2026, Vol. 56
2. 青岛海洋科技中心海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266237
马里亚纳海沟(Mariana Trench)是地球上最深的海沟，位于北太平洋西部，大部分区域水深超过8 km。挑战者深渊是马里亚纳海沟的最深处，深达11 km，被认为是海洋中最深的地方。这里环境极端恶劣，具有超高净水压力、持续低温和黑暗等特征。同时，马里亚纳海沟具有独特的漏斗状地貌与特殊的沉积作用，使之成为有机质的富集区，滋养着大量微生物，其中不乏尚未被分离鉴定的新型细菌[1]。
1976年，Morita等[2]率先从马里亚纳海沟沉积物中分离出耐压假单胞菌(Pseudomonas bathycetes)，从此这一特殊环境中的微生物逐渐被培养和鉴定。现已发现马里亚纳海沟沉积物中生存着大量的深海细菌，包括非嗜极细菌和多种嗜极细菌，如嗜压菌[3-4]，其中许多菌属于未被报道的新分类单元[5-8]，这表明马里亚纳海沟沉积物中蕴藏着许多尚未被发现和鉴定的微生物。深海极端环境中的微生物可能拥有独特的生理和代谢特性，对这些微生物进行研究有助于揭示生命在极端环境中的演化路径和适应机制[9]。目前已有研究对深海微生物的培养方法进行探讨，但不同富集及分离培养条件对这些微生物的影响尚缺乏系统性的比较。
微生物富集培养是一种从复杂环境中分离出特定微生物的方法，该方法通过特定培养条件选择性地促进目标微生物种群的生长和增殖，最终分离出特定微生物[10-12]。该方法通过优化培养基成分和环境参数，增强了目标微生物的竞争优势，从而实现富集和纯化[13]。二甲基巯基丙酸内盐(Dimethylsulfoniopropionate，DMSP)是一种重要的海洋渗透调节剂，以往研究发现，马里亚纳海沟深海水体和沉积物中的细菌能够合成DMSP，用以抵抗深渊超高静水压力[14]。受低温和寡营养影响，海洋环境中的许多细菌处于活的非可培养状态(Viable but non-cultivable state, VBNC)，这些细菌需要先从休眠状态中复苏，才能恢复可培养状态[15]。藤黄微球菌(Mcrococcus luteus)分泌的一种蛋白类复苏促进因子(Resuscitation-promoting factor, Rpf)具有肽聚糖水解酶活性[16]，能使休眠中的细菌复苏[17]。在未可培养细菌的细胞壁中，惰性肽聚糖取代了新生肽聚糖，形成茧状结构的被膜，而Rpf可溶解惰性细胞壁，从而促进VBNC细菌的复苏生长; Rpf作用细胞壁后释放的小分子物质亦可作为信号物质参与后续复苏过程[18]。在一定条件下，Rpf还可以刺激正常细胞，包括高GC含量革兰氏阳性菌的生长[19]。目前已有研究发现，添加藤黄微球菌培养液上清(含天然Rpf)的培养基能够显著促进水体和土壤样品中的细菌生长，增加可培养细菌的数量和种类[16]。
本研究以2020年7月从马里亚纳海沟挑战者深渊10 816 m处采集的柱状沉积物为研究对象，采用多种培养策略，从不同深度的沉积物样品中富集和培养异养细菌，并对其进行分离纯化及16S rRNA基因鉴定，还通过对获得的潜在新型细菌进行初步分类鉴定明确其系统发育地位。本研究结果将为后续科学研究提供大量的深海菌株资源，并为深海极端环境下微生物的分离和培养提供新思路。
1 材料与方法 1.1 样品采集本研究中，马里亚纳海沟挑战者深渊(11°19.904′N, 142°12.083′E)沉积物样品是乘“东方红3号”科考船于2020年7月采集的，采样水深为10 816 m，重力柱长约7.5 m。样品采集后，在现场按照每段50 cm长度进行切割，储存至船载-80 ℃超低温冰箱。样品运送至实验室后，先置于4 ℃下进行初步解冻，随后进行精细的样品切割。将采集的沉积物划分为浅层(0~28 cm，共14层)、中层(43~176 cm，共8层)及深层(200~700 cm，共8层)。称取沉积物样品约0.4 g于10 mL无菌氯化钠溶液(2%, W/V)中混匀，以作为沉积物原液。
1.2 培养基本研究分离异养细菌采用的固体培养基为MA(Marine agar)和R2A(Reasoner’s 2A Agar)培养基，富集培养用的液体培养基为改良的MB(Improved marine broth, IMB)培养基、添加DMSP的IMB(IMB-DMSP)培养基和添加藤黄微球菌培养液上清的IMB(IMB-Rpf)培养基(见表 1)。MA培养基是一种专门用于培养海洋异养细菌的培养基，其成分模拟了海洋环境的盐浓度和养分。R2A培养基较MA培养基的营养浓度更低，适用于分离寡营养环境下的海洋异养细菌。IMB培养基是将MB培养基中的营养成分酵母提取物和蛋白胨分别稀释5倍和25倍，并添加丙酮酸钠和乙酸钠，以减少培养过程中优势菌代谢产生的过氧化物、自由基以及拮抗物质的毒害作用，从而诱导细菌从VBNC恢复。MA培养基、R2A培养基和IMB培养基的配置方法参考孙创等[20]提出的方法。
