采集的肝脏组织测定海豚链球细菌载量变化趋势。调菌液OD600到0.5(菌液浓度为108 cfu/mL)，将菌液进行10倍梯度稀释，各浓度取1 mL菌液与200 mg健康鱼肝脏组织充分研磨混合，然后取200 μL的组织匀浆液，使用海洋动物组织DNA提取试剂盒提取DNA。NanoDrop测定DNA浓度，取相同量的DNA作为模板，用SilldP引物(引物序列见表 1)进行qPCR，以细菌浓度为横坐标，Ct值为纵坐标制作标准曲线。
提取人工感染后0、24、48、72、96、120、144和168 h等量的肝脏组织DNA。以相同量的DNA作为模板，用SilldP引物进行qPCR，得到每个样品的Ct值，利用标准曲线测算组织中的细菌数量。
1.5 α-烯醇化酶的克隆与原核表达根据海豚链球菌DFSM菌株全基因组数据中的eno核酸序列设计扩增eno完整CDS区域的引物，引物eno1-F/R序列如表 1所示，扩增片段长度1 308 bp。测序验证后连接至表达载体pET-32a(+)，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，加入IPTG诱导表达。收集菌体沉淀，加入变性裂解液重悬，使用His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。将纯化后蛋白放入透析袋中进行梯度透析并冻干保存。
1.6 α-烯醇化酶亚单位疫苗制备使用PBS调整纯化后的rENO浓度为1 mg/mL，不额外加入佐剂，每尾鱼注射0.1 mL，即2 μg/g体重剂量。制备海豚链球菌灭活疫苗作为比较，首先将过夜培养的海豚链球菌DFSM菌株的菌液加入终浓度为0.20%(v/v)的甲醛溶液进行灭活，28 ℃灭活24 h后进行液体培养和平板涂布培养，确定灭活完全。完全灭活的菌液经无菌PBS缓冲液调整OD600=0.5(细菌浓度约为1×108 cfu/mL)，作为海豚链球菌灭活疫苗4 ℃保存备用。
1.7 疫苗的免疫保护率将多纹钱蝶鱼随机分为3组：灭活疫苗组、亚单位疫苗组和对照组，每组20尾。分别采用腹腔注射免疫，灭活疫苗组和亚单位疫苗组每尾注射0.1 mL对应疫苗，对照组注射0.1 mL无菌PBS。免疫28 d后进行攻毒实验，采用1×105 cfu/mL的浓度浸泡多纹钱蝶鱼60 min。攻毒后正常养殖管理，观察实验鱼状态，记录发病症状和死亡数量，计算相对免疫保护率。相对免疫保护率(Relative percentage survival，RPS)的计算公式为RPS=(1－(免疫组死亡率/对照组死亡率))×100%。
2 结果 2.1 浸泡攻毒后多纹钱蝶鱼存活率采用1×105 cfu/mL的细菌浓度浸泡多纹钱蝶鱼60 min后，观察记录多纹钱蝶鱼发病症状以及死亡数量，分析3次攻毒实验数据。结果显示，试验鱼在48 h开始出现明显发病症状：病鱼体色发黑，狂游，眼球突出、充血，鱼鳍基部发红，肛门红肿，解剖可见病鱼肝脏充血(见图 1)。48 h试验鱼开始出现死亡，96 h累积死亡率达到(81.16±0.58)%，此后试验鱼不再出现死亡，多纹钱蝶鱼存活率如图 2所示。
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( A—B：眼球突出、充血；C：肝脏充血；D：鱼鳍基部发红、肛门红肿。A—B: Protruding and congested eyeballs; C: Congested liver; D: Reddened fin bases, red and swollen anus. ) 图 1 人工感染多纹钱蝶鱼发病症状 Fig. 1 Symptoms of artificial infection of S. multifasciata |
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( 海豚链球菌攻毒组采用1×105 cfu/mL的浓度浸泡多纹钱蝶鱼60 min，PBS对照组用同等体积的无菌PBS浸泡相同时间。For the S. iniae challenge group, S. multifasciata were immersed in a bacterial suspension with a concentration of 1×105 cfu/mL for 60 minutes. For the PBS control group, the fish were immersed in an equal volume of sterile PBS for the same duration. ) 图 2 浸泡攻毒后多纹钱蝶鱼存活率 Fig. 2 Survival rates of S. multifasciata after immersion challenge |
