2026, Vol. 56
2. 青岛海洋科技中心海洋生态环境科学功能实验室，山东 青岛 266237
塑料材料因其优异性能在生活中得到越来越广泛的应用，在过去的70年中塑料产量呈指数增长(1950年的150万t增加至2020年的3.67亿t)，这使得塑料污染已经成为当前全球环境危机中的热点[1]。塑料在环境中会破碎成尺寸小于5 mm的微塑料(Microplastics，MPs)，这些细小颗粒在环境中积累，造成相当大的环境问题[2]。值得注意的是，MPs在紫外线照射、光氧化及生物膜附着等环境胁迫作用下，会引发表面氧化、粒径细化及界面性质改变等系列物理化学性质演变，从而提升其生物可利用性与生态毒性[3]。因而有必要了解MPs和经环境行为老化后MPs的毒性效应。
塑料的低回收加剧了环境中的塑料污染，每年有35%的塑料废物释放到水生环境中。目前塑料废物的处理方式主要为焚烧、填埋和回收，然而这些方法存在局限性，使得塑料污染很难得到有效控制[4]。为了解决这个问题，提出了用可生物降解塑料(Biodegradable plastics，BPs)代替传统的石油基塑料的方案。预计全球BPs的产量将从2023年的114万t增加到2028年的461万t[5]。BPs在环境中可以被微生物降解为水、二氧化碳和生物质等天然物质[6]。然而，BPs的降解依赖于特定的环境条件，在自然条件下短时间内难以完全降解，并成为水生生态系统中可生物降解MPs污染的来源[7]。
近年来，BPs已被公认为是传统石油基塑料的替代品。在可生物降解的聚合物中，聚乳酸(Polylactic acid，PLA)作为最具代表的生物塑料，其全球产量呈现持续增长的趋势。尽管BPs长期被认为在环境中会完全矿化，然而，有研究表明PLA在自然环境条件下的降解速率显著低于预期[8]。这一发现暗示PLA可能与传统MPs类似，在环境中发生累计并引发潜在的生态风险。现有研究证实，PLA会对水生生物的健康造成不良影响。例如，de Oliverira等[9]通过实验发现，PLA暴露可导致斑马鱼幼鱼运动能力下降并诱发焦虑样行为。Luan等[10]发现PLA会诱导斑马鱼的发育毒性，减少自发运动并影响昼夜节律行为。尽管现有研究对PLA的毒性效应进行了初步探讨，但目前关于其老化前后毒性效应的差异研究仍较为匮乏，还需进一步深入探究。
斑马鱼因其体积小，维护费用低，生命周期短，繁殖能力高，全年产卵，与人类基因相似等优点被用作研究毒理学的良好模型。目前关于PLA的环境风险评估工作仍处于初期发展阶段，本研究利用光化学反应仪制备了老化PLA(Aging Polylactic Acid，A-PLA)。根据Liong[11]等的研究，检测到密苏里河的MPs的平均丰度为(0.80±0.57)~(2.15±1.62)mg/L，因而选取MPs浓度为0.5和5 mg/L，进行PLA和A-PLA的慢性暴露实验。通过对比老化前后PLA的毒性效应，丰富了关于PLA毒性效应的研究，为今后评估BPs的生态风险提供科学依据和数据支撑。
1 材料与方法 1.1 实验动物及试剂年龄4个月的成年野生斑马鱼(AB系)购于山东一溪月生物科技有限公司(中国潍坊)。斑马鱼饲养在20 L的水箱中，养殖用水为过滤后的纯水加万分之一水体的海盐(水体海盐0.3)。在整个实验过程中，养殖水的温度和pH分别保持在(26.0±0.5)℃和7.4±0.2，采用14/10的光暗周期比。斑马鱼在实验室条件下驯化2周，之后进行MPs的暴露实验，以减少实验环境对实验结果带来的差异。本研究所用的PLA(白色粉末，直径约为50 μm)购自特塑朗化工原料有限公司，商业试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。
1.2 A-MPs的制备及其表征MPs老化的方法参考Deng等[12]的研究，具体操作如下：称取0.5 g PLA与40 mL的Milli-Q水置于50 mL的石英管中混合，然后将石英管放入旋转式光化学反应仪中(XPA-Ⅶ，南京胥江机电厂)，以700 r·min-1进行磁力搅拌，以确保光照均匀。模拟太阳光(波长范围280~800 nm)由位于光化学反应器中心的500 W的汞灯提供。根据Zhang等[13]的方法进行改进，光化学反应在12 h/12 h的光/暗循环下进行，并在25 ℃下老化144 h。PLA老化结束后，通过真空过滤分离悬浮液，将收集的A-PLA分别用纯水和无水乙醇洗涤三次，在烘箱中于37 ℃干燥，并在室温下储备使用。
