2026, Vol. 56
2. 中国科学院大学，北京 100049;
3. 青岛科技大学，山东 青岛 266042
钵水母纲(Scyphozoa)作为海洋生态系统的组成部分，其毒理学研究对于理解生物间相互作用及保障人类健康具有重要意义。沙海蜇(Nemopilema nomurai)作为东亚海域分布最广的水母物种之一，其生态适应性极强，栖息范围从近岸浅水区延伸至200米深的远洋环境[1]。近年来，全球气候变化导致的海洋环境变动显著扩大了沙海蜇的暴发频率与地理分布，严重威胁着渔业生产和海洋生态平衡[2]。沙海蜇刺丝囊释放的毒液可引发人体系统性中毒反应，包括皮疹、肌肉毒性、神经毒性、急性肾衰竭、呼吸困难等症状，造成了沿海地区的公共健康安全隐患[3-5]。
水母毒素的复杂组分与作用机制解析是水母蜇伤防治与毒素开发利用的核心问题。传统研究大多聚焦于毒液粗提物的生物活性表征，但由于天然毒素存在异质性高、稳定性差等问题，难以实现单一毒性成分的提取分离与功能解析[6]。随着组学技术的发展，转录组与蛋白质组联用策略为全面解析水母毒素分子构成提供了新途径。研究表明，沙海蜇毒液中磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)家族蛋白占总毒素蛋白的21.56%，且在中毒致死中发挥关键作用[7]。这一发现与箱型水母(如Chironex fleckeri)毒液研究形成对比，后者以孔道形成蛋白(Porin-like toxins)为主导毒性成分，表明不同水母物种的毒液进化存在差异[8-9]，也表明进化的差异使毒素磷脂酶A2的结构与功能具有多样性。
PLA2作为在动物毒液中呈现广泛分布特征的脂酶，通过催化甘油磷脂sn-2位酰基键断裂生成溶血磷脂和游离脂肪酸，在细胞膜破坏、信号通路激活及炎症级联反应中发挥着关键作用[10]。分泌型PLA2(sPLA2)因其分子量小(14~19 kDa)、热稳定性强及Ca2+依赖性催化特性，是毒液PLA2的主要亚型[11]。典型sPLA2分子包含由His/Asp组成的催化中心及保守的Ca2+结合环(XCGXGG)，其底物特异性受磷脂极性头基构象及脂质聚集态调控[12]。然而，目前对水母PLA2的三维结构特征及构效关系仍存在认知空白，制约了其毒性机制的深入解析。
传统毒素纯化方法(如层析分离、电泳制备)受限于天然毒液的低丰度及成分复杂性，难以大量获得高纯度活性蛋白[13]。基因工程技术的突破为这一困境提供了解决方案：通过异源表达系统(如大肠杆菌、毕赤酵母)可实现目标毒素的可控表达，结合亲和层析等技术，即可高效获取重组蛋白[14]。如通过包涵体分步透析法溶解、纯化和重新折叠后得到人和小鼠sPLA2-IIE的可溶活性蛋白[15]；通过pET-30a、pET-32a与pRSET-CE在BL21(DE3)大肠杆菌中得到了蛇毒sPLA2蛋白TS-G6-D49-PLA2、TMV-D49-PLA2、V2并进行包涵体变复性[16]；通过毕赤酵母在培养基上清液收集到了过表达的蝎毒sPLA2[17]；使用HEK-293T和CHO-K1细胞可溶性表达了5个小鼠sPLA2同源物[18]。但水母PLA2的高二硫键密度(通常含4—7对二硫键)导致其在大肠杆菌中易形成包涵体，严重限制功能性蛋白的获得[19]。近年来，多种策略被用于改善难表达蛋白的可溶性，包括融合促溶标签(如SUMO、MBP)、共表达分子伴侣(GroEL/ES、DsbC)及优化培养条件(低温诱导、氧化还原调控)等[21]。其中，结构域截取策略可显著提升蛋白折叠效率，已在蛇毒金属蛋白酶等复杂毒素表达中成功应用[22]。
本研究以沙海蜇触手转录组数据为基础，筛选获得四个新型PLA2同工酶。针对其异源表达中出现的包涵体难题，创新性设计多结构域截取方案，建立截短型PLA2-3的可溶性表达系统，并进行酶活性分析与结构预测。本研究不仅为海洋生物蛋白类毒素的工程化制备提供技术支持，也为酶抑制剂的开发奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 质粒、感受态细胞质粒pET-22b和pET-32a及感受态细胞BL21(DE3)购于擎科生物科技有限公司。
1.1.2 试剂LB肉汤购于青岛海博生物技术有限公司。丙三醇、氯化钠和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购于国药集团化学试剂有限公司。氨苄西林钠、磷酸二氢钠、5×蛋白上样缓冲液(含DTT)、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris)、3-(N-吗啡啉)乙磺酸(MOPS)和吐温-20(Polysorbate 20)购于北京索莱宝科技有限公司。标准蛋白Maker和ECL发光液购于山东思科捷生物技术有限公司。转膜液Trans Buffer、蛋白印迹试剂盒、12%预制胶和His标签单克隆抗体购于金斯瑞生物科技股份有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司。4-硝基-3-(辛酰氧基)苯甲酸(4-nitro-3-octanoyloxybenzoic acid，NOBA)购于阿拉丁试剂(上海)有限公司。