利用海豚链球菌DNA作为模板，以SilldP为引物进行qPCR，以细菌载量的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标制作标准曲线(见图 3)，获得细菌载量和Ct值公式为y=-3.619x+49.241，其中y是Ct值，x是以10为底细菌载量的对数。以人工感染后各时间点肝脏组织DNA作为模板，用SilldP引物进行qPCR，得到Ct值后，利用标准曲线测算组织中的细菌载量。细菌载量检测结果显示(见图 4)，肝脏组织中细菌载量与感染进程密切相关，攻毒后48 h细菌数量达到最高，多纹钱蝶鱼开始出现死亡。72 h后细菌载量下降，表明海豚链球菌感染多纹钱蝶鱼更多表现为急性感染。
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( 横坐标代表细菌载量(CFU/g)经log10对数转换后的值；纵坐标代表Ct值；标准曲线公式为y=-3.619x+49.241。The horizontal axis represents the values of bacterial loads (CFU/g) after log10 logarithmic transformation, the vertical axis represents the Ct value, and the standard curve formula is y=-3.619x+49.241. ) 图 3 细菌浓度与Ct值标准曲线 Fig. 3 Standard curve of bacterial concentration and Ct value |
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( 纵坐标为肝脏细菌载量(CFU/g)经log10对数转换后的值；不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。The vertical axis represents the values of bacterial loads (CFU/g) after log10 logarithmic transformation in the liver. Different letters indicate significant differences (P < 0.05), while the same letters indicate no significant difference (P>0.05). ) 图 4 攻毒后各时间点细菌载量 Fig. 4 Bacterial loads at various time points after the challenge |
将8对引物的扩增片段分别连接至克隆载体，以构建标准质粒。采用RT-qPCR分析不同稀释倍数质粒的Ct值，得到各引物扩增效率。引物扩增效率及相关系数(R2)如表 2所示。所设计的8对引物扩增效率在90%~110%之间，相关系数R2均大于0.99，可用于RT-qPCR实验。
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表 2 引物扩增效率 Table 2 Amplification efficiency of primers |
以各时间点(0、24、48、72、96、120、144和168 h)3尾多纹钱蝶鱼肝脏组织的cDNA为模板，分别使用eno、simA、sag、cfi、pgmA、scpI和pdi 7种毒力基因引物，以gyrB作为内参基因进行RT-qPCR实验，结果如图 5所示(0、24和96 h以后检测不到各毒力基因表达，故图中未显示)。随着感染过程的进行，eno、sag和pgmA基因表达量在感染后72 h显著高于感染后48 h，simA、cfi、scpI和pdi基因表达量在感染后48和72 h无显著差异。海豚链球菌在培养条件下毒力基因的表达情况如图 5所示，eno、sag、pgmA在感染条件下的表达量显著高于培养条件下，simA和pdi基因表达量在感染条件下与培养条件下无显著差异，cfi和scpI基因在培养条件下的表达量高于感染条件下的表达量。
