2026, Vol. 56
2. 南京工业大学生物与制药工程学院，江苏 南京 211816
非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)凭借解热、镇痛、消炎和抗凝血功效，广泛用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎及多种发热和疼痛症状[1]。萘普生(Naproxen, NPX)作为典型NSAID，通过显著抑制前列腺素合成，展现出较强的消炎、解热和镇痛作用，且副作用较小，是全球四大常用非处方药之一[2-3]。自1980年中国实现NPX自主生产以来，其生产量和使用量在国内均呈现出指数级增长[4-5]。同时，据2022年统计数据，仅美国就开出了约730万份NPX处方[6]。随着NPX生产和使用的不断增加，加之现有污水处理技术存在局限，NPX在生产、使用和处理过程中被大量释放到环境中[7]。由于其在自然光条件的光降解半衰期可长达数天，导致其在自然水体中表现出假性持久现象[4]。在黄海和东海地区，NPX的检出浓度为22.27~271.30 ng·L-1，各检测点的检出率为100%[8]。值得注意的是，在加拿大北极的水体中，检测到的最高NPX浓度已达惊人的5 210 ng·L-1[9]。
NPX具有较强的亲脂性(辛醇/水分配系数为3.18)，因此存在生物富集的潜在风险。Ji等[10]发现，仅当暴露于最高浓度(1 000 μg·L-1)NPX时，斑马鱼胚胎的短期死亡率才会显著增加。类似的发现也在海洋鱼类三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)中得到验证[11]，即暴露在浓度为1 232 μg·L-1的NPX时，三刺鱼的死亡率显著提高，这说明仅在高浓度NPX暴露下才会在短时间对生物造成较大的影响。但也有研究表明，即使在1 μg·L-1的环境NPX浓度下，长期暴露仍会对印度鲤鱼造成氧化应激以及脂质过氧化损伤[12]。目前，对于NPX是否会对海洋生物产生类似影响尚不明确。尽管环境浓度下药物短期暴露对海洋生物的急性毒性较为有限，但NPX在水体中的假性持久性可能使生物长期处于痕量暴露环境，其积累的毒性效应不可忽视。而鱼类作为食物链的重要组成部分，不仅是评估生态风险的关键指示物种，还可能通过食物链传递霉素，最终对人类健康构成威胁[13]。
海洋青鳉(Oryzias melastigma)作为日本青鳉的同源物种，具有体型小、世代周期短和环境耐受性强等优势。其成鱼阶段雌雄差异显著，且胚胎和幼鱼对环境污染物敏感，同时还易于在实验室中规模化养殖，因此在生态毒理研究中得到广泛应用[14-16]。特别是胚胎阶段，其抗氧化系统尚未发育成熟，对活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的积累及氧化应激的响应更加敏感，能够直观反映污染物的初始毒性效应[14]。基于此，本研究以海洋青鳉为受试生物，系统评估了环境相关浓度下NPX对海洋鱼类跨代持续暴露的毒性效应。重点探讨了不同浓度NPX暴露对海洋青鳉两个世代早期发育和抗氧化系统的影响，并基于世代差异初步揭示了NPX长期暴露对海洋鱼类的适应性机制及潜在的生态风险，旨在为解析NPX在海洋生态系统中的生态毒性提供科学依据，同时为其风险管控提供重要参考。
1 材料与方法 1.1 化学试剂本研究所用萘普生(NPX，化学式为C14H14O3，分析纯，纯度≥99%)购自上海源叶生物科技有限公司，二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO，分析纯，纯度≥99.9%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验用海水是通过商品海盐(品牌：Instant Ocean)按说明溶于经砂芯过滤、晾晒除氯并且紫外消毒后的自来水配制而成的。实验中，取一定量的NPX溶于DMSO，配制成浓度为1、10和100 mg·L-1的母液。母液避光存放于-20 ℃冰箱中，每7 d更换一次，以确保实验暴露溶液的稳定性。
1.2 实验生物实验中的海洋青鳉已在实验室稳定繁殖数代，饲养水温控制在(27±2)℃，盐度为30±2，光暗周期比为14 h∶10 h。仔鱼和成鱼分别喂食日清丸红饲料科技有限公司的粉末型和B2型饲料，每天早、晚定点各喂食一次。在暴露测试开始前一晚，清除养殖系统中残留的胚胎，以确保参与暴露实验的胚胎均为实验当天所产。实验当天中午12点，收集沉积在养殖系统底部的胚胎，仔细清洗后置于体视显微镜下观察，筛选出发育健康且已受精的胚胎用于后续实验。