1.1.3 仪器DJS-2016R叠加式恒温培养摇床，上海世平实验设备有限公司；XMTD-8222培养箱，上海精宏实验设备有限公司；CT18RT高速冷冻离心机，天美(中国)科学仪器有限公司；SCIENTZ-950E超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；电泳仪、iMark型酶标仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；L00816C全自动蛋白印迹系统、eStain L1蛋白染色仪，金斯瑞生物科技股份有限公司；PHS-3C酸度计，雷磁(上海)科技有限公司。
1.2 实验方法 1.2.1 毒液蛋白序列筛选与序列比对基于沙海蜇触手转录组数据库[23]，通过以下多维度筛选策略获取目标序列：(1)利用测序文件中的基因注释，初步筛选具有磷脂酶A2(PLA2)活性的候选序列；(2) 采用SignalP 5.0服务器(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)预测分泌型信号肽(阈值：D-score>0.8)，结合跨膜结构域TMHmmol/L 2.0分析(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHmmol/L-2.0/)排除膜结合型PLA2；(3) 针对筛选PLA2蛋白进行全长序列比对(MUSCLE法)。
1.2.2 催化结构域智能截取与密码子优化通过InterProScan功能域注释(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)及SWISS-MODEL同源建模(https://swissmodel.expasy.org/interactive)结果，确定其核心催化结构域边界。采用GeneOptimizerTM算法对截短型PLA2基因序列进行大肠杆菌密码子偏好性优化(CAI值>0.85)，并由擎科生物股份有限公司完成全基因合成。
1.2.3 重组质粒构建与转化(1) pET-22b-PelB系统：将优化后基因克隆至果胶酶B引导肽(PelB signal sequence)与C端6×His标签之间，利用Sec分泌途径促进可溶性表达。
(2) pET-32a-TrxA系统：将基因插入硫氧还蛋白(TrxA)融合标签与TEV蛋白酶切割位点(ENLYFQS)下游，旨在通过分子伴侣效应提升蛋白折叠效率。
重组质粒经Sanger测序验证后，采用热激法(42 ℃, 60 s)转化至BL21(DE3)化学感受态细胞。
1.2.4 低温诱导表达与蛋白分级分离挑取单克隆接种于含100 μg/mL氨苄西林的LB培养基，37 ℃振荡培养至OD600=0.6~0.8。加入0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16 ℃低温振荡诱导16 h(120 r·min-1)。离心收集菌体后，采用超声细胞粉碎仪在裂解缓冲液(20 mmol/L PBS, 150 mmol/L NaCl, pH =8.0)中破碎细胞(功率：300 W)，随后12 000×g离心30 min(4 ℃)分离上清(可溶组分)与沉淀(包涵体)。
1.2.5 蛋白表达验证通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE, 12%分离胶)及Western blotting验证目标蛋白的表达：取20 μg总蛋白上样电泳，电转至0.22 μm硝酸纤维素膜(300 mA, 90 min)，经5%脱脂牛奶封闭后，与小鼠抗His单克隆抗体4 ℃孵育过夜，采用化学发光成像系统采集信号，每组实验设5个生物学重复。
1.2.6 酶活性检测基于比色法测定PLA2活性：反应体系含200 μL缓冲液(20 mmol/L NaH2PO4, 150 mmol/L NaCl, pH=8.0)、25 μL NOBA(NOBA溶于乙腈，1 mg/mL)及25 μL粗提蛋白上清液(空白对照用缓冲液代替蛋白溶液)。37 ℃孵育1 h后，测定405 nm处的吸光度。通过改变温度条件、缓冲液pH，进行粗蛋白浓度为1 000 μg/mL的酶活性检测，每组设置三个重复，通过Prism软件拟合曲线。
2 结果 2.1 PLA2分子特征的序列分析基于沙海蜇毒液触手转录组筛选获得四个毒素PLA2候选基因，均存在信号肽区域，即引导新合成的PLA2分泌到特定区域便于集中释放的短肽链。采用SignalP 5.0预测四种PLA2的分泌型信号肽(见图 1)，结果表明四种PLA2均存在16~23个氨基酸的短分泌肽，呈现典型的sPLA2特征。
