2026, Vol. 56
2. 中国海洋大学海洋生命学院, 山东 青岛 266003
虾青素(Astaxanthin，3, 3′-二羟基-β, β-胡萝卜素-4, 4′-二酮)是一种酮式类胡萝卜素，相对分子质量为596.84，分子式为C40H52O4[1-2]。虾青素的生物学功能主要基于其独特的化学结构，通过淬灭单线态氧和清除自由基发挥强抗氧化作用[3]。结构中的共轭双键能够有效捕获并中和活性氧分子，阻止其引发链式氧化反应，赋予虾青素较强的光吸收能力和显著的抗氧化活性；末端的羟基和酮基增强了其极性和生物可利用性，增强了其与自由基的反应活性，从而进一步提升了其抗氧化效率。因此，虾青素在保护细胞膜和生物大分子免受氧化损伤、防治心血管疾病以及延缓皮肤光老化等方面具有重要的生理功能。
虾青素的提取方法多种多样，常根据具体需求和条件选择合适的方法或组合使用多种方法，以实现虾青素的高效提取和纯化。有机溶剂萃取法简单高效，超临界流体萃取法环保且活性保护良好，酶解法条件温和，超声波和微波辅助萃取法快速高效[4-7]。基于虾青素的化学和物理特性，已发展出多种检测技术，包括紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等[8-9]。这些方法各有优缺点，适用于不同场景下的虾青素检测分析。虾青素主要存在游离态和酯化态两种形式。游离态虾青素可以提取后直接测定其异构体含量或总量；而酯化态虾青素通常需经过皂化或酶解处理转化为游离态后，再进行后续的定量分析。目前，虾青素定量方法主要有紫外分光光度法(Ultraviolet spectrophotometry, UV)、薄层色谱法(Thin layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)等[10]。HPLC因其高准确性和可靠性，仍然是虾青素含量测定的首选方法。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾，生物学分类上属于节肢动物门(Arthropoda)十足目(Decapoda)对虾科(Penaeidae)[11]。该虾是全球养殖业中重要的海水甲壳类经济物种之一。虾青素在凡纳滨对虾的养殖中已被证实有重要的调控作用：可以与蛋白质相结合，促进体表着色[12]；提高对虾体内抗氧化酶mRNA的表达水平，缓解氧化应激[13]；改善对虾的生长性能，促进幼体发育，提高对虾存活率[14-15]；增强对副溶血性弧菌等病菌的抵抗力，并增强对低氧等环境胁迫的适应力[16]。然而，关于虾青素在凡纳滨对虾中的主要靶器官及其分子调控机制仍缺乏系统研究。开展相关研究的首要前提是建立可靠的虾青素检测方法，然而，现有的虾青素检测方法存在一定局限性，如方法灵敏度不足、样品量消耗过大，且研究多集中于虾壳和虾肉, 缺乏对其他组织的适用性研究。因此，本研究建立了适用于凡纳滨对虾组织中虾青素的提取分离与定量检测方法，为后续开展虾青素定量研究提供了可靠的技术支持。同时，通过构建不同虾青素添加水平的实验体系，解析虾青素对凡纳滨对虾体色形成、免疫应答及抗氧化能力的影响规律。这为深入理解虾青素在水产动物中的生物学功能提供理论依据。研究成果不仅有助于提升凡纳滨对虾的养殖效益和市场竞争力，还将为推动对虾养殖业的绿色可持续发展提供重要的科学参考。
1 材料与方法 1.1 实验用虾及养殖管理实验用虾购自三亚市南滨农贸市场。实验前暂养于实验槽中7 d，暂养期间投喂基础饲料(海林生物饲料有限公司)，暂养结束后，筛选体质量为(24.0±2.0)g的健康个体120尾，随机分配至一套循环水养殖系统的4个养殖缸中。养殖实验为期15 d。每日于9:00、15:00和21:00定时投喂，日投喂量为虾总体质量的5%，并根据摄食情况略有调整。每日清除残饵与粪便。养殖水温(26±1)℃，盐度29±0.5，氨氮＜0.3 mg/L，pH为7.7~7.9，溶解氧>6 mg/L。实验期间每组对虾的存活率在96.67%~100%之间。
1.2 实验饲料实验饲料由海林生物饲料有限公司的基础饲料(主要原料组成为面粉、菜粕、大豆卵磷脂、豆粕、虾粉、鱼粉、啤酒酵母粉)和巴斯夫有限公司的虾青素添加剂(纯度10%)组成。称取500 g凡纳滨对虾基础饲料(粉末状)，分次加入100 mL水混匀，搅拌成团后经压条、造粒处理，于45 ℃烘干过夜，所得饲料作为对照组。实验组饲料的配制：在500 g基础饲料中添加20、40和60 mg虾青素(饲料中虾青素浓度依次为40、80和120 mg/kg)，充分混合均匀后，参照上述压条烘干工艺处理。所有饲料干燥后密封，置于-20 ℃条件下保存，备用。
1.3 样品的采集与制备投喂饲养结束后，将凡纳滨对虾禁食24 h，逐尾捞出后除去表皮水分，分别采集眼柄、腹神经索、肝胰腺、肠道、表皮、胃及肌肉组织，称重后迅速置于液氮中速冻，后保存于-80 ℃超低温冰箱中。实验时将采集的冷冻样品转移至真空冷冻干燥机中进行脱水处理至恒重后，于低温条件下研磨成均匀粉末，继续冷藏备用，用于虾青素含量测定。肝胰腺样品按1∶9(g/mL)加入0.86%预冷生理盐水匀浆，于4 ℃、2 500 r/min离心10 min，收集上清液用于酶活性分析。
1.4 溶液的配制选取甲醇、四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1，v/v)、甲醇-乙腈(1∶3，v/v)和甲基叔丁基醚作为溶剂，均添加1%(w/v)抗氧化剂2, 6-二叔丁基对甲酚(BHT)，配制虾青素标准品溶液。准确称取5 mg虾青素标准品，使用二甲基亚砜(DMSO)配制成2 mg/mL的储备液，于4 ℃避光保存备用。使用上述溶剂体系梯度稀释储备液，制备78.1、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000和20 000 ng/mL的标准溶液。
1.5 凡纳滨对虾组织中色素的萃取方法称取适量冻干组织粉末，按1∶25~1∶50(mg/μL) 的比例加入含1% BHT的有机溶剂，振荡混匀后进行10 min超声破碎。随后在4 ℃、13 000 r/min下离心10 min，收集上清液。将上清液在氮气流下浓缩，并用等体积含1% BHT的溶剂复溶，最后通过0.22 μm微孔滤膜过滤杂质。
1.6 色谱分析条件使用HPLC对凡纳滨对虾组织中的虾青素进行定量分析。色谱分离使用柱长×内径为4.6 mm×150 mm、粒径为3 μm的C30色谱柱，柱温28 ℃。流动相A相为甲醇与乙腈的混合液(1∶3，v/v)，其中加入0.1% BHT和0.1%甲酸；流动相B相为甲基叔丁基醚，含有0.1% BHT。采用等度洗脱模式，流速设定为0.8 mL/min，进样体积为5 μL，检测波长为470 nm。
