2026, Vol. 56
2. 辽宁葫芦岛市绥中县渔业事务服务中心, 辽宁 葫芦岛 125200
水产养殖是我国重要的经济产业之一。然而，随着养殖规模的扩大和养殖密度的提高，养殖尾水造成的氮污染问题日益受到关注[1]。养殖水体中过量积累的氮素形态主要包括氨氮、硝态氮和亚硝态氮。这些含氮污染物不仅对养殖生物造成毒害，其对周边环境的负面影响也已成为制约水产养殖可持续发展的关键因素[2-3]。生物脱氮被认为是一种效果显著且成本较低的氮污染治理方法，近年来相关研究快速发展，尤其是在脱氮微生物方面的研究也日益增多[4]。传统的生物脱氮过程通常包括好氧硝化与厌氧反硝化两个独立步骤。由于这两个反应阶段所需的菌群和环境条件不同，导致传统脱氮工艺较为复杂，从而限制了其广泛应用[5]。自1983年Robertson[6]首次发现并分离出好氧反硝化菌以来，大量关于有氧条件下微生物可进行反硝化作用的研究报道打破了人们认为反硝化作用只能发生在无氧或厌氧条件下的固有观点[7]。已有研究表明，部分芽孢杆菌具有高效的异养硝化-好氧反硝化(Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HN-AD)能力，且其脱氮效率较高[8]，反应过程无需分设好氧和厌氧区域，能够在低成本的条件下高效去除养殖水体中过度积累的氮素。目前，研究人员已从不同环境中分离筛选出多株脱氮微生物，包括盐单胞菌(Halomonas sp.)DN3[9]、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii)L-11[10]、谷氨酸杆菌(Glutamicibacter arilaitensis)EM-H8 [11]和农杆菌(Agrobacterium sp.)LAD9[12]等。
研究表明，HN-AD菌株的氮去除机理主要包括同化和异化两部分，即通过同化作用将氮转化为有机氮，通过异化作用(硝化和反硝化)将铵盐、羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐逐步转化为气态氮(NO、N2O和N2)[9, 13-15]。1998年，Richardson等研究Thiosphaera pantotropha(后更名为全食副球菌Paracoccus pantotrophus)的氮转化途径时，提出HN-AD存在两条途径[16]。其中，一条是硝酸盐-亚硝酸盐还原(完全硝化-反硝化)途径[17]，即NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2。盐单胞菌5505[18]、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NP5[19]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A1[20]等HN-AD菌的脱氮途径遵循此途径；另一条是羟胺还原[9](不完全硝化-反硝化)途径，即NH4+→NH2OH→N2O/N2，氨氮可以直接通过NH2OH转化为含氮气体。盐单胞菌DN3[9]、枯草芽孢杆菌H1[8]、产碱菌(Alcaligenes sp.)HO-1[21]、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)No.4[22]、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)HNR[23]等菌株的脱氮途径遵循此途径。
对从活性污泥中分离出恶臭假单胞菌Y-1[24]，从集约化养殖海水中分离出的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)HA2[25]以及从海水鲈鱼养殖池塘底泥中分离出的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)F2[26]进行全基因组测序分析，揭示了这些菌株的氮转化相关基因组特征，从而为理解其硝化-反硝化功能提供了分子证据。
本研究以从黄海冷水团底泥中分离筛选出的一株莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)C3为研究对象，通过氮平衡分析、氨氧化抑制、同位素气体示踪实验探究了菌株的脱氮性能。同时，通过高通量测序技术对该菌株的全基因组进行分析，结合全基因组注释，探究了该菌株的氮转化路径，以全面揭示其脱氮机理。本研究旨在为解决养殖水体中氮污染问题提供一种高效、经济、环保的微生物治理方案，并为后续微生态制剂的研发提供理论依据，进而推动水产养殖业的可持续发展。