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( (a.PLA2-Ⅰ；b.PLA2-Ⅱ；c.PLA2-Ⅲ；d.PLA2-Ⅳ.) ) 图 1 四种沙海蜇PLA2的信号肽预测 Fig. 1 The prediction of signal peptides for four Nemopilema nomurai PLA2 |
多序列比对显示：催化中心保守性：四种PLA2的活性中心均保留sPLA2标志性催化基序(His/Asp)(见图 2紫色阴影)，其中PLA2-Ⅲ的活性位点与其他三者不同，推测发生了突变；四种PLA2呈现较为保守的Ca2+结合环特征序列(XCGXGG，X代表可变残基)，其中PLA2-Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ呈XCGXXG的序列，PLA2-Ⅲ则呈XCGXXX(见图 2黑色方框)。分子结构独特性：PLA2具有8~15个半胱氨酸，可形成复杂分子内二硫键拓扑结构，提示其可能通过增强结构刚性适应海洋高渗环境。信号肽进化保守性：N端信号肽序列(1-23 aa)呈现高度保守的疏水核心(LXXXAXXXXQXAA)(见图 2红色方框)。
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( 红色方框内为信号肽区域，黑色方框内为Ca2+结合环，紫色阴影内为His/Asp(H/D)活性中心，黄色高亮为保守氨基酸。The red box indicates the signaling peptide region, the black box indicates the Ca2+ binding loop, the purple shadow indicates the His/Asp (H/D) active site, and the yellow highlight indicates the conserved amino acids. ) 图 2 四种沙海蜇PLA2的全序列比对 Fig. 2 The complete sequence alignment of four Nemopilema nomurai PLA2 |
根据模型结构预测，四种PLA2也符合sPLA2的典型二级结构组成，包括三个α螺旋(α-helix)、两个β转角(β-turn)(见图 3)，表 1为四种PLA2的同源建模蛋白模板及参数。
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( (a.PLA2-Ⅰ；b.PLA2-Ⅱ；c.PLA2-Ⅲ；d.PLA2-Ⅳ.) ) 图 3 四种沙海蜇PLA2的SWISS-MODEL结构预测 Fig. 3 The structure prediction of four Nemopilema nomurai PLA2 by SWISS-MODEL |
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表 1 四种全序列PLA2同源模拟的蛋白模板及其参数 Table 1 Protein templates and parameters of four PLA2 homology mimics |
针对真核蛋白在原核表达系统中普遍形成包涵体的问题，本研究提出"催化核心-二硫键最小化"截取策略：通过SWISS-MODEL同源建模，确定PLA2的活性口袋由活性中心、β转角(β-turn)和保守的Ca2+结合环构成(见图 4)，表 2为四种截短体PLA2的同源建模蛋白模板及参数；截短设计PLA2-I的截短体PLA2-1：Ala35-Leu123；PLA2-Ⅱ的截短体PLA2-2：Ile38-Lys134；PLA2-Ⅲ的截短体PLA2-3：Val36-Leu138；PLA2-Ⅳ的截短体PLA2-4：Gly44-Tyr136(见图 5)，在保留完整催化结构域的同时，半胱氨酸数量由8~15个下降为7~12个，降低二硫键错误配对风险。
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( a.PLA2-1；b.PLA2-2；c.PLA2-3；d.PLA2-4，二级结构为有颜色区域，其中绿色为β转角，紫色为α螺旋。红圈内为催化活性中心，内含催化位点His/Asp。a. PLA2-1；b. PLA2-2；c. PLA2-3；d.PLA2-4. The secondary structure consists of colored regions, where green represents β-turns and purple represents α-helices. The red circle indicates the catalytically active center, which contains the catalytic site His/Asp. ) 图 4 四种沙海蜇PLA2截短体的SWISS-MODEL结构预测 Fig. 4 The structural prediction of the truncated form of four Nemopilema nomurai PLA2 by SWISS-MODEL |