1.7 Lab色彩分析每组随机挑选6尾凡纳滨对虾，擦干其体表水分，随后，将对虾放置在白色背景的观察板上，使用相机拍摄全身图像，用于后续的机器视觉分析。图片分析条件如下：使用Python 3.10编写机器视觉分析脚本，采用PIL库提取图像的RGB值，并通过pyod模块中的ECOD模型对RGB数据进行清洗，利用Colormath库转换色彩空间，Openpyxl库色彩信息数据存储于Excel。使用Prism软件进行数据分析(显著性水平P＜0.05)，并利用Matplotlib库进行数据可视化[17]。
1.8 抗氧化与免疫酶活的测定采用BCA蛋白浓度测定法对肝胰腺匀浆液中的蛋白质浓度进行定量分析。检测总抗氧化能力(Total antioxidant capacit，T-AOC)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，酶活指标检测步骤按照南京建成生物检测试剂盒说明书进行。
1.9 数据分析与处理| $ \text { 变异系数 }(\mathrm{CV})=(\text { 标准差/平均值 }) \times 100 \% \text { ；} $ |
| $ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;\;准确性(\text{RE}) = (测定值 - 真实值)/真实值 \times \\ 100\% ; \end{array} $ |
| $ \text { 回收率 }=\text { 回收量/加入量 } \times 100 \% \text { 。} $ |
实验中记录的数据使用Graphpad Prism 10.1软件进行处理，实验数据以平均值±标准差(Means±SD)表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析，并采用Tukey法进行多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果 2.1 虾青素提取方法的选择与优化本研究采用对比实验，评估多种有机溶剂对凡纳滨对虾肝胰腺中虾青素的萃取效果。结果表明，甲醇萃取液色泽最深，萃取效率优于四氢呋喃和丙酮，且后两者萃取后的组织残留色素较为明显。乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯及正己烷萃取能力较弱；氯仿因密度大导致组织残渣难以分离，甲酸腐蚀裂解组织，几乎无法有效提取组织中的虾青素(见图 1)。
|
( 从左到右依次为：甲醇、四氢呋喃、丙酮、氯仿、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷、甲酸。From left to right: methanol, tetrahydrofuran, acetone, chloroform, acetonitrile, methyl tert-butyl ether, ethyl acetate, hexane, formic acid. ) 图 1 不同有机溶剂萃取凡纳滨对虾肝胰腺中虾青素的效果 Fig. 1 Extraction of astaxanthin from the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei different organic solvents |
全光谱扫描(230~980 nm)结果显示，除甲酸外，所有溶剂在470~480 nm范围内均出现虾青素特征吸收峰，其中甲醇在范围内峰值最高(470 nm，1.227)，丙酮次之(475 nm，0.911)，其余溶剂的峰值均低于丙酮。由于丙酮相较于甲醇具有更强的挥发性，综合考虑萃取性能、稳定性及重现性，甲醇被确定为最适合虾青素提取的溶剂(见表 1)。
|
表 1 各溶剂萃取液中虾青素吸光度及峰值 Table 1 Absorbance and peak value of astaxanthin in each solvent extraction solution |
为优化组织虾青素的提取效率，研究系统探讨了固液比和提取次数对萃取效果的影响。选择甲醇作为萃取溶剂，进行三次连续提取实验，结果显示，20 mg冻干粉(固液比为1∶25)的首次提取占比最高，占三次提取总量的90.33%。随着提取次数的增加，虾青素提取量逐渐降低，第二次提取量占总提取量的8.28%~16.41%，第三次仅占总提取量的1.39%~2.13%。
鉴于腹神经索和肠道等小克重组织的限制，进一步对10 mg冻干粉(固液比为1∶50)进行了提取实验。结果显示，首次提取量约为第二次提取量的19倍，第三次提取因虾青素峰面积过低未做分析。肌肉中虾青素含量较低，检测误差较大。与20 mg冻干粉相比，10 mg冻干粉的初次提取效率更高，说明更低的固液比有利于溶剂渗透并有效溶出色素成分。因此，选择固液比为1∶50的10 mg组织冻干粉进行单次提取，可实现虾青素的高效萃取(见图 2)。
|
( ES: 眼柄; ST: 胃; VN: 腹神经索; IN: 肠道; EP: 表皮; HP: 肝胰腺; MS: 肌肉。下同。ES: Eyestalk; ST: Stomach; VN: Ventral nerve cord; IN: Intestine; EP: Epidermis; HP: Hepatopancreas; MS: Muscle. The same applies to subsequent figures and tables. ) 图 2 不同固液比虾青素提取效率随提取次数的变化 Fig. 2 Variation of astaxanthin extraction efficiency with the number of extractions for different solid-liquid ratios |
为验证方法的有效性与特异性，对纯甲醇、虾青素标准品溶液及不同组织甲醇萃取液进行色谱分析。结果显示，虾青素标准品在6.709 min处出现清晰特征峰(见图 3b)，腹神经索萃取液在6.710 min处出现对应峰值(见图 3c)，表明该方法可准确检测组织中虾青素。肌肉萃取液色谱图与纯甲醇图谱基本一致(见图 3d)，说明其虾青素含量低于方法检测限，无法有效定量。上述结果验证了该方法具备良好的灵敏度和可行性，能有效区分不同组织中虾青素的含量水平。
|
( a：甲醇纯溶剂；b：甲醇溶解虾青素标准品；c：甲醇萃取腹神经索中虾青素；d：甲醇萃取肌肉中虾青素。a: Methanol pure solvent; b: Methanol dissolution of astaxanthin standard; c: Methanol extraction of astaxanthin from abdominal nerve cord; d: Methanol extraction of astaxanthin from muscle. ) 图 3 甲醇溶解不同样品的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of different samples dissolved in methanol |