1 材料与方法 1.1 实验菌株和培养基所用菌株为分离自黄海冷水团底泥样品的芽孢杆菌C3，保存于中国海洋大学养殖生态实验室菌种资源库。菌株C3经16S rRNA基因序列测序(GenBank登记号：CP178596)及生理生化特性测试，初步鉴定为莫哈韦芽孢杆菌。
本研究所用培养基主要为以下5种。
2216E培养基：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉2.0 g，海水1 L，pH=7.5，121 ℃灭菌20 min；固体培养基需额外添加2.0%(W/V)琼脂粉。
异养硝化培养基(HNM)：葡萄糖1.040 g，NH4Cl 0.080 g，海水1 L，pH=8，115 ℃灭菌30 min。
亚硝酸盐反硝化培养基(NDM)：葡萄糖1.040 g，NaNO2 0.069 g，海水1 L，pH=8，115 ℃灭菌30 min。
硝酸盐反硝化培养基(DM)：葡萄糖1.040 g，NaNO3 0.128 g，海水1 L，pH=8，115 ℃灭菌30 min。
NH2OH-N培养基：葡萄糖1.040 g，氯化羟胺0.104 g，海水1 L，pH=8，115 ℃灭菌30 min。
1.2 菌株C3异养硝化-好氧反硝化性能菌株C3的异养硝化-好氧反硝化性能检测在28 ℃条件下进行。取对数生长期菌液，按5%(V/V)接种量分别接种于含100 mL不同氮源培养基(HNM、NDM和DM)的三角烧瓶中，以不添加菌液的测试瓶作对照，每组3个平行。然后将各处理置于恒温摇床连续振荡(180 r/min)培养72 h，每隔12 h取样测试。测试的指标主要包括细菌生长情况(OD600)、氨氮(NH4+-N)、亚硝态氮(NO2--N)、硝态氮(NO3--N)、羟胺态氮(NH2OH-N)和系统总氮(TNsys)浓度。
1.3 利用抑制法研究异养硝化的途径本研究在以NH4Cl为氮源的无菌HNM培养基中添加不同浓度的烯丙基硫脲(ATU)，进一步分析菌株C3的氨氧化过程。具体步骤如下：取对数期的菌液，按照5%(V/V)的接种量，将菌株C3接种于含有100 mL无菌HNM培养基的三角烧瓶中，分别添加不同浓度(0、20、50、70和100 mg/L)的ATU，每个实验组设置3个平行。在实验开始(0 h)和实验结束(72 h)测定培养基OD600、氮损失(Loss-N)和NH4+-N去除率。
在21 mg/L的NH2OH-N培养基中每隔12 h测定培养基OD600、总氮(TN)和NH2OH-N浓度。
1.4 15N同位素气体检测以分别添加15NH4Cl、Na15NO2和Na15NO3 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司)为氮源的HNM*、NDM*和DM*培养基为实验组，探究菌株C3脱氮后的最终含氮气体化合物。以不添加菌液的基础降解液作为对照组，每组实验3个平行。
取对数期的菌液，按照5%(V/V)的接种量，接种于含有100 mL的无菌HNM*、NDM*和DM*培养基的250 mL顶空瓶中，使用带可穿刺硅胶垫的开孔盖将顶空瓶密封，于温度28 ℃、转速180 r/min的恒温摇床连续培养72 h，实验结束后，用无菌医用注射器抽取顶空瓶上方气体至500 mL规格的气袋中密封保存，送至微泰克科技(深圳)有限公司测定样品的稳定同位素比值，分别检测N2O和N2中的15N与14N比率，计算d15N值，对比各实验组与相应对照组的d15N值。自然丰度表示为
| $ \mathrm{d}^{15} \mathrm{~N}=\left(R_{\text {样品 }} / R_{\text {标准 }}-1\right) \times 10^3 \text { 。} $ |
式中：R为15N/14N，分析精度为d15N＜0.3‰。