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( 48 h、72 h：攻毒后时间；BHI：脑心浸液培养基。不同字母表示差异显著(P < 0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。毒力基因的表达变化倍数(Fold change)的计算方法为将毒力基因在肝脏组织中的相对表达量和cfi基因在攻毒后48 h在肝脏组织中的相对表达量求比值得到基因的表达变化倍数。计算公式为FCx=REx/REcfi-48 h。48 h, 72 h: Time after challenge. BHI: Brain heart infusion broth. Different letters indicate significant differences (P < 0.05), while the same letter indicates no significant difference (P>0.05). The calculation method for the fold change in the expression of virulence genes is as follows: the relative expression level of the virulence gene in liver tissue is divided by the relative expression level of the cfi gene in liver tissue at 48 hours post-challenge. The calculation formula is FCx = REx / REcfi-48 h. ) 图 5 海豚链球菌感染过程中毒力基因表达 Fig. 5 Expression of virulence genes during S. iniae infection |
将eno完整CDS片段连接至pET-32a(+)表达载体后，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，利用IPTG诱导表达。α-烯醇化酶重组蛋白的诱导表达结果如图 6A所示，蛋白约为66 kDa，主要以可溶性形式表达(见图 6B)。
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( A：α-烯醇化酶重组蛋白的诱导表达；M：蛋白分子量标准；1：α-烯醇化酶诱导前取样；2：α-烯醇化酶诱导后取样。B：α-烯醇化酶重组蛋白的可溶性分析；M：蛋白分子量标准；1：超声破碎后上清；2：超声破碎后沉淀。C：亲和层析纯化α-烯醇化酶重组蛋白的纯化结果；M：蛋白分子量标准；1—5：500 mmol/L咪唑浓度的Elution buffer的洗脱结果；6：流出液。A: Induction expression of recombinant proteins of α-enolase; M: Protein marker; 1: Sampling before α-enolase induction; 2: Sampling after α-enolase induction. B: Solubility analysis of α-enolase recombinant proteins; M: Protein marker; 1: The supernatant after ultra-sonication; 2: The sediment after ultra-sonication. C: Purification of α-enolase using affinity chromatography; M: Protein marker; Lane 1—5: 500 mmol/L elution buffer; Lane 6: Flow-through. ) 图 6 α-烯醇化酶重组蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化 Fig. 6 Induction expression, solubility analysis and purification of recombinant proteins of α-enolase |