实验评估了多种有机溶剂对虾青素标准品溶解性能的影响，并建立了标准曲线进行线性分析。结果显示，在78.1~20 000.0 ng/mL范围内，乙腈与甲基叔丁基醚的拟合度较低，R2分别为0.885 1和0.917 1，线性关系不理想。甲醇及其与乙腈的混合体系虽表现出一定线性，但R2仍低于THF。相比之下，THF作为溶剂时，回归方程为y=0.001 04x-0.006 63，R2=0.999 97，拟合效果最佳，且背景干扰极小。因此，THF被确定为绘制虾青素标准曲线的最优溶剂(见表 2)。
|
|
表 2 虾青素在不同溶剂体系中的标准曲线 Table 2 Standard calibration curves of astaxanthin in various solvent systems |
尽管甲醇在组织样品中表现出良好的虾青素萃取能力，但其作为标准品溶剂的稳定性不如THF。为评估二者在定量分析中的表现，分别以甲醇和THF配制5 μg/mL的虾青素标准品，进行10次重复测定。结果显示，甲醇组均值为6.465 9，标准差为1.946 8，CV为30.11%，重复性较差；准确性(RE)范围为－7.34%~ 52.63%，误差波动显著。相较而言，THF组均值为5.158 2，标准差为0.129 4，CV仅为2.51%，RE范围集中在－1.03%~7.97%，表现出更高的精密度与准确性。因此，THF更适合作为虾青素标准品定量检测的溶剂(见表 3)。
|
|
表 3 甲醇和THF配制5 μg/mL虾青素标准品的重复性实验 Table 3 Repeatability experiment of methanol and THF for preparing 5 μg/mL astaxanthin standard solution |
鉴于甲醇在组织虾青素提取中的高效性及THF在标准品配制中的稳定性，本研究采用氮吹复溶工艺进行方法优化：首先以甲醇萃取组织样品中的虾青素，随后通过氮气吹干并以等体积THF复溶，提升方法整体稳定性。为验证该方法的可行性，采用10份等量(10 mg)组织冻干粉进行重复性测试。每份样品的甲醇萃取液一分为二，一组直接进行HPLC检测(重复三次)，另一组经氮吹复溶后检测。结果显示，甲醇直接检测组虾青素含量为(3 960.60±426.75)ng/mL，CV为10.77%；氮吹复溶组含量为(3 664.04±373.05)ng/mL，CV为10.18%，两组差异不显著(P>0.05)。同时，复溶组回收率为86.47%~96.70%，表明氮吹复溶过程对虾青素的损失影响较小，适用于虾青素的定量检测(见表 4)。
|
|
表 4 氮吹复溶方法稳定性实验 Table 4 Stability experiment of nitrogen |
对凡纳滨对虾进行不同浓度虾青素的投喂实验，基于建立的定量方法，对组织中的虾青素含量进行定量分析。结果显示，除肌肉组织外，其余组织均检测到虾青素，其中腹神经索、肝胰腺与表皮为主要富集部位。随着饲料中虾青素浓度的增加，各组织虾青素含量普遍呈上升趋势，表现出一定的剂量依赖性。腹神经索中虾青素含量在80 mg/kg组达到最高值，而表皮、胃和肠道在120 mg/kg组达峰值，其中胃在最高浓度下与对照组差异显著(P＜0.05)，肠道在40 mg/kg时即有显著差异，各实验组间差异不显著。肝胰腺和眼柄中虾青素积累趋势不明显，可能归因于其代谢调控机制复杂及个体差异、环境因素干扰。综上，腹神经索、肝胰腺和表皮是虾青素富集的主要器官，其虾青素含量显著高于其他组织(见图 4)。
|
( ES: 眼柄; ST: 胃; IN: 肠道; VN: 腹神经索; EP: 表皮; HP: 肝胰腺。字母不同代表有显著性差异(P＜0.05)。ES: Eyestalk; ST: Stomach; IN: Intestine; VN: Ventral nerve cord; EP: Epidermis; HP: Hepatopancreas. Different letters represent significant differences (P < 0.05). ) 图 4 游离虾青素在凡纳滨对虾各组织中的分布 Fig. 4 Distribution of free astaxanthin in various tissues of Litopenaeus vannamei |
基于同一剂量条件下的虾青素组织分布分析结果显示，虾青素在实验生物体内呈现显著的组织特异性分布模式。定量检测表明，腹神经索、表皮及肝胰腺组织表现出显著的虾青素富集现象。相比之下，眼柄、胃组织及肠道中的虾青素含量相对较低(见图 5)。
|
( ES: 眼柄; ST: 胃; IN: 肠道; VN: 腹神经索; EP: 表皮; HP: 肝胰腺。字母不同代表有显著性差异(P＜0.05)。ES: Eyestalk; ST: Stomach; IN: Intestine; VN: Ventral nerve cord; EP: Epidermis; HP: Hepatopancreas. Different letters represent significant differences(P < 0.05). ) 图 5 同一剂量条件下虾青素的组织分布 Fig. 5 Tissue distribution of astaxanthin under consistent dosage |
图像分析结果显示，随饲料中虾青素浓度升高，凡纳滨对虾体表颜色呈现逐渐加深的趋势。基于LAB色彩空间模型对L*(亮度)、a*(红绿色度)和b*(黄蓝色度)参数进行量化分析。结果显示：L*呈下降趋势，提示体表亮度降低，色泽饱和度增强；a*随虾青素浓度增加而呈升高趋势，提示虾青素促进体色向红橙方向转变；b*值在各组间未观察到显著变化趋势，表明其对黄蓝色度影响有限(见图 6)。
|
( L*：亮度Lightness；a*：红绿色度Red/green color channel；b*：黄蓝色度Yellow/blue color channel. ) 图 6 虾青素投喂对凡纳滨对虾体色的影响 Fig. 6 Effect of dietary astaxanthin on body color of Litopenaeus vannamei |