1.5 菌株C3全基因组测序分析使用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，严格按照操作说明书提取菌株C3的总DNA，将合格的DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行全基因组测序。通过二代(Illumina HiSeq)和三代(PacBio)测序技术相结合的方式，构建菌株C3文库以及进行数据质控。通过将组装完成的菌株C3序列与6个主要数据库进行BLAST比对，包括NR数据库、Swiss-Prot数据库、Pfam数据库、COG数据库、GO数据库、KEGG数据库。基于KEGG数据库，进一步构建了菌株C3的代谢通路模型。基因组完成图采用Circos软件进行绘制。
1.6 不同形态氮检测和计算方法氨氮、硝态氮和亚硝态氮分别采用靛酚蓝法、紫外分光光度法和磺胺-盐酸萘乙二胺法测定[27]。羟胺态氮(NH2OH-N)的测定采用分光光度法[28]；TNsys和上清液总氮(TNsn)分别取不离心和离心(8 000 r/min，10 min)菌液按照碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[27]进行测定。其他氮的计算公式如下：
| $ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;\;\;\;培养体系中溶解的有机氮(\text{Organic-N}) = \mathrm{TN}_{\mathrm{sn}} - \\ \text { TIN（总无机氮）}{ }^{[29]}; \end{array} $ |
| $ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;\;生物氮(\text{Biomass-N}, 细菌体内以有机化合物形式\\ 存在的氮) = \mathrm{TN}_{\mathrm{sys}} - \mathrm{TN}_{\mathrm{sn}}{ }^{[30]} ; \end{array} $ |
| $ 氮损失(\text {Loss-N}) = \text { 反应后 } \mathrm{TN}_{\mathrm{sys}} - \text { 初始 } \mathrm{TN}_{\mathrm{sys}}{ }^{[9]} \text { 。} $ |
NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN中氮的去除率和去除速率按以下公式计算：
| $ \begin{gathered} R_{\mathrm{N}}=\left(C_0-C_t\right) / C_0 \times 100 \%, \\ S_{\mathrm{N}}=\left(C_i-C_j\right) / t 。\end{gathered} $ |
式中：RN表示氮的去除率；C0表示培养基中的初始氮浓度，Ct表示培养了t(h)时间的培养基中的氮浓度；SN表示氮的去除速率；Ci和Cj分别表示培养了i(h)和j(h)时间的氮源培养基中的氮浓度；t表示细菌的培养时间。
取离心后的培养菌液，采用TOC分析仪(德国耶拿分析仪器股份公司)测定总有机碳(TOC)。细菌生长量采用吸光度法[31]测定，取200 μL菌液用Synergy2多功能酶标仪(美国基因有限公司)于600 nm波长下测量吸光度值(OD600)。
1.7 数据分析采用SPSS Statistics 21.0进行单因素方差分析和Duncan多重比较，以P＜0.05为差异显著水平，以mean ± SD作为数据表示形式。相关数据用Origin 2021和Adobe Illustrator 2022进行作图分析。
2 结果 2.1 菌株C3异养硝化-好氧反硝化性能由图 1(a)可见，菌株C3在以NH4+-N作为唯一氮源的培养基HNM中，接种后48 h，菌株C3生长进入稳定期，其OD600从0.068升至0.277。至实验结束，葡萄糖大量消耗(TOC浓度从345.68 mg/L降至185.63 mg/L)，表明葡萄糖被菌株C3用于大分子合成和能量代谢(见图 2)。菌株C3对NH4+-N的氧化作用与生长密切相关。在实验初期的12 h内，菌株C3对HNM中的NH4+-N的最大去除速率为0.36 mg/(L∙h)，最终NH4+-N去除率为85.95%，培养过程中伴随NH2OH的累积，直至实验结束达到0.65 mg/L。氮平衡分析表明，菌株C3经过72 h培养后，HNM中约41.45%的初始TNsys(24.01 mg/L)被菌株C3同化为生物氮，29.33%的初始TNsys被同化为有机氮，约16.83%的初始TNsys逸出，可能以某种气态化合物的形式存在(见表 1)。在实验的72 h内，并未检测到明显的NO2--N的积累，仅检测到了少量的NH2OH。
