2026, Vol. 56
激活转录因子4(Activating transcription factor 4，ATF4)是一个重要的转录因子，属于ATF/CREB家族。ATF4被认为是激活综合应激反应(Integrated stress response，ISR)信号通路的关键蛋白。ISR信号通路是真核生物在应对一系列生理变化和不同的病理条件时，被激活的一种高度协调的细胞应激调节机制，其最终目的是恢复细胞稳态[1]。ISR信号通路通过整合多种胁迫信号(如氨基酸缺乏、氧化应激、低氧、内质网应激等[2-6])引起eIF2α的磷酸化。eIF2α是蛋白质翻译起始的重要调控蛋白，其磷酸化会抑制大部分mRNA的翻译，但一类应激相关的mRNA因其5′-UTR中含有上游开放阅读框而被启动翻译，进而调节代谢稳态和细胞存活，以适应环境变化并维持生理功能。其中，ATF4是最主要的应激调控因子，能够调控大量参与氨基酸摄取或合成的基因的表达[7]，并有助于自噬、凋亡、生长等相关基因的表达[8]。
ATF4在应激反应中的表达不仅依赖于转录激活，还涉及到转录后的翻译调控[9-10]。ATF4的表达不仅能够帮助细胞维持氨基酸的合成，例如通过调控天冬酰胺合成酶的表达维持氨基酸合成[11]；还可以通过调节与代谢相关的基因表达，帮助细胞适应营养不足的环境[12]。同时研究表明[13-15]，内质网应激能够通过ATF4上调骨钙素、骨涎蛋白等成骨基因表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；而ATF4缺失则导致成骨分化受阻。在代谢层面，ATF4通过调控氨基酸转运蛋白(如SLC2A5、ALDOB[16])及糖异生相关蛋白(如PEPCK、G6Pase[17])表达，维持细胞在营养匮乏条件下的代谢稳态。在胶质瘤中[18]，ATF4依赖的果糖代谢通路为葡萄糖缺乏的肿瘤细胞提供替代能量来源，支持其恶性增殖。这些研究提示，ATF4不仅是应激适应的关键因子，也是代谢需求与生长发育的重要桥梁。
三羧酸(Tricarboxylic acid, TCA)循环作为细胞能量代谢枢纽，通过氧化乙酰辅酶A生成ATP、NADH及FADH2，同时为氨基酸、脂肪酸合成提供碳骨架。TCA循环中间产物(如α-酮戊二酸、琥珀酰辅酶A)参与血红素、嘌呤等生物大分子合成，其稳态对细胞生长至关重要。在胚胎发育阶段，TCA循环为细胞分裂、分化及器官形成提供能量和代谢中间产物。研究表明，BCKDK蛋白通过磷酸化丙酮酸脱氢酶复合体的活性，从而影响TCA循环的功能，确保细胞代谢平衡，使得小鼠胚胎在PDK家族缺失条件下能正常发育。这一机制揭示了TCA循环对胚胎发育的不可替代性[19]。同时，TCA循环功能障碍可能导致严重发育缺陷，氧化磷酸化障碍，导致神经管闭合不全、骨骼畸形及多器官功能衰竭[20-23]。
在过去的研究中，已经广泛使用ATF4敲除模型进行ATF4的体内功能的研究。例如小鼠肝脏ATF4的缺失导致氧化应激增加、胆固醇稳态破坏和细胞死亡率升高[24]。ATF4敲除还会增加能量消耗，减少脂肪生成[25]。此外，ATF4的缺失能够保护小鼠，使其免于因高碳水化合物饮食诱发肝脏脂肪堆积、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗[26]。ATF4的敲除引起小鼠早期发育严重贫血和肝脏受损[27]。斑马鱼由于基因组加倍事件导致存在atf4a和atf4b两个亚型，目前已发现过表达atf4a引起脂代谢失调导致肝脏变性[28]，Atf4a蛋白也参与到内质网应激和线粒体应激中[29-30]，但斑马鱼Atf4b蛋白的功能报道较少。因此，本研究利用成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)的基因编辑技术构建了斑马鱼Atf4b敲除品系，初步分析了Atf4b缺失对斑马鱼生长发育及代谢功能的影响，为在体内揭示Atf4b介导的生长发育与代谢调控机制提供了理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料本研究所用的野生型Tübingen品系斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心。所有斑马鱼饲养于28 ℃恒温循环水系统中，每天的光周期保持为14 h的光照和10 h的黑暗，每天9:00和17:00各饲喂1次新鲜孵育的卤虫，实验所需的斑马鱼胚胎是通过亲鱼的自然产卵获得，受精卵收集后置于胚胎培养液(Embryo rearing solution, ERS，含5 mmol/L NaCl、0.33 mmol/L MgSO4、0.33 mmol/L CaCl2、0.17 mmol/L KCl，pH=7.2)中，并放置于28.5 ℃培养箱内发育。实验所用动物的使用均遵循中国海洋大学动物保护与使用委员会制定的伦理准则。