1.3 实验方法根据全球自然水体中NPX的实际检测浓度，本研究设置了两个世代的暴露浓度梯度，均为0、0.1、1和10 μg·L-1。其中0 μg·L-1组为对照组(含0.01%DMSO的海水)，其余浓度组为处理组。实验过程中，将NPX母液用配制好的海水稀释至原来的1/10000倍，以确保所有暴露溶液中助溶剂DMSO的浓度统一为0.01%。
本研究采用半静态暴露方式对海洋青鳉开展实验。首先，从健康养殖的成鱼(F0代)中收集受精时间不超过4 h的胚胎作为第一世代(F1代)的实验对象，置于培养皿中进行暴露培养，并每天更换暴露溶液。至受精后30 d时，将同一浓度下不同培养皿中的仔鱼混合，挑选约90条体长约8 mm的健康幼鱼，平均分配至3个装有6 L对应暴露溶液的暴露缸(尺寸为30 cm ×20 cm×20 cm)中继续暴露。此时，鱼的存活率已趋于稳定，暴露条件与前述一致。实验期间，每2 d更换一次暴露溶液，直至鱼达到性成熟(即受精后超过3个月)并实现稳定产卵。随后，分别收集不同浓度暴露下F1代健康成鱼的胚胎，按照上述方法继续在相同浓度下进行第二世代(F2)的暴露实验，暴露浓度与F1代保持一致。此外，对于F1代早期发育和抗氧化系统的实验操作及测定过程均同F2代保持一致。
1.3.1 两个世代的发育毒性相关指标的测定发育毒性实验采用直径12 cm的培养皿作为暴露容器，每个培养皿放置60个胚胎，每个浓度设置3个生物学平行。实验分为胚胎期和仔鱼期两个阶段，两个阶段的总实验周期为30 d。胚胎阶段实验的终点设为受精后20 d，未孵化的胚胎被视为死亡。在暴露期间，每天更换暴露溶液，并观察和记录胚胎的死亡及孵化情况。在受精后5和8 d，从每个培养皿中随机挑选10个胚胎，通过体视显微镜进行心率测定，每个胚胎重复测定2次。在30 d的暴露结束时，统计每个培养皿中成功孵化仔鱼的死亡数量。F1和F2代胚胎的操作过程相同。
1.3.2 抗氧化系统相关指标的测定抗氧化系统实验使用直径9 cm的培养皿作为暴露容器，每个培养皿放置50个胚胎，每个浓度设置3个生物学平行，实验周期为8 d。暴露结束后，从各浓度分别收集胚胎，用生理盐水冲洗胚胎表面后，使用无菌吸水纸吸干水分。处理后的胚胎置于冻存管内，保存于-80 ℃冰箱中备用。测定时，取出胚胎样本，并按照试剂盒说明书的操作步骤测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase，GST)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的活性或含量。所用试剂盒均采购自南京建成生物工程研究所。
1.3.3 实验数据处理在实验数据符合正态分布和方差齐性的前提条件下，采用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析(One way ANOVA)法和最小显著性差异(Least significant difference，LSD)法分析各组间的差异显著性。最终结果以平均值±标准差来表示。分析采用95%(α=0.05)可信限，当P < 0.05时表示差异显著。
2 结果 2.1 NPX对海洋青鳉早期发育的影响 2.1.1 孵化率及孵化时间在不同NPX浓度下，F1代和F2代海洋青鳉胚胎连续暴露30 d的孵化率和孵化时间如图 1所示。结果显示，0.1和1 μg·L-1处理组的孵化率与对照组相比均无显著差异。然而，当浓度升高至10 μg·L-1时，F1和F2代胚胎的孵化率均显著下降，分别降至原来的(78.33±10.41)%和(86.67±6.67)%。此外，所有处理组的孵化时间相较于对照组均显著延长，但同一浓度下两代之间的孵化率和孵化时间均无显著差异。
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( 0 μg·L-1代表对照组。a、b和c用于表示F1代不同NPX浓度组之间的显著性差异，x、y和z用于表示F2代不同NPX浓度组之间的显著性差异。标有相同的字母代表同一代不同NPX浓度组之间不存在显著性差异(P>0.05)，无相同字母表示存在显著性差异(P < 0.05)。