实验结果表明，饲料中不同浓度的虾青素对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化及免疫相关酶活性产生显著影响。喂食80 mg/kg虾青素组的T-AOC水平显著提高(P＜0.05)，而40和120 mg/kg组未见显著差异。与对照组相比，虾青素饲料显著提高了CAT活性，且随着虾青素浓度的增加，CAT活性逐渐上升。40和80 mg/kg的虾青素投喂组CAT活性有所升高，但与对照组差异不显著；在120 mg/kg组中，CAT活性达到最高值(P＜0.05)。SOD活性也随着虾青素浓度升高而增加，80和120 mg/kg组表现出较高的活性，表明高浓度虾青素对SOD活性的提升效果更为显著。MDA含量在虾青素投喂后显著下降，40 mg/kg组即已显著抑制脂质过氧化(P＜0.05)，但更高浓度的虾青素对MDA的进一步降低作用不显著。AKP活性随虾青素浓度增加而逐渐提升，80 mg/kg组达到最高水平，显示出剂量依赖性，且在较高浓度下可能接近饱和状态。GSH-Px活性在80 mg/kg组最高，120 mg/kg组略有下降，但仍高于对照组(见图 7)。
|
( 字母不同代表有显著性差异(P＜0.05)。Different letters represent significant differences(P < 0.05). ) 图 7 不同虾青素添加水平对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化与免疫指标的影响 Fig. 7 Effects of different dietary astaxanthin levels on antioxidant and immune parameters in the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei |
目前，虾青素的提取主要依赖于有机溶剂萃取法，其中甲醇因其高效的提取能力而被广泛应用[18]。冷冻干燥后的组织细胞处于无水状态，加入有机溶剂后更易破壁，从而使得虾青素更高效地扩散至有机溶剂中，提取效果更佳。在萃取溶剂的选择方面，甲醇在组织虾青素萃取中表现出更高的提取效率，这可能与其极性和溶解能力相关，甲醇能够有效破坏细胞膜并释放虾青素。四氢呋喃(THF)在色谱定量分析中展现了优异的稳定性和重复性，这主要归因于其良好的化学稳定性和对虾青素的高溶解性[18]。因此，选择氮气吹扫浓缩甲醇后使用THF复溶的方法，不仅能够在组织中高效萃取虾青素，还能通过拟合度较高的THF标准曲线，准确定量出各个组织中的虾青素浓度。由于定量分析所用溶剂与氮吹复溶后所用溶剂相同，因此减少了溶剂转换过程中可能带来的系统误差和样品损失，从而进一步提高了分析结果的准确性和可靠性。相较于20 mg组织冻干粉的多次提取，10 mg样品的初次提取效率更高(约95%)，这可能是由于较小样品量有利于溶剂充分渗透和有效成分的完全溶出。这一优化不仅减少了实验时间和成本，还降低了多次提取可能引入的杂质干扰，进一步提高了提取液的纯度。本研究在不同组织中验证方法的可行性，获得了可靠的实验结果，为后续虾青素投喂实验及组织中虾青素含量的测定提供了参考。
3.2 膳食虾青素在凡纳滨对虾组织中的分布肝胰腺中检测到较高的虾青素含量，可能由多种因素共同导致。肝胰腺作为甲壳类动物的重要代谢和解毒器官，其高虾青素含量可能与虾青素在抗氧化、免疫调节及细胞保护等方面的生物学功能密切相关[19]。虾青素可通过调节相关基因表达，增强肝胰腺的抗氧化免疫功能，提高SOD、CAT、AKP、GSH-Px的酶活性，增强机体防御能力[20-22]；此外，它还能调控脂质代谢相关基因，维持肝胰腺代谢稳态，并减少氧化型低密度脂蛋白的形成，进一步保护肝胰腺细胞[23-26]。表皮组织中的高虾青素含量可能涉及多种生理生态因素。凡纳滨对虾的表皮作为一个多功能的防御屏障，还在免疫机制等方面保护机体免受外界环境的威胁。虾青素与表皮在抵御外界环境压力中的保护作用相关，虾青素通过其强大的抗氧化能力，能够有效中和紫外线诱导产生的活性氧，从而增强表皮的防御功能[27]。虾青素还可以与特定蛋白质(如CRCN)结合形成稳定的色素复合物，这种结合作用是凡纳滨对虾呈现其典型体色的关键机制[28-29]。腹神经索是虾青素富集的重要部位之一，这提示虾青素可能在神经保护和抗氧化应激中发挥重要作用。研究表明，神经系统对氧化应激高度敏感，而虾青素在哺乳动物中能够穿过血脑屏障，在神经组织中发挥抗氧化和抗炎作用[30]。这一发现为探索虾青素在甲壳类动物神经保护中的潜在应用提供了新的思路。胃作为初级消化器官，其虾青素含量随投喂浓度增加而持续上升，反映了其对虾青素的逐步积累过程。肠道作为营养物质吸收的主要部位，在较低浓度下即表现出显著的虾青素积累能力，这可能与其高效的吸收转运机制有关，此外，肠道中丰富的微生物群落可能也参与了虾青素的代谢过程，从而影响其积累效率[31-32]。
3.3 膳食虾青素对凡纳滨对虾体色的影响虾青素因其卓越的抗氧化特性和显著的着色效果而备受关注，不仅在医药领域被开发为重要的保健品，还广泛应用于水产养殖业中，以增强甲壳动物鲜艳的体色[33]。甲壳动物体色的形成离不开类胡萝卜素，但其不能自身合成，必须依赖外源性物质的供给。本研究以不同浓度的虾青素饲料进行投喂，探究虾青素对凡纳滨对虾体色的改善作用。在实验结束后对对照组和实验组个体进行体色观察，结果表明，与对照组相比，添加高浓度虾青素的实验组个体体色更深，这一变化趋势在Lab色彩空间分析中也得到了量化体现。在研究虾青素对斑节对虾的影响中发现，不同来源的虾青素均能显著提高肝胰腺和表皮中虾青素的沉积量，且实验组甲壳和肌肉的a*值较对照组显著升高(P＜0.05)[23-34]。这些研究结果与本研究中凡纳滨对虾摄食虾青素后的体色变化趋势一致。
3.4 虾青素对凡纳滨对虾抗氧化及免疫酶活性的影响虾青素是对虾体内主要的类胡萝卜素，具备显著的抗氧化和免疫调节能力，其主要通过调控关键酶的活性来维持机体稳态[35-38]。甲壳类动物的肝胰腺是一个多功能器官，在机体的代谢、抗氧化及免疫等过程中起着至关重要的作用[39-40]。在抗氧化方面，虾青素可有效激活SOD和CAT等内源性抗氧化酶，增强自由基清除效率，减少脂质过氧化损伤。尤其在肝胰腺组织中，虾青素通过提高T-AOC、SOD和CAT等酶的活性，降低MDA含量，构建起抗氧化防御屏障[41-43]。此外，机体抗氧化水平不仅受酶活性调控，还可能与其他抗氧化因子的协同效应密切相关。综合来看，虾青素通过调节抗氧化系统，有效缓解了肝胰腺的氧化应激状态，提升了整体抗氧化能力[44]。与此同时，其对免疫系统的调节作用也同样显著。AKP作为非特异性免疫的标志酶，在机体抗感染过程中起到信号转导和炎症调控作用；而GSH-Px则通过清除氧化产物并维持GSH水平，参与免疫细胞的分化与增殖[45-46]。研究表明，虾青素在适宜剂量(如80 mg/kg)下，可以提升AKP与GSH-Px的活性，显示其对免疫相关酶系统具有正向调节效应。然而，酶活性的提升在高剂量条件下趋于平稳，提示虾青素的调控作用存在剂量阈值，机体的免疫应答能力可能会在一定浓度后达到饱和。综上，虾青素通过激活抗氧化与免疫相关酶类，协同增强凡纳滨对虾的氧化防御与免疫反应，是提升其健康状态的重要营养调节因子。