1.2 突变体斑马鱼的筛选和测序参考文献[31]方法，本实验中的atf4b-/-斑马鱼由课题组成员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对野生型斑马鱼atf4b基因进行编辑并获得F0代，将F0代与野生型一一配对进行繁殖从而筛选得到杂合的F1代，随后对F1代进行配对、筛选和测序，从而对可能存在的三种基因型(野生型、基因敲除纯合体、杂合体)斑马鱼进行筛选，保证后续用鱼遗传背景清晰。最终获得了一个突变品系，相比野生型其atf4b等位基因缺失20个碱基(atf4bΔ20/Δ20)。
1.3 序列分析使用ClustalW软件对人ATF4、小鼠ATF4和斑马鱼Atf4a、Atf4b的氨基酸序列进行比对，得到这四者的氨基酸序列的对齐情况。
1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)本研究取受精后72 h(Hours post-fertilization, hpf)的野生型和atf4bΔ20/Δ20的斑马鱼幼鱼，使用RNAeasyTM动物RNA提取试剂盒(碧云天，CAS No.: R0027)提取斑马鱼胚胎总RNA，M-MLV逆转录酶(Takara, CAS No.: 2641A)合成cDNA。以TB Green Premix Taq(Takara, CAS No.: RR420A)为反应试剂，于CFX96TM实时定量系统(Bio-Rad, USA)进行扩增。定量数据采用2-ΔΔCt方法进行分析。以β-actin的mRNA水平作为内参基因，计算各基因的相对表达量。
atf4b引物序列如下：F：GGTGTCTCTGCCCTGGTTAC；R：ACAAAAACAATGCGGGTCGG。β-actin引物序列如下：F：GATGGTCCAGACTCATCGTACTC；R：ATTGCTGACAGGATGCAGAAG。aco1引物序列如下：F：TCTTAAAGATGGTGACTGGATTGA；R：GCACACTCTTATACTTCCCGTTG。aco2引物序列如下：F：CGTCATCATGGTTCGTCCA；R：CCACCTCCAAACACCATGAGAT。slc13a5a引物序列如下：F：CTGAGAGCCCGGTGGTACT；R：TAACACACGCACAGGGTCAG。
1.5 斑马鱼幼鱼的体长记录本研究收取24、48和72 hpf的野生型(Wild type，wt)和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼幼鱼在体式镜下进行拍照，其中，24 hpf斑马鱼在拍照前使用1×Pronase溶液对其进行浸泡处理15 min，从而剥除卵膜。实验所需斑马鱼放置于3%甲基纤维素凝胶状液体上，使用针头将幼鱼摆正位置后进行拍摄，拍摄获得的照片使用Fiji软件对两组斑马鱼幼鱼体长进行测量、比较。体长的定义如下：从胚胎前端开始沿眼睛中心、内耳中心、躯干中心至尾部的曲线长度。
1.6 代谢组学分析收集30枚斑马鱼胚胎，加入200 μL含内标(C13-葡萄糖)的甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1(体积比)混合提取液，于4 ℃条件下进行磨样均质化处理，随后超声处理30 min(4 ℃)。样本在-20 ℃静置2 h完成蛋白沉淀后，于4 ℃条件下以14 500g离心15 min，收集的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进行LC-MS/MS检测。沉淀组分经SDT裂解液(4% SDS，100 mmol/L Tris-HCl，pH=7.6)重悬并均质化处理，采用BCA法(碧云天，CAS No.: P0009)进行蛋白质定量分析。应用SCIEX OS软件进行色谱峰识别与积分分析，应用MetaboAnalyst 6.0软件分析数据，代谢物相对丰度以峰面积与总蛋白浓度比值进行归一化处理。
1.7 线粒体DNA拷贝数测定收集20枚斑马鱼胚胎，使用含100 μg/mL蛋白酶K的SZL缓冲液(50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Tris(pH=8.3)，0.45% NP40，0.45% Tween-20)进行消化(60 ℃孵育2 h，随后95 ℃处理15 min)。随后，将样本涡旋振荡，并在4 ℃条件下以16 000g离心10 min。提取的DNA浓度被调整至200 ng/μL，并作为PCR模板。采用实时荧光定量PCR方法对DNA进行定量分析。相对线粒体DNA(mtDNA)水平的计算方法与mRNA相对表达水平的计算方法一致。线粒体DNA标志引物序列如下：F：CAAACACAAGCCTCGCCTGTTTAC；R：CACTGA-CTTGATGGGGGAGACAGT。细胞核标志引物序列如下：F：ATGGGCTGGGCGATAAAATTGG；R：AC-ATGTGCATGTCGCTCCCAAA。
1.8 酸度胁迫实验将24 hpf的斑马鱼胚胎放置于12孔板中，加入使用HCl或NaOH调整pH到3.5的胚胎培养液，培养至96 hpf。在此期间，每天更换新鲜配制的胁迫培养液。每个处理设10个胚胎、3个重复，每12 h记录斑马鱼生存率。