0 μg·L-1 represents the control group. Letters a, b, and c denote significant differences among F1 generation NPX concentration groups, while x, y, and z represent significant differences among F2 generation NPX concentration groups. The presence of the same letter indicates no significant difference NPX between different concentration groups within the same generation (P >0.05), while the absence of the same letters indicates significant differences (P < 0.05). ) 图 1 不同NPX浓度暴露下的青鳉胚胎的孵化率(a)和孵化时间(b) Fig. 1 Hatching rate (a) and hatching time (b) of O. melastigma embryos exposed to different concentrations of NPX |
在不同NPX浓度暴露下，F1代和F2代海洋青鳉仔鱼的死亡率如图 2所示。结果显示，与对照组相比，所有处理组的仔鱼死亡率均显著升高，且NPX浓度与仔鱼死亡率之间呈明显的剂量效应关系，即随着NPX浓度的增加，仔鱼死亡率逐渐升高。当NPX浓度达到10 μg·L-1时，F1代和F2代的仔鱼死亡率分别高达(23.89±4.19)%和(15.55±2.54)%。值得注意的是，F2代的仔鱼死亡率均低于F1代，且在0.1和10 μg·L-1处理组中出现了显著性差异。
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( 同图 1图注。且不同浓度之间的差异用不同字母表示，同一浓度的两代之间的差异用星号表示。：P＜0.05。Same as Fig. 1 caption. The difference between different concentrations was indicated by different letters, and the difference between two generations at the same concentration was indicated by asterisk. : P < 0.05. ) 图 2 不同NPX浓度暴露下的仔鱼死亡率 Fig. 2 Mortality rate of larvae exposed to different concentrations of NPX |
不同NPX浓度暴露下，海洋青鳉的F1代和F2代受精后5和8 d胚胎心率如图 3所示。受精后5 d，F1代处理组的心率显著下降，但各浓度间无显著差异；F2代的心率虽然与对照组相比无显著差异，但在相同浓度下显著高于F1代。受精后8 d，F1代和F2代的胚胎心率除F1代1 μg·L-1处理组外均显著低于空白对照组，但两代之间在相同浓度下的心率差异较小。
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( 同图 1图注。且不同浓度之间的差异用不同字母表示，同一浓度的两代之间的差异用星号表示。：P＜0.01。Same as Fig. 1 caption. The difference between different concentrations was indicated by different letters, and the difference between two generations at the same concentration was indicated by asterisk. : P < 0.01 ) 图 3 不同NPX浓度暴露下受精后5 d(a)和8 d (b)的胚胎心率 Fig. 3 Embryo heart rate of 5 d(a) and 8 d(b) after fertilization exposed to different concentrations of NPX |
为避免因匀浆浓度差异对实验结果造成影响，首先测定了F1代和F2代受精后8 d胚胎的蛋白质浓度，后续通过均一化方法衡量NPX暴露对海洋青鳉胚胎内与抗氧化系统相关的生物标志物的影响。胚胎总蛋白质浓度如图 4所示。
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( 同图一图注。Sameas Fig. 1 caption. ) 图 4 不同NPX浓度暴露下胚胎总蛋白浓度 Fig. 4 Total protein concentration of embryos exposed to different concentrations of NPX |