采用含500 mmol/L咪唑的Elution Buffer对诱导表达后的重组蛋白进行洗脱，分5次收集洗脱液。结果表明，重组蛋白的第一次洗脱液蛋白含量多且杂质少，收集第一次洗脱液，得到纯化的重组蛋白，结果如图 6C所示。综上所述，本研究成功表达并纯化了α-烯醇化酶，这为后期海豚链球菌毒力因子免疫原性分析及亚单位疫苗研究奠定了基础。
2.5 α-烯醇化酶亚单位疫苗的免疫保护率分别用纯化后的rENO亚单位疫苗和海豚链球菌灭活疫苗腹腔注射免疫多纹钱蝶鱼，28 d后，采用同源菌株海豚链球菌进行浸泡攻毒，测定亚单位疫苗的相对免疫保护率。攻毒后对各组发病鱼重新进行细菌分离和16S rRNA鉴定，确认为同源海豚链球菌DFSM株。统计各组存活率，结果如图 7所示。海豚链球菌灭活疫苗组、rENO亚单位疫苗组和对照组累积死亡率分别为5%、25%和85%。根据公式计算得到海豚链球菌灭活疫苗和rENO亚单位疫苗的相对免疫保护率分别为94.12%和70.59%。以上结果表明，rENO亚单位疫苗的相对免疫保护率虽低于海豚链球菌灭活疫苗组，但仍提供了较好的免疫保护效果，说明rENO具有作为疫苗抗原的潜力。
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( RPS：相对免疫保护率。海豚链球菌灭活疫苗组、rENO亚单位疫苗组和对照组累积死亡率分别为5%、25%和85%，海豚链球菌灭活疫苗和rENO亚单位疫苗的RPS分别为94.12%和70.59%。RPS: Relative percentage survival. The cumulative mortality rates of the S. iniae inactivated vaccine group, rENO subunit vaccine group, and control group were 5%, 25%, and 85%, respectively. The RPS of the S. iniae inactivated vaccine and the rENO subunit vaccine were 94.12% and 70.59%, respectively. ) 图 7 两种疫苗的相对免疫保护率 Fig. 7 The relative percentage survival of the two vaccines |
海豚链球菌引发的鱼类病害给全球养殖业造成重大损失。鱼类感染后的典型症状包括游动异常、眼球突出、皮肤发黑、腹水及血肿等[14-15]，且该菌感染常引发急性死亡，如斑马鱼(Danio rerio)、金鲳鱼(Trachinotus ovatus)在感染后48 h内即可出现死亡[3, 40]。海豚链球菌可能通过多种途径感染鱼类，如鳃部、鼻腔[41-43]。Zlotkin等[30]提出，海豚链球菌的感染可能始于细菌在鱼体外部组织或肠道的定植，随后通过增殖扩散引发局部感染，进而侵入血液并随循环系统扩散至全身。有研究表明，海豚链球菌可在30 min内突破上皮屏障，在杂交条纹鲈等高度易感物种中，感染后18 h内即可在所有组织中检测到该菌，最终入侵大脑及中枢神经系统[28-30]。
本研究采用浸泡法对多纹钱蝶鱼进行人工感染，试验鱼经浸泡后48 h开始表现出体色发黑、游动异常等症状，并伴随死亡(见图 1)。眼球、肝脏、肠道等多器官出现感染症状表明海豚链球菌已随循环系统扩散至全身，推测是大脑及中枢神经系统的病变导致多纹钱蝶鱼的游动异常[44]。上述特征均符合该菌感染的典型表现，结合细菌分离及16S rRNA鉴定结果，证实其死亡是由同源海豚链球菌DFSM株感染所致。此外，有研究者通过注射方式使红尾鲨(Labeo bicolor)感染海豚链球菌后发现，各器官细菌载量随感染时间动态变化[45]。本研究检测了人工感染海豚链球菌后多纹钱蝶鱼肝脏中的细菌载量，结果显示肝脏细菌载量与感染进程高度相关：24~48 h内细菌数量持续增加，表明该菌在肝脏内发生了大量增殖，并于攻毒后48小时达到峰值。且攻毒后48~72 h多纹钱蝶鱼死亡最为剧烈，提示此阶段海豚链球菌可在肝脏中持续留存并造成组织损伤；随后肝脏中细菌载量开始出现下降，这表明48 h后细菌可能开始从肝脏中被逐渐清除[46]。