1.9 统计分析所有相关实验至少重复3次。数据以均值±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用Tukey多重检验和Log-rank检验方式，应用GraphPad Prism 8软件分析数据，P＜0.05被视为具有统计学意义。
2 结果 2.1 斑马鱼atf4a和atf4b基因的序列特征斑马鱼atf4a和atf4b基因中编码蛋白质的DNA序列(Coding DNA sequence, CDS)的长度分别为1 019和1 277 bp，编码339个和425个氨基酸组成的蛋白质。为评估斑马鱼Atf4a、Atf4b和人、小鼠的ATF4的相似性，我们使用ClustalW软件对其氨基酸序列进行全局比对，发现斑马鱼Atf4a和Atf4b序列的比对总得分为49；和人ATF4序列的比对总得分为35；和鼠ATF4序列的比对总得分为31。斑马鱼Atf4b序列和人ATF4序列的比对总得分为28；和鼠ATF4序列的比对总得分为28。人ATF4序列和鼠ATF4序列的比对总得分为86(见图 1A、B)。在结构域保守性中，N端结构域、氧依赖性降解结构域、β-TrCP识别元件保守性较差，但DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域保守性较高。
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( A. 斑马鱼Atf4a、Atf4b和人ATF4、小鼠ATF4的氨基酸序列对比。下划线标注人ATF4的功能结构域。N-terminal domain：N端结构域(1~85 aa)，oxygen-dependent degradation domain：氧依赖性降解结构域(154~183 aa)，β-TrCP recognition motif：β-TrCP识别元件(218~224 aa)，Basic domain：碱性结构域(280~299 aa)，Leucine zipper：亮氨酸拉链(305~333 aa)，Short basic domain：短碱性结构域(342~351 aa)。B.斑马鱼Atf4a、Atf4b和人ATF4、小鼠ATF4的氨基酸序列的匹配分值。C.斑马鱼atf4b基因结构示意图及基因编辑靶点，Cas9靶点序列在斑马鱼的第二外显子中。黑框：开放阅读框(ORF)，白框：非翻译区(UTR)。PAM序列以绿色标注；D.野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的atf4b基因碱基序列，红色标记为靶向序列。E.野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的Atf4b蛋白序列；F.野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的atf4b mRNA表达水平。数值以平均值±标准差表示，每个实验均为3次重复，每次重复每组处理使用20尾幼鱼。*：P <0.05, **: P <0.01, : ***P <0.001, ****:P<0.000 1。A. Alignment of amino acid sequences of zebrafish Atf4a, Atf4b, human ATF4, and murine ATF4 structure. The functional domains of human ATF4 are underlined. N-terminal domain: 1~85 aa, oxygen-dependent degradation domain: 154~183 aa, β-TrCP recognition motif: 218~224 aa, Basic domain: 280~299 aa, Leucine zipper: 305~333 aa, Short basic domain: 342~351 aa. B. The aligned score of zebrafish Atf4a, Atf4b, human ATF4, and murine ATF4 structure. C. Schematic diagram of the zebrafish atf4b gene structure and gene editing target sites. The Cas9 target sequence is located in the second exon of the zebrafish. Black boxes represent the open reading frame (ORF), and white boxes represent the untranslated regions (UTRs). The PAM sequence is highlighted in green. D. Nucleotide base sequences of the atf4b gene