4 结语本文建立了基于“甲醇萃取-四氢呋喃复溶”联用技术分析凡纳滨对虾组织中虾青素标准化分析方法。该方法通过甲醇高效萃取组织中的虾青素，再经四氢呋喃复溶处理，显著提高了检测灵敏度，具有操作简便、重复性好的优势。15 d投喂实验结果显示，虾青素在对虾不同组织中呈现明显的梯度积累特征，其中腹神经索、肝胰腺和表皮的富集能力最强，表明这些组织对虾青素具有较高的吸收和储存能力。实验同时观察到饲料中添加虾青素能够改善对虾体色，提升对虾抗氧化和免疫性能。本研究不仅提供了可靠的虾青素检测方法，还明确了虾青素在凡纳滨对虾体内的主要分布规律。
| [1] |
Ambati R R, Phang S M, Ravi S, et al. Astaxanthin: Sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applications—a review[J]. Marine Drugs, 2014, 12(1): 128-152. DOI:10.3390/md12010128 (  0) |
| [2] |
Routray W, Dave D, Cheema S K, et al. Biorefinery approach and environment-friendly extraction for sustainable production of astaxanthin from marine wastes[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2019, 39(4): 469-488. DOI:10.1080/07388551.2019.1573798 ( 0) |
| [3] |
Huang X G, Zhang W, Sun J X, et al. Research progress of the structure, function, extraction and analysis of astaxanthin[J]. Science & Technology of Food Industry, 2009(4): 355-359. ( 0) |
| [4] |
杨霞, 张志胜, 郑乾魏, 等. 超临界CO2萃取南美白对虾虾青素的工艺优化[J]. 农业工程学报, 2013, 29(增1): 294-300. Yang X, Zhang Z S, Zheng Q W, et al. Optimization of supercritical CO2 extraction of astaxanthin from pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) using response surface methodology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2013, 29(Sup.1): 294-300. ( 0) |
| [5] |
Sharayei P, Azarpazhooh E, Zomorodi S, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of astaxanthin from green tiger (Penaeus semisulcatus) shrimp shell[J]. Ultrason Sonochem, 2021, 76: 105666. DOI:10.1016/j.ultsonch.2021.105666 ( 0) |
| [6] |
肖小华, 王家玥, 李攻科. 微波辅助萃取虾中虾青素的研究[C]. 广州: 第四届广东省分析化学研讨会, 2010: 3. Xiao X H, Wang J Y, Li G K. Studyon the Extraction of Astaxanthin from Shrimp by Microwave-Assisted Extraction Method[C]. Guangzhou: Journal of Instrumental Analysis, 2010: 3. ( 0) |
| [7] |
姜淼, 杨贤庆, 李来好, 等. 内源酶辅助提取虾壳虾青素的研究[J]. 南方水产科学, 2011, 7(2): 55-60. Jiang M, Yang X Q, Li L H, et al. Applicationof endogenous enzymes in astaxanthin extraction from shrimp shell[J]. South China Fisheries Science, 2011, 7(2): 55-60. ( 0) |
| [8] |
陈晋明, 王世平, 陈敏. 反相高效液相色谱法检测虾青素[J]. 化学分析计量, 2006(2): 27-29. Chen J M, Wang S P, Chen M. Determination ofastaxanthin by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2006(2): 27-29. ( 0) |
| [9] |
应国清, 王晓艳, 沈寅初. 高效液相色谱法分析检测虾青素[J]. 食品与发酵工业, 2001(11): 43-44. Ying G Q, Wang X Y, Shen Y C. The determination of astaxanthin by high performance liquidchromatography[J]. Food and Fermentation Industries, 2001(11): 43-44. ( 0) |
| [10] |
刘志东, 马德蓉, 陈雪忠, 等. 南极磷虾虾青素研究进展[J]. 大连海洋大学学报, 2021, 36(5): 866-874. Liu Z D, Ma D R, Chen X Z, et al. Research progress of astaxanthin from Antarctic krill: A review[J]. Journal of Dalian Ocean University, 2021, 36(5): 866-874. ( 0) |
| [11] |
王彩理, 王淑夏, 于爱美, 等. 凡纳滨对虾产业发展和质量安全控制[J]. 中国渔业质量与标准, 2022, 12(6): 50-55. Wang C L, Wang S X, Yu A M, et al. Industry development and quality safety control of Penaeus vannamei[J]. Chinese Fisheries Quality and Standards, 2022, 12(6): 50-55. ( 0) |