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表 2 四种截短体PLA2同源模拟的蛋白模板及其参数 Table 2 Protein templates and their parameters for PLA2 homology modeling with four truncations |
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( a.PLA2-1；b.PLA2-2；c.PLA2-3；d.PLA2-4。其中蓝框内为Ca2+结合环，红框内为催化活性中心，绿框内为β转角。a.PLA2-1；b.PLA2-2；c.PLA2-3；d.PLA2-4. The blue box contains the Ca2+ binding ring, the red box contains the catalytic active site, and the green box contains the β-turn. ) 图 5 四种沙海蜇截短体PLA2的磷脂酶活性结构域序列 Fig. 5 The sequence of the phospholipase activity domain of four Nemopilema nomurai PLA2 truncations |
构建pET-22b(分泌型)(见图 6a)与pET-32a(融合伴侣型)(见图 6b)两种载体系统，经Sanger法全基因测序表明载体构建成功。Western blot结果显示，三种全长PLA2在pET-22b系统中均以包涵体形式存在(见图 7a，条带分子量：14~16 kDa)，PLA2-Ⅳ不表达，可能是由于半胱氨酸含量最多(12个)，难以正确折叠，或是PLA2作为外源毒素可能对宿主产生毒性，抑制菌体生长甚至导致裂解。pET-32a系统亦未改善可溶性，可能是pET系列的强启动子T7导致蛋白表达过快，折叠速度较慢，蛋白堆积形成包涵体，或半胱氨酸含量较多，折叠错误；且PLA2-Ⅰ与PLA2-Ⅳ均不表达，可能原因同上(见图 7b)。而截短体的突破性表现在，尽管其他三种截短体并未改善包涵体或不表达的形式，但PLA2-3在pET-22b载体系统中实现高效可溶表达(见图 7c)。
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( (a. pET-22b; b. pET-32a.) ) 图 6 表达质粒构建图谱 Fig. 6 Expression plasmid construction map |
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( a.pET-22b质粒表达三种全序列PLA2；b. pET-32a表达两种全序列PLA2；c. pET-22b质粒表达截短体PLA2。a. The full sequence PLA2 expressed by the pET-22b plasmid; b. The full sequence PLA2 expressed by the pET-32a; c. The truncated PLA2 expressed by the pET-22b plasmid. ) 图 7 两种质粒表达PLA2的Western Blot检测 Fig. 7 Western Blot of two plasmids expressing PLA2 |
未在NCBI与BLAST数据库检索到大肠杆菌BL21(DE3)中存在PLA2酶，且未在Uniprot中BL21(DE3)蛋白数据库中检索到PLA2的活性注释，排除BL21(DE3)细胞内PLA2的活性。NOBA是一种人工合成的磷脂类似物，在PLA2作用下生成的3-羟基-4-硝基苯甲酸盐在405 nm处有吸收峰，405 nm处的吸光度通常用于指示PLA2的酶活性，吸光度越高表明酶活性越强[38]，故本实验将水解NOBA在405 nm处产生吸光度的能力作为PLA2-3的酶活性，结果显示PLA2-3的PLA2活性剂量依赖性增强(见图 8a)；最适活性pH=8.5(见图 8b)，与海水pH 8.1~8.4高度适配；在37~40 ℃时活性达峰值，65 ℃仍保留较强的活性(见图 8c)。
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( a.不同浓度下PLA2-3的酶活性，37 ℃反应1 h，pH=8.0；b.不同pH下PLA2-3的酶活性，37 ℃反应1 h，浓度为1 000 μg/mL；c.不同温度下PLA2-3的酶活性，反应1 h，浓度为1 000 μg/mL，pH=8.0。a. The enzyme activity of PLA2-3 at different concentrations at 37 ℃for 1 h and pH=8.0; b. The enzyme activity of PLA2-3(1 000 μg/mL) at 37 ℃ for 1 h at different pH; c. The enzyme activity of PLA2-3 (1 000 μg/mL)at different temperature, reaction time 1 h, and pH=8.0. ) 图 8 不同浓度、pH和温度下PLA2-3的磷脂酶A2活性 Fig. 8 The phospholipase A2 activity of PLA2-3 at different concentrations, pH levels, and temperatures |