in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. The red word is the target site. E. The predicted Atf4b protein domains in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. F. Relative expression levels of atf4b mRNA in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. Data shown are mean±SEM, each experiment was performed in triplicate, with 20 larvae per treatment group in each replication.*：P <0.05, **: P <0.01, : ***P <0.001, ****:P<0.000 1。) 图 1 利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼atf4b基因的敲除 Fig. 1 The knockout of the zebrafish atf4b gene using CRISPR/Cas9 technology |
根据CRISPR/Cas9基因编辑技术，本研究针对斑马鱼atf4b基因的第二个外显子设计并筛选出特异性sgRNA靶序列5′-TGCAATGGCTACCCATTCAGGTGAG-3′(见图 1C), 并由此成功构建了缺失20个碱基的atf4b纯合突变体斑马鱼模型(atf4bΔ20/Δ20)。通过SnapGene软件分析突变体的atf4b基因的碱基序列，发现由于突变体的atf4b基因缺失了20个碱基，因此造成了终止密码子的提前出现(见图 1D)，进而使atf4b突变品系只表达293个氨基酸的多肽，少于野生型的425个氨基酸(见图 1E)。CRISPR-Cas9基因编辑引起的移码突变常引起RNA降解[32]，通过分析野生型和突变体斑马鱼中atf4b的mRNA水平发现，突变体斑马鱼的atf4b的mRNA表达水平显著低于野生型(见图 1F)。因此证明，通过CRISPR/Cas9介导的靶向基因编辑技术，成功建立了atf4b基因敲除的斑马鱼模型。
2.3 atf4b基因敲除对斑马鱼早期发育的影响利用atf4b基因敲除的斑马鱼品系，分析atf4b基因对斑马鱼早期发育的影响。发现atf4b突变体斑马鱼未表现出显著的身体畸形，但其体型小于野生型斑马鱼，因此选取24、48和72 hpf的野生型和atf4b突变体斑马鱼进行体长测定，结果发现突变体体长均显著短于野生型(见图 2A、B)。结果显示，atf4b基因的敲除会影响斑马鱼生长发育进程，导致斑马鱼早期发育受阻。
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( A. 野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼在24、48和72 hpf的体长。B.野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼在24、48和72 hpf的侧视图。数值以平均值±标准差表示，每个实验均为3次重复，每次重复每组使用15尾幼鱼。****：P<0.000 1。A. Body length of wt and atf4bΔ20/Δ20 at 24, 48 and 72 hpf. B. The profile view of wt and atf4bΔ20/Δ20 at 24, 48 and 72 hpf. Data shown are mean±SEM, each experiment was performed in triplicate, with 15 larvae per treatment group in each replication. ****: P<0.000 1. ) 图 2 敲除atf4b基因对斑马鱼早期发育的影响 Fig. 2 The effects of atf4b knockout on the early development of zebrafish |
由于ATF4在代谢调控中发挥重要作用，故对野生型和atf4b突变体斑马鱼进行了代谢组学的分析，进而评估atf4b基因对斑马鱼代谢功能的影响。通过对LC-MS/MS系统得到的关键代谢物进行PCA分析，野生型组样品和atf4bΔ20/Δ20组样品在图 3A中明显分开，组间的置信椭圆几乎没有重叠，说明两组样品的关键代谢物含量水平存在显著差异。同时PC1和PC2的解释方差分别为35.1%和20.9%，即这两个主成分共同解释了56.0%的数据变异，进一步表明了它们在PCA空间中存在显著性差异(见图 3A)。进而，对野生型与atf4bΔ20/Δ20斑马鱼间的差异代谢物进行KEGG通路富集分析。结果显示，显著富集的通路包括“三羧酸循环”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路”、“乙醛酸和二羧酸代谢通路”、“磷酸戊糖途径”、“丙酮酸代谢通路”、“嘌呤代谢通路”和“丁酸代谢通路”(见图 3B)。这些结果提示atf4b突变体能量代谢可能存在缺陷。对此，检测了ATP水平，发现突变体中ATP含量显著低于野生型(见图 3C)。