| [12] |
Zagalsky P. β-Crustacyanin, the blue-purple carotenoprotein of lobster carapace: Consideration of the bathochromic shift of the protein-bound astaxanthin[J]. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 2003, 59(8): 1529-1531. DOI:10.1107/S0907444903013416 ( 0) |
| [13] |
Zhang J, Liu Y J, Tian L X, et al. Effects of dietary astaxanthin on growth, antioxidant capacity and gene expression in Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture Nutrition, 2013, 19(6): 917-927. DOI:10.1111/anu.12037 ( 0) |
| [14] |
Eldessouki E a A, Diab A M, Selema T a M A, et al. Dietary astaxanthin modulated the performance, gastrointestinal histology, and antioxidant and immune responses and enhanced the resistance of Litopenaeus vannamei against Vibrio harveyi infection[J]. Aquaculture International, 2022, 30(4): 1869-1887. DOI:10.1007/s10499-022-00876-w ( 0) |
| [15] |
Niu J, Tian L X, Liu Y J, et al. Effect ofdietary astaxanthin on growth, survival, and stress tolerance of postlarval shrimp, Litopenaeus vannamei[J]. Journal of the World Aquaculture Society, 2009, 40(6): 795-802. DOI:10.1111/j.1749-7345.2009.00300.x ( 0) |
| [16] |
Chuchird N, Rorkwiree P, Rairat T. Effect of dietary formic acid and astaxanthin on the survival and growth of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) and their resistance to Vibrio parahaemolyticus[J]. Springerplus, 2015, 4: 440. DOI:10.1186/s40064-015-1234-x ( 0) |
| [17] |
Zhang J, Du Y, Sun Y, et al. Exploring the dietary impacts and potential metabolic mechanisms of astaxanthin in common carp (Cyprinus carpio)[J]. Food Chem, 2025, 465(2): 142069. ( 0) |
| [18] |
López-Cervantes J, Sánchez-Machado D I, Gutiérrez-Coronado M A, et al. Quantification of astaxanthin in shrimp waste hydrolysate by HPLC[J]. Biomedical Chromatography, 2006, 20(10): 981-984. DOI:10.1002/bmc.676 ( 0) |
| [19] |
Sowmya P R, Arathi B P, Vijay K, et al. Astaxanthin from shrimp efficiently modulates oxidative stress and allied cell death progressionin MCF-7 cells treated synergistically with beta-carotene and lutein from greens[J]. Food Chem Toxicol, 2017, 106(Pt A): 58-69. ( 0) |
| [20] |
Gross P S, Bartlett T C, Browdy C L, et al. Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, and the Atlantic white shrimp, L. setiferus[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2001, 25(7): 565-577. DOI:10.1016/S0145-305X(01)00018-0 ( 0) |
| [21] |
Liu Y C, Zheng L, Xu B Y, et al. Effects of diets with varying astaxanthin from Yarrowia lipolytica levels on the growth, feed utilization, metabolic enzymes activities, antioxidative status and serum biochemical parameters of Litopenaeus vannamei[J]. Fishes, 2022, 7(6): 12. ( 0) |
| [22] |