将制备好的PLA和A-PLA分别用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)(美国PerkinElmer公司，Spectrum Two)分析老化前后MPs官能团的变化，并按照公式(1)计算羰基指数(Carbonyl index，CI)；扫描电子显微镜(SEM)(日本HITACHI公司，S-4800)观察PLA和A-PLA的表面形貌；分别使用Mastersizer zs 90型的Zeta电位分析仪和Mastersizer 2000型的激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)测量PLA和A-PLA的Zeta电位和粒径分布。
| $ C I=\frac{I_{1690-1760}}{I_{1420-1490}}。$ | (1) |
式中：I1690-1760表示羰基吸收峰的吸光度；I1420-1490表示亚甲基吸收峰的吸光度。
1.3 暴露实验的设计根据OECD实验指南(TG 230)进行了成年斑马鱼的慢性暴露实验[14]。参考Zhou等人[15]的方法，设置30天的暴露实验。将MPs的暴露浓度设定为0.5和5 mg/L(低浓度组(L)和高浓度组(H))，共设计有1个对照组(Ctr)和4个暴露组(包括L-PLA、H-PLA、A-LPLA、和A-HPLA)，每个处理组随机分配70条斑马鱼。首先将老化前后的PLA超声1 h，并且连续曝气，目的是使MPs在养殖水体系中分散均匀，保持MPs的悬浮。每天喂食丰年虾2次，每两天更换50%的暴露液，直至一个月的暴露期结束。
1.4 斑马鱼生长发育参数的测量暴露周期结束后，通过冰水浴使斑马鱼安乐死，尽量擦拭干净其表面的水分，称取体重和测量体长，之后解剖斑马鱼获取肠道和大脑并且称量组织重量。根据公式(2)、(3)计算肠体指数(Intestinal somatic index，ISI)和脑体指数(Brain somatic index，BSI)。由于斑马鱼的组织较小，为了减少个体间的差异，将3个斑马鱼的组织合并为一个样本，储存在-80 ℃冰箱，以备后续实验使用。
| $ I S I=\left(\frac{W_i}{W}\right) \times 100, $ | (2) |
| $ B S I=\left(\frac{W_{\mathrm{b}}}{W}\right) \times 100 \text { 。} $ | (3) |
式中：Wi表示肠道重量，单位为g；Wb表示大脑重量，单位为g；W表示斑马鱼体重，单位为g。
1.5 组织病理分析暴露实验结束后，对照组和实验组随机挑选6条鱼解剖其肠道，将解剖的斑马鱼肠道放置4%的多聚甲醛固定液24 h用无水乙醇进行脱水，并在二甲苯中澄清。随后，将样品包埋在石蜡中，切片，苏木精-伊红染色(HE)，在显微镜下观察肠道磨损情况。使用CaseViewer2.4扫描浏览软件选取组织的目的区域进行400倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析软件统一以毫米作为标准单位，分别测量每张切片中5处上皮长度，计数对应的杯状细胞数量，并计算出杯状细胞密度=杯状细胞数量/上皮长度。
1.6 生化参数的测量取斑马鱼的肠道组织和大脑组织，根据南京建成生物工程研究所提供的方法来制备组织匀浆液。将制备好的匀浆液以4 000 r·min-1离心10 min后，收集上清液用于酶活性测试。采用南京建成生物有限公司生产的试剂盒测量了斑马鱼肠组织中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)(羟胺法)，丙二醛(Malonaldehyde，MDA)(硫代巴比妥酸法)，谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)(比色法)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)(钼酸铵法)的含量和脑组织中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)(比色法)的含量。并使用南京建成提供的试剂盒(BCA法)测量组织中的蛋白质浓度。