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表 1 培养基及配方 Table 1 Media composition and formulations |
IMB-DMSP培养基中添加了DMSP，后者是一种重要的海洋渗透调节剂，可提高深海微生物在实验室培养中的适应性[14]。IMB-Rpf培养基是在IMB培养基的基础上添加了10%的藤黄微球菌培养液上清，该上清中含有具有肽聚糖水解酶活性的蛋白因子，能促进VBNC细菌的复苏，增加可培养细菌的数量[19]。藤黄微球菌培养液上清的制备方法参考李云琪等[16]提出的方法。
1.3 细菌的富集培养和分离纯化对不同深度的沉积物样品均采用平板直接涂布法和富集培养法2种方式进行微生物分离培养。直接涂布培养方式如下：吸取1 mL沉积物原液，用生理盐水(0.85%，W/V)按10-1、10-2、10-3和10-4的浓度进行梯度稀释，分别吸取后3个稀释度的培养液200 μL，涂布于MA和R2A平板上，分别置于4、16和28 ℃恒温培养箱中静置培养，培养3和7 d后选取形态不同的单菌落，每个单菌落作为一株进行计数，采用四区划线法接种于新鲜的原固体培养基上，并在原温度下进行培养，将得到的单菌落继续采用划线法分离纯化3次，并进行菌种保藏。富集培养具体流程如下：取500 μL沉积物原液置于30 mL IMB、IMB-DMSP和IMB-Rpf培养基中，前者分别培养3和7 d，后两者培养21 d。富集培养结束后，自富集体系中吸取培养液1 mL，同样用生理盐水按梯度稀释后涂布在MA和R2A培养基平板上，分别置于4、16和28 ℃进行培养，培养3 d后进行异养细菌的分离纯化。
1.4 细菌基因组提取和16S rRNA基因序列扩增采用煮沸法[21]进行细菌基因组DNA的提取，对于煮沸法难以提取其DNA的菌株，先采用酶解法[22]将细菌细胞裂解，再使用细菌基因组提取试剂盒(FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit-BOX 2，供应商：南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行提取。以提取的细菌DNA为模板，使用通用引物B8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和B1510R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[23]进行16S rRNA基因扩增[24]。采用BsuRⅠ酶对PCR扩增产物进行酶切[25]，经琼脂糖凝胶电泳观察条带，选取不同酶切带型的扩增基因送至华大基因有限公司(青岛)进行单向测序。
1.5 16S rRNA基因序列比对与系统进化树构建采用Chromas软件对测序得到的DNA峰图进行质量检查，然后将得到的高质量16S rRNA基因序列(≥311 nt)上传至Ezbiocloud数据库(http://www.ezbiocloud.net/)进行BLAST同源性序列比对(比对时间2024年6月)。以16S rRNA基因序列相似度98.65%作为区分不同物种的阈值[26-27]，若相似度大于98.65%，则认为该菌株与其最相似菌株为同种，若相似度低于98.65%，则被认为是潜在新菌[26]。下载最相似菌株的16S rRNA基因序列，用Chromas软件的Clustal X功能模块截齐，再利用Mega7.0软件选用邻接法构建系统进化树，并用iTOL在线软件(https://itol.embl.de/)进一步美化进化树[28]。在分得的517株异养细菌中，通过16S rRNA基因共鉴定出144个种，将每个种的代表性16S rRNA基因序列上传至GenBank数据库，获得的登录号为PQ248404—PQ248481、PQ524530—PQ524595。