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图 1 NH4+-N(a)、NO2--N(b)和NO3--N(c)作为唯一的添加氮源时芽孢杆菌C3的生长情况和氮转化性能 Fig. 1 The growth and nitrogen transformation performance of strain C3 when NH4+-N (a), NO2--N (b), and NO3--N (c) were added as sole nitrogen sources |
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( HNM表示以NH4+-N为唯一氮源组；NDM表示以NO2--N为唯一氮源组；DM表示以NO3--N为唯一氮源组。下同。HNM represents the group with NH4+-N as sole nitrogen source; NDM represents the group with NO2--N assole nitrogen source; DM represents the group with NO3--N as sole nitrogen source.The same applies to subsequent figures and tables. ) 图 2 菌株C3在不同氮源中体系总有机碳(TOC)72 h前后对比 Fig. 2 Total organic carbon (TOC) concentrations in different nitrogen source media before and after 72 h of cultivation with strain C3 |
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表 1 菌株C3在不同氮源培养基中培养后的氮平衡分析 Table 1 Nitrogen balance analysis of strain C3 cultured in media with different nitrogen sources |
由图 1(b)可见，菌株C3在以NO2--N作为唯一氮源的培养基NDM中，起始的0~12 h细菌生长缓慢，这可能是由于NO2--N的毒性导致菌体生长的适应期。在实验的12~60 h，菌株C3进入对数生长期，OD600从0.069提高到0.306。至实验结束，葡萄糖大量消耗(TOC浓度从345.08 mg/L降至137.36 mg/L)(见图 2)。在实验的24~36 h，NO2--N从14.66 mg/L迅速降至10.33 mg/L，最大去除速率为0.36 mg/(L∙h)。接种24 h后出现了少量(0.60 mg/L)NH4+-N的积累，可能来源于亚硝酸盐异化还原，但在第36 h消失，推测是通过细菌同化转化为了有机氮或生物氮。菌株C3最终去除了75.89%的NO2--N。在整个反应期间消耗了约207.72 mg/L的TOC(见图 2)。NO2--N转化过程中OD600增加，表明菌株C3具有亚硝酸盐同化能力。通过氮平衡分析，可以看出，整个过程中大部分(38.30%)初始TNsys被菌株C3同化为生物氮，29.89%初始TNsys被菌株C3同化为有机氮，14.14%初始TNsys逸出，可能以某种气态化合物的形式存在(见表 1)。
由图 1(c)可见，在以NO3--N作为唯一氮源的培养基DM中，菌株C3在0~12 h生长相对较慢，12~60 h进入对数生长期，OD600从0.067上升到0.296。至实验结束，葡萄糖大量消耗(TOC浓度从354.16 mg/L降至170.19 mg/L)(见图 2)。与此同时，DM中的NO3--N浓度明显下降，特别是在实验的第36~60 h内，检测到NO3--N浓度明显降低，此时菌株C3对NO3--N的最大去除速率为0.50 mg/(L∙h)。在实验的第12 h，DM中检测到NO2--N的积累，并在实验的第36 h达到最大，此时NO2--N的浓度约为4.06 mg/L，直至实验结束NO2--N浓度趋于稳定。在实验的第72 h，菌株C3可以去除DM中的约96.29%的初始NO3--N(19.28 mg/L)。氮平衡分析表明，DM中约29.20%的初始TNsys被菌株C3同化为有机氮，13.29%从系统中逸出，而大部分的(37.98%)初始TNsys被同化为生物氮(见表 1)。