选择SOD活性、CAT活性、GST活性和GSH含量来评估不同NPX浓度暴露下F1代和F2代胚胎在受精后8 d时的抗氧化系统功能，并通过MDA含量判断氧化损伤。检测结果如图 5所示。
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( 同图 1图注。且不同浓度之间的差异用不同字母表示，同一浓度的两代之间的差异用星号表示。：P＜0.05;：P＜0.01。Same as Fig. 1 caption. The difference between different concentrations was indicated by different letters, and the difference between two generations at the same concentration was indicated by asterisk. : P < 0.05;：P＜0.01. ) 图 5 不同NPX浓度暴露下胚胎中SOD、CAT和GST的活性以及GSH和MDA的含量 Fig. 5 SOD, CAT, and GST activities, as well as GSH and MDA content in embryos exposed to different concentrations of NPX |
在本研究中，F1代和F2代的SOD活性同对照组相比均未出现显著变化，两代之间也无明显差异。F1代的CAT活性与对照组相比无显著差异，但在F2代中，10 μg·L-1处理组的CAT活性显著高于对照组，并与F1代的同浓度处理组存在显著差异。类似的，对于GSH含量，F1代各处理组与对照组相比无显著性差异，但在F2代中，10 μg·L-1处理组与对照组相比存在显著差异。此外，在相同浓度下，F2代的GSH含量均显著高于F1代。而GST活性在F1代和F2代中均显著降低，但相同浓度下两代之间无显著差异。MDA含量在F1代和F2代的所有处理组中均显著高于对照组，但各浓度之间无显著差异。然而，在F2代中，0.1和10 μg·L-1处理组的MDA含量显著高于F1代相同浓度的处理组。
3 讨论鱼类的早期生命阶段对环境污染物高度敏感，使其成为评估环境风险的重要模型[17]。本研究通过模拟环境相关浓度的长期暴露实验，系统探讨了NPX对海洋青鳉两个世代早期发育和抗氧化系统的影响。结果表明，NPX对海洋青鳉的孵化率及孵化时间的影响均与斑马鱼的研究结果相似[18]，即NPX暴露显著延长了胚胎的孵化时间，并在高浓度下导致孵化率显著下降。类似的现象也曾在酮洛芬暴露的斑马鱼中被观察到[19]。这一现象可能与污染物诱导的活性氧(ROS)过量生成相关[20]。ROS的累积会引发氧化应激，导致细胞分裂和器官分化的延迟，从而延缓胚胎发育进程，最终表现为孵化时间的延长和孵化率下降[21-22]。实验中观察到F1代和F2代的仔鱼死亡率在所有处理组中均显著升高，但F2代死亡率在某些浓度(如0.1和10 μg·L-1)下显著低于F1代。这可能是由于亲代在长期NPX暴露的压力下，通过表观遗传机制(如DNA甲基化或组蛋白修饰)将适应性信号传递至子代，从而增强了子代的耐受性，进而减轻其生存压力。
在海洋青鳉胚胎的发育过程中：受精后5 d，器官发育尚处于早期阶段，心脏刚开始规律跳动；受精后8 d，主要器官的初步分化已完成，心血管系统和肝脏代谢功能逐渐完善，此时心率通常达到峰值[23]。由于心脏是胚胎发育过程中最早形成并发挥功能的器官之一，对环境污染物尤为敏感[24]。因此，本研究选择受精后5和8 d作为心率的观察时间点。已有研究表明，暴露于不同污染物下的鱼类胚胎常表现出心律失常的现象[25-26]，而这通常也与污染物诱导的ROS过量生成有关[20, 27]。本研究中，除受精后8 d的1 μg·L-1处理组外，所有处理组的心率均显著下降，这表明NPX暴露可能对胚胎的心脏功能造成不良影响。值得注意的是，F2代胚胎在受精后5 d时并未表现出与F1代相同的心率下降，这反映出子代在长期污染物暴露后可能会表现出适应性反应。然而，这种适应性在受精后8 d未能维持，F1代和F2代的心率均显著降低，说明NPX的负面影响难以完全抵消。已有研究表明，跨代暴露会使一些生物(例如水蚤(Daphnia magna))表现出一定的适应性反应，特别是在抗氧化系统中[28]。为此，本研究进一步结合抗氧化系统相关指标对海洋青鳉的毒性效应进行分析。
通过测定抗氧化系统相关指标SOD、CAT、GSH和GST，以及氧化损伤标志物MDA，本研究分析了不同NPX浓度暴露对两代胚胎抗氧化能力的影响。结果显示，抗氧化系统的响应在两代之间存在显著差异，尤其是在10 μg·L-1NPX的暴露条件下，这种差异更为显著。