2 结果 2.1 挑战者深渊沉积物可培养细菌的多样性本研究采用多种培养策略，共从马里亚纳海沟挑战者深渊不同深度的沉积物样品中分离获得517株异养细菌。16S rRNA基因测序结果表明，这些细菌分属于4门、8纲、30目、42科、74属、144种。在门水平上，变形菌门(Proteobacteria，196株，分属于44种，占比30.56%)为最优势类群，其次为厚壁菌门(Firmicutes，174株，分属于37种，占比25.69%)、放线菌门(Actinobacteria，143株，分属于60种，占比41.67%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，4株，分属于3种，占比2.08%)(见图 1(A))。在纲水平上，这些菌主要来自芽孢杆菌纲(Bacilli，174株，37种，25.69%)、放线菌纲(Actinomycetia，143株，60种，41.67%)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria，104株，24种，16.67%)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria，91株，19种，13.19%)。鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia，2株，1种)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria，1株)、噬纤维菌纲(Cytophagia，1株)和黄杆菌纲(Flavobacteriia，1株)合计5株，占总菌种数的2.78%(见图 1(B))。
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图 1 马里亚纳海沟挑战者深渊沉积物可培养细菌门(A) 和纲(B)水平群落组成 Fig. 1 The community composition of culturable bacteria at the phylum (A) and class (B) levels from sediment of the Challenger Deep of the Mariana Trench |
在目水平上，隶属芽孢杆菌纲的芽孢杆菌目(Bacillales)是获得的可培养异养细菌数目和种类最多的目，共有169株(分属于34种)，其后按细菌数目由高到低排列依次为假单胞菌目(Pseudomonadales，59株，11种)、微球菌目(Micrococcales，58株，19种)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales，45株，9种)、微杆菌目(Microbacteriales，42株，12种)、红细菌目(Rhodobacterales，32株，9种)、根瘤菌目(Rhizobiales，22株，3种)、海洋螺菌目(Oceanospirillales，21株，3种)、丙酸杆菌目(Propionibacteriales，13株，6种)、Dermabacterales(7株，2种)、Brevibacteriales(6株，6种)、乳杆菌目(Lactobacillales，5株，3种)、肠杆菌目(Enterobacterales，5株，1种)、柄杆菌目(Caulobacterales，4株，2种)、分枝杆菌目(Mycobacteriales，4株，4种)、Dermatophilales(4株，3种)、溶杆菌目(Lysobacterales，4株，3种)、Bogoriellales(3株，2种)、Geodermatophilales(2株，2种)和鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales，2株，1种)的细菌。除此之外，本研究还分离得到红螺菌目(Rhodospirillales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、Cellulomonadales、链霉菌目(Streptomycetales)、Beutenbergiales、伯克氏菌目(Burkholderiales)、着色菌目(Chromatiales)、假诺卡氏菌目(Pseudonocardiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)和莫拉氏菌目(Moraxellales)的菌株各1株。