2.2 菌株C3的氨氧化过程抑制在以NH4+-N为唯一氮源的HNM培养基中添加不同浓度(0、20、50、70和100 mg/L)的抑制剂ATU，培养72 h，各处理组的氨氮去除率和氮损失未见显著影响(见图 3(a))，在不同培养基中菌株C3生长趋势相似(见图 3(b))。
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图 3 添加ATU对菌株C3氨氧化过程的影响 Fig. 3 Effects of adding ATU on ammonia oxidation process by strain C3 |
由图 4可见，菌株在利用NH2OH的同时会出现TN的减少，但是在整个实验过程中并未检测到NH4+-N、NO2--N和NO3--N的积累。
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图 4 菌株C3对羟胺的利用 Fig. 4 Strain C3 utilization of hydroxylamine |
菌株C3在3种氮源中产生的15N2O和15N2同位素检测结果如图 5所示。当使用15N标记的15NH4Cl、Na15NO2和Na15NO3作为底物时，HNM*、NDM*和DM*介质顶部空间中N2O分别为173.86‰、3 086.86‰和1 288.91‰，均远高于相应的空白对照(分别为11.44‰、89.57‰和14.13‰)。同样，在整个反应过程中，HNM*、NDM*和DM*培养基中N2的δ15N值分别为3.64‰、3.45‰和3.67‰，与相应的空白对照(分别为1.36‰、1.72‰和1.26‰)差异不显著(P>0.05)。
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图 5 菌株C3在3种氮源中的15N2O(a)和15N2(b)的同位素检测结果 Fig. 5 Isotope detection results of strain C3 at 15N2O(a) and 15N2(b) in three nitrogen sources |
菌株C3的基因组大小为4 057 290 bp，GC含量43.68%，基因组圈图见图 6。
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( 从外圈到内圈：(1)基因组大小；(2—3)：分别为正、负链上的编码序列(不同的颜色代表不同的COG功能分类)；(4)tRNA(橙色)和rRNA(蓝色)；(5)G+C含量(红色高于平均值，蓝色低于平均值)；(6)GC-Skew(绿色表示G>C，橙色表示C>G)。From the outer circle to the inner circle: (1) the size of genome; (2-3): the coding sequences on the positive and negative strands, respectively (different colors mean different COG functional categories); (4) tRNA (orange) and rRNA (blue); (5) G+C content (red above average, blue below average); (6) GC-skew (green means G>C, orange means C>G). ) 图 6 菌株C3的基因组圈图 Fig. 6 Circular map of strain C3 |
为了探究菌株C3中与脱氮相关的功能基因，本研究对菌株C3的全基因组测序结果进行了分析。通过KEGG pathway分析，在能量代谢(Energy metabolism)中氮代谢(Nitrogen metabolism)通路中，分别注释到了nar、nir、nas和glt等与氮转化相关的基因。