在鱼类胚胎中，SOD作为清除超氧阴离子(O2-)的关键酶，在抗氧化防御的早期阶段发挥重要作用，其主要将O2-转化为过氧化氢(H2O2)，反映了污染物引发的初级氧化应激水平，在此之后CAT将H2O2转化为水(H2O)和氧气(O2)，其活性则可反映出污染物对抗氧化防御能力的调节作用[29]。在本研究中，SOD活性在所有处理组中保持稳定，表明其可能对NPX暴露并不敏感。然而，CAT活性在F2代10 μg·L-1NPX处理组中显著上升，这表明F2代可能通过上调CAT活性来应对高浓度NPX暴露引发的H2O2累积。这种差异可能与F1代暴露引发的遗传或表观遗传调控有关。同样在抗氧化系统中发挥关键作用的GSH也表现出类似的变化，且在相同浓度下F2代的GSH含量均高于F1代。这种变化反映出F2代胚胎可能通过增强酶促和非酶促抗氧化系统中CAT和GSH的活性或含量，有效中和ROS，从而部分减轻NPX诱导的氧化应激损伤。值得注意的是，这些变化也体现在F2代胚胎的心率变化中，可能与通过增强抗氧化能力来部分保护心脏功能并缓解由ROS引起的心律失常有关[30]。
在本研究所检测的抗氧化系统相关指标中，胚胎的GST活性变化最为显著。GST通过催化GSH与外源亲电子化合物结合，协助转化有害物质或减少有机过氧化物，从而发挥解毒功能[31-32]。然而，在所有处理组中，F1代和F2代胚胎的GST活性均显著下降，这反映出NPX暴露可能通过直接或间接机制抑制GST的功能，削弱了GSH的解毒能力，降低ROS的清除效率。有研究发现，过量的ROS可直接作用于GST分子，导致其失活[33-34]，这可能是GST活性下降的重要原因之一。相比之下，F1代的GST活性下降更为显著，表明其抗氧化系统对NPX的防御能力较弱。在F2代中，尽管GST活性仍呈下降趋势，但体内GSH含量显著增加，这表明亲代的长期暴露可能引起了子代的适应性反应，增强了子代清除ROS的能力。然而，尽管GSH含量增加了，但由于其活性的下降，导致ROS的清除仍不完全。
MDA作为脂质过氧化的主要产物，是衡量氧化损伤程度的重要标志物[35]。本研究中，所有处理组的MDA含量均显著高于对照组，表明NPX暴露引发了胚胎内的脂质过氧化现象。尽管在F2代10 μg·L-1 NPX处理组中，CAT活性和GSH含量均显著增加，但其MDA含量仍然显著高于F1代相同处理组。这表明高浓度NPX暴露导致的ROS水平上升仍引发了更严重的氧化损伤。这一现象与Wang等[36]研究中观察到的斑马鱼(Danio rerio)跨代暴露于T-2毒素和环氧康唑的联合作用的结果一致。
进一步分析发现，MDA含量的增加与孵化时间的延长趋势大致一致，可能是由于NPX暴露诱发的氧化应激在胚胎发育关键期抑制了早期细胞分裂和器官分化，从而延缓细胞周期进程，最终导致胚胎发育延迟[37]。在心率方面，受精后8 d时各处理组的心率均显著下降，这可能与NPX诱导的脂质过氧化对心血管系统的直接损伤有关。已有研究表明，脂质过氧化会破坏心肌细胞膜的结构，导致心肌功能紊乱[38]，这解释了心率下降的原因。然而，更加值得关注的是，尽管F2代的MDA含量高于F1代，但在0.1和10 μg·L-1 NPX处理组中，F2代的仔鱼死亡率显著低于F1代，1 μg·L-1 NPX处理组也有明显降低。这可能是由于亲代海洋青鳉在长期暴露于NPX诱导的氧化应激后，通过表观遗传机制(如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控)将适应性信号传递给子代，从而调控子代的基因表达模式，增强了其抗氧化防御能力和环境耐受性[39]。这一适应性反应可能导致子代抗氧化相关基因的表达水平提高[40-41]，最终在蛋白水平上表现为F2代10 μg·L-1NPX处理组中CAT活性和GSH含量的显著上调。因此，尽管F2代胚胎的MDA含量更高，但由于其抗氧化防御能力的增强，NPX可能对机体的实际损伤有所减轻，最终使仔鱼死亡率下降。
4 结语在环境浓度下，NPX暴露普遍导致海洋青鳉胚胎的孵化率下降、孵化时间延长、心律失常以及仔鱼死亡率增加。此外，NPX显著影响了胚胎的GST活性，诱发了氧化损伤。跨代比较表明，尽管子代承受了更大的氧化损伤，但表现出了一定的适应性，死亡率有所下降。本研究结果不仅揭示了NPX暴露对鱼类生命初期发育的潜在风险，还反映了生物在长期污染压力下出现的适应性反应。然而，这种适应性反应的具体作用机理及其是否会进一步影响后代的健康和种群稳定性仍需通过更多的研究加以验证。
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