本研究中最优势的芽孢杆菌纲中包含18个属，其中大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)为第一大属，共44株细菌，分属于2个种，第二大属为Mammaliicoccus(33株，1种)。此外，该纲还包括普里斯特氏菌属(Priestia，20株，1种)、Cytobacillus(14株，4种)、游动球菌属(Planococcus，12株，3种)、芽孢杆菌属(Bacillus，10株，4种)和伪芽胞杆菌属(Fictibacillus，10株，2种)等。第二大纲放线菌纲中包含29个属，包括农球菌属(Agrococcus，27株，4种)、微球菌属(Micrococcus，19株，2种)、节杆菌属(Arthrobacter，12株，3种)、Citricoccus(8株，1种)、微杆菌属(Microbacterium，8株，5种)、柠檬球菌属(Leucobacter，7株，3种)、小短杆菌属(Brachybacterium，7株，2种)、考克氏菌属(Kocuria，7株，4种)、谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter，6株，1种)、短杆菌属(Brevibacterium，6株，1种)及类诺卡氏菌属(Nocardioides，6株，1种)等。α-变形菌纲中含有13个属，优势属包括袁其朋菌属(Qipengyuania，32株，4种)、副球菌属(Paracoccus，25株，7种)、Aliihoeflea(16株，1种)、Cereibacter(6株，1种)和Pelagerythrobacter(5株，1种)等。γ-变形菌纲中包括10个属，其中占比最高的是嗜冷杆菌属(Psychrobacter，30株，1种)，其后占比由高到低依次为Stutzerimonas(24株，1种)、色盐杆菌属(Chromohalobacter，13株，5种)、Alloalcanivorax(8株，2种)和Mixta(5株，1种)。此外，本文中分离自鞘脂杆菌纲的2株细菌均为Pedobacter属的Pedobacter indicus，而β-变形菌纲、噬纤维菌纲和黄杆菌纲各含有1株细菌，分别属于海洋杆菌属(Pontibacter)、马赛菌属(Massilia)和维诺格拉斯基氏菌属(Winogradskyella)，且这5株细菌均为16S rRNA基因相似度小于98.65%的潜在新菌。
以上研究结果表明，马里亚纳海沟挑战者深渊沉积物的可培养异养细菌具有极高的多样性。
2.2 挑战者深渊不同深度沉积物中可培养异养细菌的多样性为比较不同深度沉积物样品中的可培养菌多样性，根据沉积物中理化参数的变化情况，本研究将所有样品划分为浅部(0~28 cm)、中部(43~176 cm)及深部(200~700 cm)三个组别。分析发现，从浅部泥样中分离出318株(70种)可培养细菌，其中包含12株(9种)潜在新菌，分属于变形菌门、厚壁菌门和放线菌门，其优势门为变形菌门; 从中部泥样中分离出83株(28种)可培养细菌，其中包含13株(10种)潜在新菌，其优势门为厚壁菌门，优势纲为芽孢杆菌纲，潜在新菌率为35.71%;深部泥样中分离出116株(64种)可培养细菌，其中包含26株(21种)潜在新菌，其优势类群为放线菌门下的放线菌纲，其次为α-变形菌纲和芽孢杆菌纲，潜在新菌率为32.81%。
本研究分离获得的4个门中，变形菌门、厚壁菌门和放线菌门的细菌从浅部、中部和深部泥样中均可分离出，而拟杆菌门的细菌仅从中部和深部泥样中分离出。此外，从浅部、中部和深部泥样中均分离出芽孢杆菌纲、放线菌纲、α-变形菌纲和γ-变形菌纲，噬纤维菌纲和黄杆菌纲均仅从中部泥样中分离出，而鞘脂杆菌纲和β-变形菌纲均只从深部泥样中分离出。从不同深度中分离出的主要可培养微生物类群的差异可能说明，不同深度沉积物之间的微生物类群存在差异。
2.3 采用不同培养方法获得的异养细菌多样性通过直接涂布、IMB培养基富集培养3和7d后这3种方式，分别分离获得94株(47种)、186株(41种)和44株(15种)可培养细菌，这些细菌均分属于变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，变形菌门为直接涂布(41株，20种)和IMB培养基富集培养3d(100株，17种)2种方式所得可培养细菌的主要类群，而IMB富集培养7d后仅获得5种可培养微生物，分属于3个门。在纲水平上，这3种培养方式中均只分离出4纲(放线菌纲、芽孢杆菌纲、α-变形菌纲、γ-变形菌纲)。