上述酶活性的测试均根据制造商的方案测量。使用多功能酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司，SpectraMax Plus 384)测量其在相应波长的吸光度，将所得值归一化为总蛋白量，每个分析重复三次。
1.7 肠道微生物分析暴露实验结束后，解剖斑马鱼的肠道，6个鱼的肠道合并为1个样本，每个处理组3个平行，将解剖的斑马鱼肠道送至南京派森诺基因科技有限公司，对其肠道菌群基因组进行测序分析。随后，在Illumina MiSeq-PE300平台上进行高通量测序及后续生物信息学分析后进行微生物群落分析。
1.8 定量逆转录聚合酶链式反应对暴露结束后的斑马鱼大脑进行解剖，每9条鱼的脑组织合并成一个样本，每个实验组三份平行，将处理好的样本送至武汉塞维尔生物科技有限公司。使用定量逆转录聚合酶链式反应技术(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测了斑马鱼大脑中与炎症相关基因的表达水平，包括肿瘤坏死因子-α基因(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素1β基因(Interleukin 1β，IL-1β)和白细胞介素基因(Interleukin 10，IL-10)。以GAPDH基因作为内对照，并使用2-ΔΔCt方法定量靶基因的相对表达水平。
1.9 统计分析使用SPSS 26.0和Origin Pro(2021)对数据进行分析和绘图。采用单因素方差分析(ANOVA)和Fisher最小显著差异检验(LSD)对不同实验组之间的所有参数进行比较。实验组和对照组之间观察到统计学上的显著差异标准为P＜0.05。数据结果表示为平均值±标准差(SD)。
2 结果 2.1 PLA理化性质的变化通过扫描电镜对原始及老化PLA的表面形貌进行表征。形貌学分析表明，紫外光老化过程显著诱导了PLA表面的结构变化：原始PLA具有相对光滑的表面特征和最小程度的结构缺陷；而A-PLA具有明显的碎片和蜂窝状的结构，表明经光老化发生了结构降解。激光粒度仪分析进一步量化了老化过程对PLA粒径分布的影响(见图 1(B))。原始PLA的粒径主要分布在20~50 μm区间(占比约46%)，仅约7%的颗粒处于0.5~10 μm范围。经老化后，A-PLA的粒径主要分布在0.5~10 μm(占比约50%)，这说明了光老化诱导PLA中更小颗粒的形成。
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((A)SEM; (B)粒径分布; (C)FTIR。(A) SEM; (B) Particlesizedistribution; (C) FTIR.) 图 1 原始和老化的MPs的表征 Fig. 1 Characterization of the pristine and aged MPs |
为了研究A-PLA表面官能团的变化，采用FTIR(见图 1(C))。原始PLA在1 723 cm-1处呈现典型的C=O的伸缩振动峰，而A-PLA在该峰出现衰减(峰面积降低25%)。同时在2 978 cm-1(—CH2)、1 453~1 378 cm-1(—C—H)和1 052 cm-1(C—O)等特征峰的同步弱化，表明老化过程可能引发了PLA的酯键断裂。并且老化后CI值增加，A-PLA的CI值相比PLA增加了16%(见表 1)。表面电荷分析表明，PLA和A-PLA均表现出负电性特征，且老化增强了A-PLA的表面负电荷的聚集：PLA的平均Zeta电位为-20.97 mV，而A-PLA的平均Zeta电位为-29.87 mV。
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表 1 实验中所用引物 Table 1 Primers used in this study |
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表 2 MPs老化前后的平均直径、电势和CI Table 2 The average diameter, potential and CI of MPs before and after aging |