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( A. 野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的主成分分析。绿色：野生型，红色：atf4bΔ20/Δ20。B.野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼关键代谢物的代谢通路富集图。C.野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼ATP的相对含量。数值以标准值±标准差表示，每个实验均为3次重复，每次重复每组使用20尾幼鱼。*：P<0.05。A. Principal component analysis (PCA) of wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. Green: wt, Red: atf4bΔ20/Δ20. B. KEGG pathway enrichment analysis of differentially abundant metabolites in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. C. Relative abundance of ATP in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. Data shown are mean±SEM, each experiment was performed in triplicate, with 20 larvae per treatment group in each replication. *: P<0.05. ) 图 3 敲除atf4b基因对斑马鱼代谢功能的影响 Fig. 3 The effects of atf4b gene knockout on metabolic function in zebrafish |
atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的差异代谢物被显著富集于三羧酸循环及其相关代谢通路中，由此对三羧酸循环中的关键代谢物进行了靶向分析，这些代谢物包括柠檬酸、异柠檬酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸和草酰乙酸。结果发现，atf4bΔ20/Δ20斑马鱼中的柠檬酸相对含量显著高于野生型，其余6种中间产物均显著低于野生型斑马鱼(见图 4A—G)。atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的顺乌头酸合酶基因aco1、aco2和柠檬酸转运通道蛋白基因slc13a5a的相对表达量也显著低于野生型(见图 4H—J)。这些结果表明，三羧酸循环代谢通路受阻，导致柠檬酸异常积累。
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( A—G.野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼三羧酸循环关键代谢产物的相对含量，分别为丙酮酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸和草酰乙酸。H—J. 野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的aco1、aco2和slc13a5a基因的mRNA表达水平。数值以平均值±标准差表示，每个实验均为3次重复，每次重复每组使用20尾幼鱼。*：P <0.05, **: P <0.01, : ***P <0.001, ****:P<0.000 1。A—G. Relative abundance of key TCA cycle metabolites, including pyruvate; citrate; isocitrate; oxoglutarate; succinate; malate and oxaloacetate in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. H—J. Relative expression levels of aco1, aco2 and slc13a5a mRNA in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. Data shown are mean±SEM, each experiment was performed in triplicate, with 20 larvae per treatment group in each replication.*：P <0.05, **: P <0.01, : ***P <0.001, ****:P<0.000 1。) 图 4 敲除atf4b基因对斑马鱼三羧酸循环功能的影响 Fig. 4 The effect of atf4b gene knockout on the function of the tricarboxylic acid (TCA) cycle in zebrafish |