在直接涂布的样品中(见图 2(A1))，放线菌纲(29株，16种，种占比34.04%)占比略高于其他3纲(芽孢杆菌纲(24株，11种，种占比23.40%)，α-变形菌纲(17株，11种，种占比23.40%)，γ-变形菌纲(24株，9种，种占比19.15%)); 在IMB培养基富集3d的样品(见图 2(A2))中，α-变形菌纲(47株，8种，种占比20%)、γ-变形菌纲(53株，9种，种占比22.5%)和芽孢杆菌纲(57株，10种，种占比25%)为主要类群，放线菌纲(28株，13种，种占比32.5%)在菌株数量上占比最低，但具有最高的种数; 从IMB富集培养基富集7d的样品(见图 2(A3))中分离出9株α-变形菌纲(3种，种占比20%)、2株γ-变形菌纲(2种，种占比13.33%)、8株芽孢杆菌纲(5种，种占比33.33%)和24株放线菌纲(5种，种占比33.33%)，放线菌纲的菌株占比远高于其他3纲。这说明富集过程中，微生物的类群随着时间变化产生差异。分别如图 2(A4)和图 2(A5)所示，利用IMB-DMSP和IMB-Rpf培养基富集培养这2种方式，分别分离出79株(26种)和104株(61种)可培养细菌，包括4株(3种)拟杆菌门细菌，通过IMB-Rpf培养基富集培养而获得的最优势类群为放线菌门的放线菌纲(46株，31种，种占比50.82%)，而通过IMB-DMSP培养基富集培养而获得的细菌类群主要为放线菌纲(13株，10种，种占比38.46%)及厚壁菌门的芽孢杆菌纲(58株，9种，种占比34.62%)，这说明不同的复苏因子添加可对泥样中不同的可培养微生物群体具有选择性富集效果。在上述5种培养方法中，IMB-Rpf培养基分离获得的潜在新菌率最高(种占比32.79%)，其次为IMB-DMSP培养基(种占比30.77%)。
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( (A1) 直接涂布; (A2) IMB培养基富集培养3 d; (A3) IMB培养基富集培养7 d; (A4) IMB-DMSP富集培养; (A5) IMB-Rpf富集培养; (B1) MA培养基; (B2)R2A培养基; (C1) 4 ℃; (C2)16 ℃; (C3) 28 ℃。(A1) Direct plating; (A2) IMB medium for 3 days; (A3) IMB medium for 7 days; (A4) IMB-DMSP medium; (A5) IMB-Rpf medium; (B1) MA medium; (B2) R2A medium; (C1) 4 ℃; (C2) 16 ℃; (C3) 28 ℃. ) 图 2 不同培养方法下的马里亚纳海沟挑战者深渊沉积物纲水平可培养细菌多样性 Fig. 2 Diversity of culturable bacteria at the class level from sediment of the Challenger Deep of the Mariana Trench under different cultivation methods |
此外，本研究采用MA和R2A平板培养基对挑战者深渊沉积物样品中的微生物进行分离培养。分别如图 2(B1)和图 2(B2)所示，两种培养基所获得的最优势门均为变形菌门，最优势纲均为芽孢杆菌纲(MA：89株，33种，种占比25.3%;R2A：85株，31种，种占比28.97%)，但种类最多的纲为放线菌纲(MA：66株，33种，种占比39.76%;R2A：77株，41种，种占比38.32%)。其中，鞘脂杆菌纲(2株，1种，种占比1.2%)仅在MA固体培养基中分离出，β-变形菌纲、噬纤维菌纲和黄杆菌纲仅在R2A培养基中被分离获得(各1种，总占比2.8%(种占比))。本研究还将马里亚纳海沟深部沉积物微生物置于4、16和28 ℃下进行分离培养，分离培养结果分别如图 2(B3)、图 2(B4)和图 2(B5)所示。在门水平上，4和16 ℃下均能分离培养出厚壁菌门(4 ℃：15株，13种，种占比38.24%;16 ℃：16株，7种，种占比25%)、放线菌门(4 ℃：16株，13种，种占比38.24%;16 ℃：14株，12种，种占比42.86%)、变形菌门(4 ℃：14株，6种，种占比17.64%;16 ℃：17株，8种，种占比28.57%)和拟杆菌门(4 ℃：2株，2种，种占比5.88%;16 ℃：2株，1种，种占比3.57%)的菌株，而以28 ℃作为培养温度的环境中仅能培养出变形菌门(165株，34种，种占比31.78%)、放线菌门(113株，46种，种占比42.99%)、厚壁菌门(143株，27种，种占比25.23%)的细菌，未分离出拟杆菌门的细菌。