慢性暴露实验表明，A-PLA处理组斑马鱼在30天暴露周期后其长度显著减少7%(P＜0.05)，但并未观察到PLA处理组对斑马鱼体长的显著影响(见图 2(A))。体质量在A-LPLA的处理组中显著降低(见图 2(B))，但是ISI和BSI指数在低浓度和高浓度的PLA和A-PLA处理下均无显著变化(见图 2(C)和(D))。上述结果说明，A-PLA处理对斑马鱼的生长发育有一定的负面影响，主要体现在其长度的变化。
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((A)体长；(B)体质量；(C)ISI；(D)BSI；上标字母不同代表具有显著性差异(P＜0.05)。(A) Body length; (B) Body mass; (C) ISI; (D) BSI. Different superscript letters represent significant differences(P < 0.05). ) 图 2 斑马鱼生长发育参数的变化 Fig. 2 Changes in growth and development parameters of zebrafish |
组织病理分析表明，斑马鱼的肠道组织黏膜层是由黏膜上皮和固有层结缔组织组成，其中对照组肌层结构完整。与对照组相比，接触MPs的斑马鱼杯状细胞显著减少(P＜0.05；见图 3(A))。图 3(B)所示，PLA和A-PLA处理组杯状细胞密度的降低表现出与暴露浓度相关的特征。其中，低浓度组的L-PLA和A-LPLA分别降至对照组的36.5%和35.44%；高浓度的H-PLA和A-HPLA组进一步降低至33.13%和19.06%。这一结果说明，MPs浓度是对斑马鱼毒性健康造成负面影响的主导因素，且老化状态与浓度存在交互作用。
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((A)中呈现的图像用H&E染色，放大倍数为400×，图中的黑色箭头代表杯状细胞。The images of intestines presented in (A) were stained with H&E. The magnification and scale bar were 400× for (A), respectively. Goblet cells are indicated by black arrows in (A). ) 图 3 斑马鱼暴露于MPs 30天后的肠道组织学图像(A)和肠道杯状细胞的密度(B) Fig. 3 Histological images of intestines (A) and intestinal goblet cell densities (B) in zebrafish exposed to MPs after 30 d |
经过30天慢性暴露实验，本研究测量分析了斑马鱼肠道中与氧化应激相关酶的含量变化。相较于对照组，SOD的含量在高浓度处理组显著增加，且H-PLA处理组显著高于A-HPLA处理组(P＜0.05；见图 4(A))。MDA的含量变化呈现暴露浓度相关的显著变化。具体表现为，在低浓度处理组无显著变化，而在高浓度处理组MDA的含量显著增加(P＜0.05；见图 4(B))。类似地，GST的含量变化呈现相同的规律。在所有处理组中GST的含量均显著升高，且高浓度处理相较于低浓度处理对斑马鱼产生的负面效应更为强烈(P＜0.05；见图 4(C))。CAT的含量变化则是因塑料类型而表现出差异性。A-PLA处理组中CAT的含量均显著高于同浓度下的PLA处理组。(P＜0.05；见图 4(D))。综上所述，MPs暴露引起了斑马鱼的氧化应激，其中抗氧化酶的活性的变化不仅与处理浓度密切相关，而且与MPs老化行为也息息相关。
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图 4 暴露于MPs 30天后斑马鱼肠道中(A)SOD；(C)GST；(D)CAT的活性及(B)MDA的含量 Fig. 4 Activities of (A) SOD; (C) GST; (D) CAT and contents of MDA(B) in zebrafish intestine after 30 days exposure to MPs |