基于KEGG数据库注释，氮同化和异化途径功能基因的结构如图 7所示。nasA基因(编码同化性硝酸盐还原酶)与nirBD基因(编码NADH-亚硝酸盐氧化还原酶)形成nas簇，负责菌株C3的同化硝酸盐还原过程，将硝态氮还原为氨氮。基因组中注释到参与谷氨酸脱氢酶途径的gudB基因，以及参与谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶途径的glnA和gltBD基因，这些基因均参与胞内铵同化过程。过氧化氢酶katE基因可能参与亚硝酸盐的氧化反应(NO2-→NO3-)[32]。此外，在菌株C3基因组上3 660 144~3 666 531 bp，注释到了用于硝酸盐呼吸的完整的操纵子(narGHJI)，参与反硝化过程。该操纵子的下游是氨转运蛋白的基因amt，上游是硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白的基因narK和亚硝酸盐转运蛋白nirC，负责菌株C3对无机氮的细胞转运。虽然参与NO2-转化为NO过程的nirK/nirS未在KEGG数据库中注释到，但在基因组中发现了nirBD基因，也能参与此过程。NO还原酶激活因子(norQ)、NO还原酶转录调节因子(norG)均已成功注释，可能促进NO转化为N2O。同时，使用KEGG数据库预测的菌株C3的氮转化途径详情见图 8。综合所有研究结果推测菌株C3的氮转化过程见图 9。
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图 7 位于菌株C3基因组上的氮转化基因的示意图 Fig. 7 Nitrogen transformation genes in strain C3 genome |
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图 8 使用KEGG数据库预测的菌株C3的氮转化途径 Fig. 8 Nitrogen transformation pathway of strain C3 predicted by KEGG databa |
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图 9 推测的菌株C3的氮转化过程 Fig. 9 The nitrogen transformation process of the hypothesized strain C3 |
随着研究的深入，越来越多具有脱氮功能的HN-AD细菌被分离筛选出来。例如，李波将蒙氏假单胞菌L-11用于凡纳对虾(Penaeus vannamei)标粗阶段，使养殖水体中的氨氮从1.6 mg/L降至0.4 mg/L、亚硝态氮从0.6 mg/L降至0，表明其在水产养殖水体中的应用潜力[10]；陈梦苹发现谷氨酸杆菌EM-H8对氨氮(100 mg/L)和总氮的去除率分别达到100%和89.16%，且能有效去除羟胺[11]；而Chen则发现农杆菌LAD9对水体中总氮的去除率为50.1%，有40.8%被同化为生物氮[12]。本研究从黄海冷水团底泥中分离出莫哈韦芽孢杆菌C3，其对NO2--N、NH4+-N和NO3--N的去除率分别可达75.89 %、85.95 %和96.29%，最大氮去除速率分别为0.36、0.36和0.50 mg/(L∙h)，总体性能上优于已报道的枯草芽孢杆菌H1[8]和地衣芽孢杆菌MP15(B. licheniformis MP15)[33]，与其他类似菌株相比，其脱氮性能总体处于中等偏上水平，具有较好的应用潜力。
1998年，Richardson通过对全食副球菌的研究提出：HN-AD途径有两条[16]：一条是硝酸盐-亚硝酸盐还原(完全硝化-反硝化)途径[17]，即NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2；另一条是羟胺还原(不完全硝化-反硝化)途径[9]，即NH4+→NH2OH→ N2O/N2。本研究发现，在以NH4+-N作为唯一氮源的培养基HNM中，菌株C3对NH4+-N的去除率达85.95%。菌株C3生长良好，约41.45%的初始TNsys被菌株C3同化为生物氮，29.33%的初始TNsys被同化为有机氮，推测大部分NH4+-N被同化为有机氮和生物氮，表明菌株C3具有较强的氨氮同化能力。约有16.83%的初始TNsys逸出，说明一部分NH4+-N可能通过硝化作用，最终转化为含氮气体。而29.33%的初始TNsys转化为有机氮，可能来源于细胞裂解[34]。与此同时，在以15NH4Cl为唯一氮源的HNM*培养基中，仅检测到了15N2O的产生，证明了菌株C3异养硝化途径的最终气态产物为N2O。