鉴于线粒体是三羧酸循环的关键场所，推测atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的线粒体稳态可能失衡。为验证此推测，对野生型和atf4b突变体斑马鱼进行了线粒体DNA水平检测，发现atf4bΔ20/Δ20斑马鱼的线粒体DNA水平显著高于野生型斑马鱼(见图 5A)。由于atf4b突变体的能量代谢功能受损，而充足的能量供应是应对胁迫的关键，因此推测其胁迫耐受能力可能降低。水质的酸化(包括淡水因酸雨及环境引起的酸化和海洋酸化现象)严重影响了水生动物的健康，为探究野生型和突变体的酸度耐受能力的差异，进行了酸度胁迫存活实验，结果表明，atf4b突变体在酸环境下的存活率显著低于野生型组(P=0.048 9)(见图 5B)。
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( A. 野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼线粒体DNA的相对水平。B. 野生型和atf4bΔ20/Δ20斑马鱼在pH=3.5的酸度胁迫环境下的存活率。数值以平均值±标准差表示，每个实验均为3次重复，每次重复每组使用20尾幼鱼。****：P<0.000 1。A. Relative mtDNA levels in wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish. B. Viability of wt and atf4bΔ20/Δ20 zebrafish under acidic stress conditions (pH=3.5). Data shown are mean±SEM, each experiment was performed in triplicate, with 20 larvae per treatment group in each replication. ****: P<0.000 1. ) 图 5 敲除atf4b基因对斑马鱼的线粒体稳态及酸胁迫耐受性的影响 Fig. 5 The effect of atf4b gene knockout on mitochondrial homeostasis and acid stress tolerance in zebrafish |
ATF4作为综合应激反应信号通路中的核心转录因子，通过调控代谢重编程、蛋白质合成和氧化还原平衡，广泛参与细胞增殖、骨骼发育、眼睛发育和造血等过程[33]，在生物生长发育过程中发挥着关键作用。本研究构建了atf4b基因敲除的斑马鱼模型，通过研究atf4b的敲除对斑马鱼发育和代谢功能的影响，揭示了Atf4b在斑马鱼早期生长发育及能量代谢中发挥关键作用。我们构建的atf4bΔ20/Δ20突变体所编码的蛋白，其氨基酸序列与人类ATF4相比，仅保留了3个保守结构域，分别为N端结构域、氧依赖性降解结构域和β-TrCP识别元件。但缺失了碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper, bZIP)结构域部分。bZIP结构域是ATF4的核心功能区域，其通过DNA结合、二聚体形成及转录调控等机制，在细胞应激响应、代谢调节及疾病发生中发挥关键作用。在过去的研究中发现bZIP结构域通过亮氨酸拉链与PHD1/PHD3蛋白结合，形成复合物以稳定ATF4蛋白[34]。同时ATF4的bZIP结构域通过异源二聚化(如与HIF-1α结合)调控缺氧响应基因，从而形成细胞应激反应的核心调控网络[35]，因此bZIP结构域的缺失会导致功能丧失，进而影响细胞在应激条件下的适应和存活。此外，由于突变体蛋白仍保留了蛋白结合结构域，我们无法排除Atf4b突变体蛋白是否会影响其他结合蛋白的功能，这需要进一步的研究。我们发现Atf4b的缺失会导致突变体斑马鱼在其早期生长发育中均显著慢于野生型，在过去的报道中，Margaret等[36]曾经对小鼠胚胎成纤维细胞和人类癌细胞系进行了相关研究，发现ATF4是mTORC1的代谢效应器，会参与到IGF-mTOR信号通路的促进蛋白质合成。同时，ATF4的敲除使得mTORC1介导的SLC7A11表达量下降，从而导致小鼠胚胎成纤维细胞的半胱氨酸的摄取减少，进而影响细胞和机体的生长。因此，未来有必要对斑马鱼Atf4b与mTORC1信号通路的调控关系进行更深一步的研究。