Liu L, Li J, Cai X, et al. Dietary supplementation of astaxanthin is superior to its combination with Lactococcus lactis in improving the growth performance, antioxidant capacity, immunity and disease resistance of white shrimp (Litopenaeus vannamei)[J]. Aquaculture Reports, 2022, 24: 101124. DOI:10.1016/j.aqrep.2022.101124 ( 0) |
| [23] |
Yang M, Wang B, Liu M, et al. Resource tradeoff between coloring and antioxidation of astaxanthin in Litopenaeus vannamei under salinity stress[J]. Marine Sciences, 2023, 47(10): 32-42. ( 0) |
| [24] |
Quintana-López A, Hurtado-Oliva M A, Manzano-Sarabia M, et al. Effect of rearing conditions on astaxanthin accumulation in the white shrimp Penaeus vannamei (Boone, 1931)[J]. Latin American Journal of Aquatic Research, 2019, 47(2): 303-309. DOI:10.3856/vol47-issue2-fulltext-10 ( 0) |
| [25] |
Wu Y, Xu B, Liu J, et al. Dietaryastaxanthin on hepatopancreas lipid metabolism and ovarian development of female Litopenaeus vannamei[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2024, 48(1): 99-108. ( 0) |
| [26] |
Yaqoob Z, Arshad M S, Imran M, et al. Mechanistic role of astaxanthin derived from shrimp against certain metabolic disorders[J]. Food Science & Nutrition, 2022, 10(1): 12-20. ( 0) |
| [27] |
Menasveta P, Worawattanamateekul W, Latscha T, et al. Correction of black tiger prawn (Penaeus monodon fabricius) coloration by astaxanthin[J]. Aquacultural Engineering, 1993, 12(4): 203-213. DOI:10.1016/0144-8609(93)90012-Z ( 0) |
| [28] |
Ma H K, Sun J Q, Xu W Y, et al. Cloning and functional study of lipocalin: Retinol-binding protein-like gene family of the ridgetail white prawn, Exopalaemon carinicauda[J]. Molecular Genetics and Genomics, 2020, 295(2): 453-464. DOI:10.1007/s00438-019-01633-0 ( 0) |
| [29] |
Chayen N E, Cianci M, Grossmann J G, et al. Unravelling the structural chemistry of the colouration mechanism in lobster shell[J]. Acta Crystallographica Section D—Structural Biology, 2005, 61: 1312. DOI:10.1107/S0907444905019621 ( 0) |
| [30] |
Wang S, Qi X. The putative role of astaxanthin in neuroinflammation modulation: Mechanisms and therapeutic potential[J]. Frontiers in Pharmacology, 2022, 13: 916653. DOI:10.3389/fphar.2022.916653 ( 0) |
| [31] |
Tang H, Bai Y, Xu J, et al. Effects of Haematococcus pluvialis powder on growth performance, astaxanthin deposition and intestinal health of Penaeus monodon[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2024, 36(9): 5910-5923. ( 0) |
| [32] |
Cao H Z, Chen D D, Guo L F, et al. Effects of Bacillus subtilis on growth performance and intestinal flora of Penaeus vannamei[J]. Aquaculture Reports, 2022, 23: 101070. DOI:10.1016/j.aqrep.2022.101070 ( 0) |
| [33] |
Zhang Y, Qian C, Huang J, et al. Suitable natural astaxanthin supplementation with Haematococcus pluvialis improves the physiological function and stress response to air exposure of juvenile red swamp crayfish (Procambarus clarkii)[J]. Aquaculture, 2023, 573: 739577. DOI:10.1016/j.aquaculture.2023.739577 ( 0) |
| [34] |