异源蛋白在原核表达系统中形成包涵体是生物技术领域长期存在的挑战，尤其对于含多对二硫键的真核毒素蛋白如水母毒素PLA2。这些由错误折叠多肽链组成的高密度聚集体不仅导致功能缺失，还需依赖复杂且低效的变复性工艺[14]。蛇毒磷PLA2(TMV-D49-PLA2)[17]、海月水母PLA2(PLA2-Ⅰ、PLA2-Ⅱ)[24]以及蜘蛛毒素金属蛋白酶(LALP)[25]等毒素蛋白在原核表达系统中均形成包涵体，需进行变复性以开展后续研究，通常在变复性的过程中，活性损失严重。
真核毒素蛋白在大肠杆菌中易聚集生成包涵体源于热力学与动力学因素的交织作用。强启动子(如T7)驱动的高强度表达超出细菌分子伴侣网络的折叠容量，导致折叠中间体的动力学滞留[26-27]，例如，高表达水平下，核糖体合成速率超过分子伴侣的辅助折叠能力，引发未折叠多肽链的积累[28]。这一效应在富含半胱氨酸的毒素蛋白中尤为显著，大肠杆菌胞质的还原性环境(谷胱甘肽氧化还原电位：-270 mV)抑制了二硫键形成这一关键结构稳定机制。此外，真核翻译后修饰机制的缺失使蛋白暴露出疏水区域，进一步加剧分子间非特异性相互作用[14, 27]。
根据包涵体的形成过程，可通过降低IPTG浓度(0.1~1 mmol/L)或温度(16~25 ℃)控制表达速率，这种策略对改善包涵体最为简单有效。本实验前期通过将诱导温度由25 ℃降低至16 ℃，显著提高了重组蛋白的可溶性表达。通过细菌区室化结构实现折叠微环境定制也可改善，如本实验中周质空间靶向策略是通过利用PelB信号肽将PLA2毒素蛋白转运至氧化性周质空间[29-31](Eh：-160 mV)，促进二硫键正确配对。也可通过保留蛋白的重要结构域(如催化活性中心、重要二级结构等)，通过截去其他区域(如信号肽等)减少二硫键的数量，使其在异源细胞中更易正确折叠，但此策略需进行后续活性及毒性实验验证以确定截取方案是否可行。在本实验中，通过构建截短体PLA2-3，截去多余蛋白片段，减少了二硫键的数量，又通过pET-22b载体中的PelB引导肽将蛋白转运至周质空间，以促进剩余二硫键的配对，大大提高了蛋白的正确折叠率，从而实现了可溶性表达。
除此之外，新一代代谢感应型自诱导培养基通过动态匹配表达速率与折叠能力，显著提高可溶性蛋白产率。例如，温度依赖性T7 RNA聚合酶变体(T7lac: Ts)可精确调控转录通量，避免过度表达引发的折叠压力[32]。合成纳米区室策略是通过仿生设计封装蛋白纳米颗粒(20~40 nm)，模拟真核内质网腔环境，该技术已在芋螺毒素折叠中验证，显著提高可溶性表达[32-33]。也可通过突破传统GroEL/ES或Trigger Factor单一共表达模式，提出多维度伴侣协同方案。如抗聚集分子ATP非依赖性Holdase(Hsp33、Spy)防止翻译过程中多肽链聚集[26-27]；二硫键催化剂DsbA/DsbC融合变体优化氧化折叠路径[27-28]；工程化折叠酶改造ClpB/DnaK等ATP依赖性Foldase的底物特异性[34]。定向进化与微流控单细胞分析技术的结合也具有巨大潜力。通过荧光激活液滴分选(FADS)技术，基于实时溶解度生物传感器(如split-GFP融合系统)筛选大肠杆菌突变株，可快速开发针对特定毒素家族的“定制化底盘”[35]。无细胞表达系统与人工伴侣纳米颗粒的联用有望完全规避胞内折叠限制[36]，开创复杂蛋白生产新范式。此外，可通过深度学习工具(如AlphaFold)预测复杂毒素的折叠路径，指导理性设计以降低包涵体形成风险[37]。
4 结语本研究基于同源建模与多序列比对，系统解析了沙海蜇四种PLA2的结构特征，创新性提出多结构域截取策略，构建截短型重组蛋白(PLA2-3)并在pET-22b/BL21(DE3)系统中首次实现了沙海蜇毒素PLA2可溶性表达，为其功能研究提供了高质量蛋白来源。体外活性分析表明，粗提上清中的PLA2-3具有剂量依赖型磷脂水解活性。然而，本研究也存在不足之处。首先，未通过亲和层析获取高纯度蛋白，可能残留宿主蛋白酶干扰活性测定结果；其次，缺少活性位点分子对接分析，限制了对底物结合模式的深入解析。下一步工作可从以下方向展开：①优化Ni-NTA纯化流程并结合SEC-MALS技术验证蛋白均一性；②基于虚拟筛选与定点突变技术开发靶向抑制剂，为水母蜇伤的精准治疗提供分子基础。
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