我们发现TCA循环代谢失衡也是生长发育迟滞的驱动因素之一。TCA循环作为细胞能量代谢与生物合成的核心枢纽，其通量直接影响胚胎发育的速率和效率。在atf4bΔ20/Δ20突变体中，其线粒体DNA拷贝数显著上升，线粒体DNA拷贝数是线粒体功能的重要生物标志物[37]，其水平与能量代谢、氧化应激和线粒体膜电位的变化直接相关[38]。据报道，内源性的基因突变可能会导致线粒体DNA突变并损害线粒体DNA复制的调节，造成异常的线粒体DNA拷贝数，进而影响线粒体正常功能[39]，例如氧化磷酸化，线粒体活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的产生与消除，信号传导，细胞凋亡和细胞生长等生理机制[40-41]。因此，atf4bΔ20/Δ20突变体的线粒体DNA拷贝数的异常升高，证明其线粒体可能存在损伤情况，进而阻碍TCA循环的正常进行，特别是柠檬酸的异常积累与下游代谢物(α-酮戊二酸、苹果酸、琥珀酸等)的同步减少，表明Atf4b的缺失会导致斑马鱼能量代谢流在柠檬酸节点发生阻滞。这一现象可能由线粒体柠檬酸转运受阻[42]或顺乌头酸合酶活性被抑制[43-44]引起的。因此，我们对柠檬酸转运蛋白基因slc13a5a和顺乌头酸合酶基因aco1和aco2进行了荧光定量分析，结果发现突变体的相对表达量均显著低于野生型。柠檬酸需通过线粒体内膜载体(如SLC25A1[45])或Na+/柠檬酸共转运物(SLC13A5[46])转运至胞质，参与脂肪酸合成或氧化分解。如果TCA循环转运效率降低，线粒体内柠檬酸堆积可能会通过反馈调节机制而导致柠檬酸合酶的生成受到抑制，进一步限制乙酰辅酶A的利用，形成代谢阻碍。同时柠檬酸转化为异柠檬酸需顺乌头酸合酶的催化，顺乌头酸合酶的表达量的下降会严重阻碍该流程[47]，这与我们的结果一致。近期研究表明，氧化应激或铁硫簇合成缺陷可抑制该酶活性[48]。值得注意的是代谢流的阻滞会直接导致TCA循环的ATP生成减少和生物合成前体匮乏，并且我们在研究过程中证实了atf4b突变体的ATP水平显著低于野生型斑马鱼。TCA循环的下游代谢物的减少会导致NADH和FADH2合成量不足，线粒体氧化磷酸化效率下降，无法满足胚胎快速分裂的能量需求。并且TCA循环中的关键中间产物如α-酮戊二酸和草酰乙酸是氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸)和核苷酸合成的关键前体。其水平降低可能限制蛋白质与核酸的生物合成，从而抑制细胞增殖，进而影响生物体的正常生长发育。在小鼠研究中发现，细胞缺氧处理后IDH1和IDH2的表达水平下降而导致TCA循环受到抑制，进而引起脂质合成功能受损，最终抑制了细胞生长和血管生成能力[49]，这与本文结果都证明了TCA循环对动物胚胎生长发育的重要性。
TCA循环不仅为生长提供能量和原料，其代谢物还可作为信号分子直接调控发育相关通路。柠檬酸可通过激活ATP-柠檬酸裂解酶生成乙酰辅酶A[50-51]，乙酰辅酶A作为乙酰化供体修饰mTORC1复合体，对mTORC1活性进行正向调节，促进其激酶活性[52]。本研究中柠檬酸的异常积累可能引发乙酰辅酶A的时空分布紊乱，进而导致mTORC1信号异常激活或抑制，从而干扰蛋白质合成与细胞周期进程。值得注意的是，Akt作为IGF-mTOR通路的上游激酶，其活性受细胞内ATP/ADP比率调控[53]，TCA循环功能损伤也会导致体内存在严重的能量应激，从而可能通过AMPK激活抑制Akt磷酸化[54-55]，进而影响生物的正常生长发育。
此外，本文发现atf4bΔ20/Δ20突变体在酸性胁迫条件下其存活率显著低于野生型。大量研究表明[56-58]，酸性胁迫是造成内质网应激的重要原因之一。酸性环境可以激活PERK，进而磷酸化eIF2α，上调ATF4的转录与翻译，以抑制全局蛋白翻译，维持细胞稳态，从而帮助肿瘤细胞适应酸性压力[59-60]。同时，ATF4也是线粒体胁迫的核心调控因子。酸性条件引发的线粒体损伤[61]可激活ATF4。鉴于线粒体是ROS的主要来源，ATF4可通过上调xCT、NRF2等抗氧化基因的表达[62]，帮助细胞清除ROS、维持氧化还原稳态，并调控相关代谢。因此Atf4b的缺失会导致突变体在酸度胁迫条件下，无法有效应对内质网应激和线粒体应激等，从而导致突变体死亡率升高。
4 结语本研究以斑马鱼幼鱼为研究对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了atf4b基因敲除的斑马鱼品系，探究了atf4b基因对斑马鱼生长发育和代谢功能的影响。初步阐明了斑马鱼Atf4b通过维持TCA循环代谢流平衡，从而在胚胎早期生长中发挥关键的作用。Atf4b的缺失会造成斑马鱼线粒体损伤，从而导致三羧酸循环受阻，进而损伤斑马鱼正常生长发育功能，且显著降低酸胁迫下的存活率。本研究表明，Atf4b在斑马鱼生长发育及代谢功能方面发挥着重要作用，本研究为进一步研究斑马鱼的发育、代谢和应激调控机制提供了新视角。
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