在经过PLA和A-PLA暴露30天后，斑马鱼大脑中AChE的含量相比较于对照组均显著升高(P＜0.05)。然而，跨组比较显示，在相同暴露浓度下，A-PLA组与PLA组间AChE活性无统计学差异(见图 5(A)，P＞0.05)。这表明在本研究设定的实验条件下，MPs是否老化对AChE含量的影响尚未达到统计学显著性水平。
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图 5 暴露MPs 30天后斑马鱼大脑中AChE的含量(A)及炎性因子相关基因的表达(B) Fig. 5 After 30 days of exposure to MPs, the activity of AChE (A) and inflammatory factor-related gene expression (B) in the zebrafish brain |
利用RT-qPCR技术进一步分析揭示了大脑中炎症因子的相关基因表达显著异常(见图 5(B))。相对于对照组，TNF-α的表达在H-PLA上调了1.74倍显著上调，且A-HPLA组表达量显著高于原始PLA组(H-PLA，1.62倍)，呈现出高浓度的老化PLA处理使得TNF-α的表达更为异常(P＜0.05)。IL-10在A-PLA处理组的低/高浓度下分别上调了2.56和2.77倍，而IL-1β的表达在A-PLA的处理下抑制至对照组的0.66~0.69倍。上述结果表明，MPs老化行为对IL-10和IL-1β的调控具有主效应。从图 5 B中可以看出，A-PLA处理比PLA处理诱导了更加严重的炎症反应。
综上所述，长期暴露于PLA和A-PLA环境下，斑马鱼大脑中的AChE含量显著增加，且炎症相关基因表达出现显著异常。这些结果表明PLA和A-PLA暴露可能通过影响神经生理功能和炎症反应，对斑马鱼大脑健康产生潜在威胁。
2.6 MPs对肠道微生物的影响根据ASV的聚类结果，本研究通过Venn图解析了不同处理组斑马鱼肠道菌群的结构特异性(见图 6(E))。各处理组中独有ASV数目分别为对照组172个、L-PLA组310个、A-LPLA组122个、H-PLA组327个、A-HPLA组94个，同时鉴定出31个核心ASV。群落覆盖度分析显示，各个处理组的平均覆盖度为99.95%~99.99%，说明测序深度已足够覆盖包括稀有物种在内的绝大部分微生物(见表 3)。相较于对照组，各个处理组Pielou's evenness指数下降0.08~0.37，表明MPs处理降低了微生物群落的均匀度。并且，与对照组相比4个MPs处理组的Chao 1和Simpson指数均降低，且在A-PLA处理组中尤为明显(见图 6(C)和(D))。上述结果表明，MPs降低了斑马鱼微生物群落的物种多样性和丰富度。
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((A)和(B)分别代表门和属水平下的肠道菌群丰度；(C)Chao1；(D)Simpson；(E)Venn；(F)各实验指标的相关性分析。其中(E)图中不同的处理组用不同的颜色区分，图中重叠的部分表示两个或多个处理组之前共有的物种数，未重叠的部分代表某处理组特有的物种数，图中的数字代表相对应的物种数量。(A) and (B) represent the abundance of intestinal flora at the phylum level and genus level, respectively; (C) Chao1; (D) Simpson; (E) Venn; (F) Correlation analysis among various experimental indicators in the exposure groups. In the (E) diagram, different treatment groups are distinguished by different colors. The overlapping parts in the diagram represent the number of species shared by two or more treatment groups before, the non-overlapping parts represent the number of species unique to a treatment group, and the numbers in the diagram represent the corresponding number of species. ) 图 6 PLA/A-PLA介导斑马鱼肠道菌群的失调 Fig. 6 PLA/A-PLA mediating the dysbiosis of gut microbiota in zebrafish |