本研究中，在以NH4+-N作为唯一氮源时，系统中仅检测到了少量的NH2OH，而典型的硝化产物NO2--N和NO3--N在反应过程中几乎没有检测到，因此进一步设计了氨氧化抑制实验，以验证具体的硝化作用通路。氨单加氧酶(Ammonia monooxygenase，AMO)是NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-和NH4+→NH2OH→N2O→N2两条氨氧化途径的限速酶[35]。ATU和二乙基二硫代氨基甲酸酯(Diethyldithiocarbamate, DDC)能够通过螯合酶活性中心抑制硝化微生物的AMO酶活性[9]，抑制NH4+→NH2OH这一氨氧化过程，从而减少硝化作用含氮气体的产生[36]。因此，基于这种硝化抑制剂的特性，可探索ATU和DDC对菌株是否具有氨氧化抑制作用。然而，在本研究预实验中，添加不同浓度的DDC完全抑制了菌株C3的生长，无法排除DDC对菌株C3同化作用的影响(实验结果未列出)。而添加不同浓度的ATU后菌株C3生长情况相似，说明ATU不影响菌株C3的同化作用。同时，对各处理组氨氮去除率和氮损失无显著影响，表明ATU对菌株C3的氨氧化作用无抑制作用，这与刘天琳等[37]观察到ATU会影响土壤硝化作用的结果不一致。相类似，Xie等[9]发现盐单胞菌DN3的氨氧化过程不受ATU或DDC的阻碍，He等[38]发现，在ATU和DDC存在时，台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)J488对NH4+-N的去除率仍达100%。本研究结果表明，菌株C3中可能存在一种具有特殊酶结构的新型氨氧化酶，能够将NH4+-N转化为NH2OH。同时，菌株C3以NH2OH为唯一氮源下生长，无NH4+-N、NO2--N和NO3--N的积累，且系统中总氮减少，表明菌株C3在硝化途径中能够有效转化NH2OH并产生含氮气体。此外，本研究还发现菌株C3在无有机碳源(C/N=0)的培养基中不生长，而在含葡萄糖(C/N=18)的三种氮源培养基中，TOC含量显著减少，表明菌株C3的生长依赖外部有机碳源，证明其为异养型细菌。综上所述，菌株C3为一株异养型细菌，对NH4+-N的利用途径主要有两条，一条是通过同化作用转化为有机氮和生物氮，一条是通过异养硝化作用将NH4+-N转化为NH2OH后，直接产生N2O。
在以NO2--N作为唯一氮源时，菌株C3表现出高效的NO2--N去除能力，同时伴随微量NH4+-N的短暂积累。这一现象可能涉及以下两种机理：(1)NO2--N通过亚硝酸盐还原作用直接转化为NH4+-N；(2)同化氮的再氨化作用，即菌株先将NO2--N同化为有机氮，随后将有机氮分解为NH4+-N并释放至水体。同时，系统中38.30%的总氮被同化为生物氮，表明菌株C3可利用同化产生的NH4+-N供自身生长。此外，在以Na15NO2为唯一氮源的NDM*培养基中，检测到了15N2O的产生，证实了菌株C3具备反硝化能力。
在以NO3--N作为唯一氮源时，菌株C3表现出近乎完全的NO3--N去除能力，同时伴随NH4+-N和NO2--N的积累。这表明菌株C3能够将NO3--N转化为NO2--N和NH4+-N，推测可能发生了反硝化作用和同化硝酸盐还原作用。另外，系统中37.98%的总氮被同化为生物氮，说明菌株C3能够继续利用NH4+-N用于自身生长，进行同化作用。而在以Na15NO3为唯一氮源的DM*培养基中，检测到了15N2O的产生，证明菌株C3反硝化途径的最终气态产物为N2O。
3.2 基于全基因组分析的菌株C3的氮转化机理全基因组测序分析显示，在氮同化作用中，胞外的NO3--N通过narK编码的硝酸盐转运蛋白被运输到胞内；胞外的NO2--N通过narK/nirC编码的亚硝酸盐转运蛋白被运输到胞内；NH4+-N通过amt编码的氨转运蛋白被运输到胞内[8-9]。在菌株C3的全基因组数据中，编码周质硝酸还原酶的nap未被注释到[39]，但发现了编码NADH-亚硝酸盐氧化还原酶的基因簇nirBD，其能和编码同化硝酸还原酶的nasA形成nas簇，协同完成硝酸盐同化，转化成NH4+，这一同化过程与盐单胞菌DN3[9]和非脱羧勒克莱尔氏菌(Leclercia adecarboxylata)AS3-1[40]一致。