Huang S, Chen Q, Zhang M, et al. Synthetic astaxanthin has better effects than natural astaxanthins on growth performance, body color and n-3 PUFA deposition in black tiger prawn (Penaeus monodon)[J]. Aquaculture Reports, 2023, 33: 101816. DOI:10.1016/j.aqrep.2023.101816 ( 0) |
| [35] |
Pan C H, Chien Y H, Hunter B. The resistance to ammonia stress of Penaeus monodon Fabricius juvenile fed diets supplemented with astaxanthin[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2003, 297(1): 107-118. DOI:10.1016/j.jembe.2003.07.002 ( 0) |
| [36] |
Chien Y H, Pan C H, Hunter B. The resistance to physical stresses by Penaeus monodon juveniles fed diets supplemented with astaxanthin[J]. Aquaculture, 2003, 216(1-4): 177-191. DOI:10.1016/S0044-8486(02)00056-X ( 0) |
| [37] |
Lesser M P. Oxidative stress in marine environments: Biochemistry and physiological ecology[J]. Annual Review of Physiology, 2006, 68: 253-278. DOI:10.1146/annurev.physiol.68.040104.110001 ( 0) |
| [38] |
Babin A, Saciat C, Teixeira M, et al. Limiting immunopathology: Interaction between carotenoids and enzymatic antioxidant defences[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2015, 49(2): 278-281. ( 0) |
| [39] |
Vogt G. Functional cytology of the hepatopancreas of decapod crustaceans[J]. Journal of Morphology, 2019, 280(9): 1405-1444. DOI:10.1002/jmor.21040 ( 0) |
| [40] |
Vogt G. Cytopathology and immune response in the hepatopancreas of decapod crustaceans[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2020, 138: 41-88. DOI:10.3354/dao03443 ( 0) |
| [41] |
Li C, Ni D, Song L, et al. Molecular cloning and characterization of a catalase gene from Zhikong scallop Chlamys farreri[J]. Fish Shellfish Immunol, 2008, 24(1): 26-34. DOI:10.1016/j.fsi.2007.06.010 ( 0) |
| [42] |
Wu F J, Xue Y, Liu X F, et al. The protective effect of eicosapentaenoic acid-enriched phospholipids from sea cucumber Cucumaria frondosa on oxidative stress in PC12 cells and SAMP8 mice[J]. Neurochemistry International, 2014, 64: 9-17. DOI:10.1016/j.neuint.2013.10.015 ( 0) |
| [43] |
Vijayavel K, Kashian D R. Toxic effect and physiological disruption of sodium phosphate to the quagga mussel (Dreissena bugensis)[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2019, 26(2): 1576-1583. DOI:10.1007/s11356-018-3720-5 ( 0) |
| [44] |
Valko M, Leibfritz D, Moncol J, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell biology, 2007, 39(1): 44-84. ( 0) |
| [45] |
Lu H, Jin J, Fan H, et al. The magnitude of incubation temperature fluctuation affects the immunity of Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis) hatchlings[J]. Aquaculture Research, 2021, 52(11): 5229-5238. DOI:10.1111/are.15391 ( 0) |
| [46] |
Pastore A, Federici G, Bertini E, et al. Analysis of glutathione: Implication in redox and detoxification[J]. Clinica Chimica Acta, 2003, 333(1): 19-39. DOI:10.1016/S0009-8981(03)00200-6 ( 0) |
2. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China