前述研究表明，eno、sag和pgmA基因是调控海豚链球菌入侵鱼类组织并保证存活的关键因子[19-20, 22-23]。在本研究中，eno、sag和pgmA基因的表达量在感染后72 h均显著高于48 h，48~72 h期间的累积死亡率达到60%(见图 2)，eno、sag和pgmA基因的高表达与多纹钱蝶鱼的死亡趋势吻合，表明这三种基因在入侵过程中占据主导地位，是调控海豚链球菌入侵鱼类组织并造成损伤的主要毒力因子。此外，上述基因在感染鱼体时的表达量显著高于体外培养条件下的表达量，表明宿主环境可能诱导eno、sag及pgmA等毒力基因的表达增强，但其具体机制尚未明确。推测这可能是由于海豚链球菌在抵御宿主免疫系统清除的压力下，加速了对宿主组织环境的适应，以维持扩散、存活及增殖能力。本研究发现，simA、cfi、scpI和pdi基因的表达量在感染后48和72 h无显著差异。尽管已有研究表明这四种基因可增强海豚链球菌的毒力、黏附能力及抵御吞噬的能力，但本研究结果显示，它们可能并非急性感染过程中的关键因子，更多起到辅助作用[16-18, 21]。其中，simA和pdi基因在感染条件与培养条件下的表达量无显著差异，进一步印证了这一点。值得注意的是cfi和scpI基因在培养条件下的表达量更高，二者与海豚链球菌毒力的直接联系可能较弱。如肖孟玮等[47]研究结果显示，并不是所有黏附的海豚链球菌都能成功入侵宿主细胞，暗示CAMP因子协助菌体黏附和感染是两个独立的机制，其对致病性的贡献较弱。而C5a肽酶本身可能并不能作为致病因子在鱼体内发挥作用，可能更接近于一种辅助性的、致病程度较轻的机制，例如在使用杂交条纹鲈和斑马鱼感染模型的分析中，发现该基因的失活并非总能导致体内毒力降低，因此推测海豚链球菌可能还具有其他基因编码的、与scpI功能冗余的毒力因子，从而掩盖了毒力效应[18]。
不同于先前研究者利用质谱和免疫印迹法筛选潜在抗原[48-49]，本研究通过探究海豚链球菌感染多纹钱蝶鱼后在肝脏内的载量变化，并结合7种毒力基因在体内和体外培养条件下的表达情况，筛选出在入侵鱼体过程中被诱导表达的eno、sag和pgmA基因。
3.2 α-烯醇化酶亚单位疫苗保护效果接种疫苗是防控海豚链球菌病的有效手段，国内尚无商品化海豚链球菌疫苗上市。虽有研究人员针对海豚链球菌制备了不同形式的疫苗，但目前尚无关于多纹钱蝶鱼海豚链球菌亚单位疫苗的研究报道。本研究选择了多纹钱蝶鱼感染海豚链球菌的进程中高表达的eno基因，并通过大肠杆菌原核重组表达系统成功表达α-烯醇化酶重组蛋白(rENO)。随后制备了rENO亚单位疫苗，探究其抗原潜力，并与海豚链球菌灭活疫苗进行对比。以2 μg/g体重剂量腹腔注射免疫多纹钱蝶鱼，免疫28 d后的攻毒结果显示，海豚链球菌灭活疫苗和rENO亚单位疫苗的相对免疫保护率分别为94.12%和70.59%。灭活疫苗包含所有结构蛋白及天然构象，能激发更全面的免疫应答，而亚单位疫苗仅含单一抗原，且可能因表达系统导致蛋白折叠或糖基化差异，影响抗原性，因此rENO亚单位疫苗的相对免疫保护率低于灭活疫苗组。如Yi等[50]研究发现，FbsA和α-烯醇化酶两种重组蛋白均能保护罗非鱼免受无乳链球菌感染，但保护率低于灭活无乳链球菌免疫组，无乳链球菌中多种蛋白具有高免疫原性，共同触发宿主免疫反应，可提供有效免疫保护，而单一抗原可能无法有效激活宿主免疫系统以提供完全保护。
重组蛋白作为疫苗抗原普遍存在免疫原性较弱的问题，且抗原注入鱼体后易受体内复杂环境影响而降解，这些问题可通过添加佐剂及改进抗原递送载体得以解决[51]。已有报道研究了rENO、灭活海豚链球菌疫苗、MontanideTM ISA 763 AVG+rENO、MontanideTM ISA 763 AVG +灭活海豚链球菌四组疫苗对斑点叉尾鮰的保护效果，其中含有rENO组分的疫苗免疫剂量为1 μg/g，相对保护率分别为40%、65%、75%和90%[52]。本研究中海豚链球菌灭活疫苗和rENO亚单位疫苗的相对免疫保护率高于前期研究，表明rENO在多纹钱蝶鱼体内表现出良好的免疫原性。当然，这可能得益于本研究使用了更高的免疫剂量(2 μg/g体重剂量)，亦或是免疫鱼种类差异导致的。例如有研究者在斑马鱼中观察到重组α-烯醇化酶(rENO)亚单位疫苗诱导产生的免疫保护率与全细胞灭活疫苗相当[53]，且不同的免疫程序和攻毒方式也可能影响免疫效果的评价[54]。总之，以上结果说明rENO亚单位疫苗在多纹钱蝶鱼中具有较好的应用潜力。本研究后续将优化免疫剂量并筛选适宜佐剂，比较分析佐剂是否也能进一步提高rENO亚单位疫苗对多纹钱蝶鱼的免疫保护效果。
4 结语本研究探索了多纹钱蝶鱼感染海豚链球菌的进程中肝脏的细菌载量变化和7个毒力基因的表达情况，筛选出eno、sag和pgmA这3个在海豚链球菌感染宿主体内被诱导表达的基因，开发了针对多纹钱蝶鱼的海豚链球菌rENO亚单位疫苗，相对免疫保护率为70.59%，具有较好的免疫保护效果，为多纹钱蝶鱼的病害防控提供了技术支持。
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