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表 3 各处理组的斑马鱼肠道菌群α多样性指数统计分析 Table 3 Statistical analysis of alpha diversity index of zebrafish intestinal bacterial communities in each treatment group |
16S rRNA测序分析表明，在门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteriota)、放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota)构成核心菌群(见图 6(A))。其中厚壁菌的相对丰度在MPs的处理下呈现增加(6.8%→19.7%)的趋势。而放线菌门呈现与暴露浓度相关的丰度降低，在对照组、L-PLA、A-LPLA、H-PLA和A-HPLA处理组中分别占16.06%、12.65%、14%、4.41%和4.73%。在属水平上，优势属包括Cypionkella、Aeromonas、Cetobacterium、Bosea和Rhodococcus(见图 6(B))。其中，Cypionkella在MPs的处理下呈现增加的趋势，尤其在A-HPLA处理组中(25.99%→61.90%)。Aeromonas除了在L-PLA处理组中呈现丰度增加，在其余处理组中丰度均降低。与之不同的是，Bosea在PLA处理中其丰度是增加的，而在A-PLA处理下是降低的，这说明了PLA理化性质的改变影响了斑马鱼肠道菌群的丰度。
基于Spearman相关性网络分析(见图 6(F))，脑组织中促炎因子TNF-α基因表达量与变形菌门的相对丰度呈正相关。同时，其基因表达量与MDA含量呈现显著正相关。相反，抗炎因子IL-1β表达水平与肠道GST和SOD含量呈显著负相关。这表明肠道微生物和氧化应激水平以及炎症因子表达之间存在密切关联。
3 讨论尽管理想状态下PLA被视为环境友好型替代材料，但本研究发现老化后的PLA呈现出比原始PLA更严重的环境危害。与原始的相比，A-PLA Zeta电位显著升高意味着通过表面氧化过程形成了含氧官能团，从而增强了MPs的电负性[16]。并且A-PLA比PLA具有更小的粒径和更加粗糙的表面，这些理化性质的变化会加剧其生态风险。暴露于外部污染条件会诱导水生生物产生氧化应激，而氧化应激会破坏鱼类肠道的结构完整性[17]。其中，MDA是反映细胞氧化损伤程度的重要指标，CAT、SOD和GST等酶类抗氧化剂等是鱼类抗氧化系统的主要成分[18]。慢性暴露实验表明，PLA和A-PLA处理引发了肠道中MDA、SOD、CAT和GST水平的上调。该结果与聚乙烯微塑料(PE)暴露引发斑马鱼的氧化应激具有一致性[19]。已有研究表明，长期摄入MPs会导致水生生物体重下降、存活率降低和肠道损伤等不良结果[20]。
肠道是外源性污染物代谢与吸收的重要场所，MPs作为典型污染物，主要经口摄入进入消化道[21]。本研究结果显示，暴露于A-PLA会导致斑马鱼的体长下降，以及肠道杯状细胞密度的显著降低，这一现象在高浓度处理组中尤为突出(见图 2和3)。杯状细胞作为单细胞腺体，主要功能是合成和分泌黏蛋白，其分泌物参与构建肠道表面的保护性黏液层。该黏液层直接与许多微生物接触，分泌的黏液可保护肠黏膜，起到防御细菌入侵，调节机体免疫功能的作用[22]。PLA和A-PLA处理使得杯状细胞密度显著降低这一结果与Zhou等[15]的研究发现(在PS处理下肠道杯状细胞密度显著减少)具有一致性，尽管两类MPs化学结构不同，但均表现出对肠道单细胞腺体的损伤。一方面观察到较高的MDA含量(见图 3(B))，表明在MPs处理的斑马鱼中发生了肠道氧化损伤，推测这是杯状细胞减少的潜在原因；另一方面，肠黏液主要由杯状细胞分泌，因此，本研究推测经PLA和A-PLA处理的斑马鱼肠道中杯状细胞的减少可能会破坏肠黏膜屏障，从而增加肠道对有害物质的通透性。