参与NH4+-N同化过程有两条途径的相关基因均被注释到，表明菌株C3通过表达gudB(谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydroge-nase, GDH)途径)和glnA/gltBD(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(Glutamine synthetase/glutamate synthase, GS/GOGAT)途径)将氨氮转换为有机氮和细胞物质以进行生长。在相似的研究中，Kayumov研究发现枯草芽孢杆菌168在氮限制条件下，可通过tnrA激活多种氮同化相关基因的表达[41]。本研究也注释到了该转录调节因子tnrA，推测其可能在菌株C3的氮限制期间也可激活氮同化基因的表达。urtABCDE簇(编码尿素ABC转运蛋白)和ureABC簇(编码脲酶)的注释表明，菌株C3可能具有对尿素的利用潜力[42]。综上所述，全基因组分析表明，菌株C3可能具有两条氮同化途径，一条是胞外NO3-/NO2-/NH4+→胞内NH4+→谷氨酸→菌体蛋白(GDH途径)，另一条为胞外NO3-/NO2-/NH4+→胞内NH4+→谷氨酰胺→谷氨酸→菌体蛋白(GS/GOGAT途径)。
KEGG数据库预测显示，菌株C3的反硝化途径中，只注释到了能将硝态氮还原为亚硝态氮的narGHI，其他基因或酶未注释到。然而，在以硝态氮或亚硝态氮为唯一氮源的培养过程中，都检测到了系统中总氮的损失，且同位素示踪也检测到了N2O的产生，因此，除了已经标记到的反硝化作用基因，推测可能还有其他基因或酶参与了菌株C3的反硝化过程。同时，在菌株C3基因组上3 660 144~3 666 531 bp，注释到了硝酸盐呼吸的完整的操纵子narGHJI(编码硝酸盐还原酶)，可参与NO3-的还原(NO3-→NO2-)。该操纵子的上游是narK，负责将NO3-和NO2-转移到胞内。NO2-还原为NO作为典型反硝化途径的关键步骤，主要受编码NO2--N还原酶的nirK/nirS调节。然而，通过与已有数据库的比较，本研究中没有注释到相关的酶编码基因。不过，最新研究发现，nirBD也可能将NO2-还原为NO[40]。此外，虽然在KEGG数据库中未注释到编码NO还原酶的norBC，但是NO还原酶激活因子(norQ)、NO还原酶转录调节因子(norG)均被成功注释。与此同时，通过15N同位素示踪法发现，在以Na15NO3和Na15NO2为氮源的两组(DM*、NDM*)处理中均检测到被标记的N2O，但N2却未被标记，这一结果表明反硝化过程中产生N2O为最终气态产物。综上可推测，菌株C3的反硝化途径为NO3-→NO2-→NO→N2O。
尽管氮平衡分析结果及15N同位素示踪结果均表明菌株C3对氨氮利用可能存在硝化作用过程，然而，传统硝化相关的编码氨单加氧酶基因(amo)、编码羟胺氧化酶基因(hao)以及编码一氧化氮还原酶基因(norBC)在数据库中均未注释到。类似的现象也在盐单胞菌DN3相关研究中被注意到[9]。与此同时，氨氧化抑制实验中，ATU对氨氮无明显抑制作用，菌株C3在以NH2OH为唯一氮源时，不产生其他无机氮，仅产生气态氮。基于上述结果，推测菌株C3基因组中可能存在参与氨氧化及羟胺氧化过程的关键酶的新型编码基因。因此，菌株C3的硝化途径可能为NH4+→NH2OH→NO→N2O。相似硝化途径也在HN-AD细菌枯草芽孢杆菌H1[8]、发光杆菌(Photobacterium sp.)NNA4[43]中被发现。当然，这一推测尚需通过进一步的研究予以验证。
4 结语从黄海冷水团底泥中筛选出的莫哈韦芽孢杆菌C3可有效去除水体中NH4+-N、NO2--N和NO3--N，去除率分别为85.95%、75.89%和96.29%。基于氮平衡分析、氨氧化抑制、同位素气体示踪以及全基因组分析等研究结果，推测菌株C3的氮代谢途径主要包括氮同化和异化途径，其中氮同化途径占主导地位。在氮同化过程中，氮源的利用主要通过GDH途径(胞外NO3-/NO2-/NH4+→胞内NH4+→谷氨酸→菌体蛋白)和GS/GOGAT途径(胞外NO3-/NO2-/NH4+→胞内NH4+→谷氨酰胺→谷氨酸→菌体蛋白)。菌株C3可通过HN-AD途径实现氮异化，包括异养硝化作用(NH4+→NH2OH→NO→N2O)和好氧反硝化作用(NO3-→NO2-→NO→N2O)。上述多样化的氮转化途径表明，菌株C3在氮源转化及高效利用方面具有重要的生态功能和潜在的应用价值。
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