鱼类肠道菌群在宿主健康维持中发挥着核心作用，其功能涵盖营养吸收、功能性代谢物合成及免疫调节等多个重要方面[23]。研究表明，厚壁菌与脂质代谢有关，其群落丰度的异常升高已被证实可促进脂质蓄积并诱发肥胖表型[24]。并且，在MPs中暴露30天后，Aeromonas的相对丰度降低，该结果与Qiao等[25]的研究相吻合。值得注意的是，Aeromonas丰度下降可能通过抑制肠上皮细胞的再生进程，进而导致杯状细胞的覆盖密度降低，这一病理学特征已在肠组织切片中得到验证[26-27]。在本研究的慢性暴露实验中，MPs处理导致微生物群落多样性降低，该变化与Teng[21]等(PS暴露引起肠道微生物群落多样性降低)和Qian等[28](在PLA/APLA暴露下α多样性指数显著降低)的研究结果相符。尽管在这些研究中所用的MPs种类不同，但均观察到慢性暴露条件下微生物群落α多样性的下降。进一步研究发现，肠道菌群结构的变化与生长性能的降低和抗氧化酶系统失衡存在显著相关性。值得关注的是，微生物群落的多样性减少是炎症性肠病中的一个常见发现[29]。因而可以推测MPs引起肠道微生物群落组成的改变可能是肠道炎症和氧化应激的潜在触发因素。
AChE是生物神经传导中的关键酶，其活性的变化与神经毒性相关。在MPs的影响下，斑马鱼大脑中AChE活性较对照组显著升高(P＜0.05)，这与Huang等[30]发现斑马鱼暴露于聚酰胺(PA)后AChE活性升高的研究结论一致，说明MPs具有潜在的神经毒性作用。为进一步研究MPs对斑马鱼大脑健康稳态的影响，检测了3种免疫基因(TNF-α、IL-1β和IL-10)在MPs作用下的表达水平。免疫细胞因子的表达水平可以被认为是生物体中炎症反应和肠上皮绒毛变化的有效标志物[31]。RT-qPCR的结果显示，MPs暴露显著上调促炎细胞因子基因TNF-α的表达，同时抑制抗炎细胞因子基因IL-1β的表达(见图 5)。该结果与文献报道的聚乙醇酸神经毒性机制具有可比性，后者虽表现为TNF-α、IL-1β和IL-10的同步升高，但二者均通过破坏细胞因子的基因表达稳态加剧炎症反应[32]。并且研究表明，促炎细胞因子基因IL-1β和TNF-α的上调与炎症反应有关[33]，IL-10通过抑制促炎细胞因子的过度产生发挥关键作用，活化的巨噬细胞分泌IL-1β保护机体[34]。由于在组织学中并没有观察到严重的病变，因而推测这种情况可能是微生物群的变化导致出现的亚临床炎症，而这种炎症并没有转化为组织学变化。已经证明，环境污染物诱导的肠道微生物菌群的失调与炎症的发生有关[35]。来自肠道微生物群落的变化可以刺激免疫细胞，免疫细胞分泌细胞因子来调节免疫反应[36]。因而，在本研究中，MPs诱导的亚临床炎症的发生可能是由肠道微生物群落变化所致。
上述结果证实了PLA和A-PLA暴露对斑马鱼肠道免疫相关因子指标具有抑制或毒性作用，且A-PLA表现出更明显的毒性作用。A-PLA毒性增强的机制可能与其粗糙多孔的表面结构及更小的颗粒尺寸有关，该特性可增强生物体对其的摄取。有研究表明，小尺寸的A-PLA在脑组织中的蓄积略高于PLA，这可能导致其神经毒性增强[28]。这些研究结果表明，MPs老化后理化性质的改变，可能是加剧其毒性效应的重要因素。
4 结语在为期30天的暴露实验中，PLA和A-PLA对斑马鱼产生了毒性效应，具体表现在：肠道杯状细胞密度的显著降低，肠道菌群稳态紊乱，肠道菌群结构和丰度的改变，α多样性的降低，以及斑马鱼氧化应激水平的升高。同时，MPs引起了斑马鱼大脑中AChE活性的改变以及炎症相关基因的异常表达，这种变化呈现与暴露浓度相关的显著变化。A-PLA因老化后粒径更小、生物摄取率更高而引发的炎症反应更为显著。本研究表明MPs的毒性效应受多种因素调控，强调老化通过改变颗粒理化性质(粒径、表面电荷以及表面粗糙程度)增强了MPs的生态风险。
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2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China