总体上，相较于直接涂布，通过富集培养的方式从沉积物样中获得可培养微生物的种类明显更多，而不同的富集时间、不同复苏因子的添加，均可对培养出的微生物种类及潜在新菌数量产生影响。通过添加DMSP和藤黄微球菌复苏因子进行富集培养，使更多先前未曾被分离培养出的异养细菌得以生长。此外，本研究采用MA和R2A平板培养基对挑战者深渊沉积物样品中的微生物进行分离培养(见图 2(B1)和图 2(B2))。结果显示，利用这两种培养基培养所获得的最优势门均为变形菌门，最优势纲均为芽孢杆菌纲。其中，β-变形菌纲、噬纤维菌纲和黄杆菌纲仅在R2A培养基中被分离获得，鞘脂杆菌纲仅在MA固体培养基中被分离出。本研究还将马里亚纳海沟深部沉积物微生物置于4、16和28 ℃下进行分离培养(见图 2(C1)—(C3)), 在门水平上，4和16 ℃下均能分离培养出厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门的菌株，而以28 ℃作为培养温度的环境中仅能培养出变形菌门、放线菌门和厚壁菌门的细菌，未分离出拟杆菌门的细菌。
2.4 马里亚纳海沟沉积物可培养细菌中的潜在新菌本研究所获得的517株可培养异养细菌中，有51株细菌与其最相似物种的16S rRNA基因相似度不超过98.65%，为潜在新分类单元(见表 2)，占本研究分离出的总菌株数量的10.21%，且有3株细菌与其最相似物种的16S rRNA基因相似度不超过94.50%，为潜在新属[29]。这些潜在新分类单元分属4门、8纲、20目、22科、37属、41种。其中，绝大多数潜在新分类单元分离自富集培养基。将本研究分离培养获得的51株潜在新分类单元与其已知最相似菌株共同构建基于16S rRNA基因的邻接系统进化树，如图 3所示。
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表 2 从挑战者深渊沉积物中分离出的潜在新菌种类 Table 2 Diversity of potential novel bacteria isolated from Challenger Deep sediments |
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图 3 马里亚纳海沟挑战者深渊沉积物可培养潜在新菌与参考菌株的系统发育树 Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of candidatus novel bacteria isolated from sediment of the Challenger Deep of the Mariana Trench and their closest relatives based on 16S rRNA gene sequences |
在门水平上，放线菌门有22株(分属于20种)潜在新菌，占潜在新菌总量的37.50%，其后依次为厚壁菌门(14株，10种)和变形菌门(11株，8种)，有4株(3种)为拟杆菌门的细菌。
在纲水平上，根据16S rRNA基因比对结果，初步确定这51个潜在新菌分属放线菌纲(22株，20种)、芽孢杆菌纲(14株，10种)、α-变形菌纲(7株，4种)、γ-变形菌纲(3株，3种)、鞘脂杆菌纲(2株，1种)、黄杆菌纲(1株)、β-变形菌纲(1株)和噬纤维菌纲(1株)。
这些潜在新菌分别隶属37个属，包括芽孢杆菌目中的大洋芽孢杆菌属(4株，2种)、Pseudalkalibacillus(3株，1种)、葡萄球菌属(Staphylococcus，2株，2种)、游动球菌属(2株，1种)以及Cytobacillus、Sutcliffiella和芽孢杆菌属(各1株); 微杆菌目中的微杆菌属(4株，2种)以及农球菌属和柠檬球菌属(各1株); 微球菌目中的假节杆菌属(Pseudarthrobacter，2株，2种)、微球菌属(2株，1种)以及Citricoccus和考克氏菌属(各1株); 根瘤菌目中的中生根瘤菌属(Mesorhizobium，3株，1种); 红细菌目中的Cereibacter(2株，1种)以及副球菌属和Luteovulum(各1株); 来自Dermatophilales纲的鸟氨酸微菌属(Ornithinimicrobium，2株，1种)和来自鞘脂杆菌目的Pedobacter(2株，1种)，以及丙酸杆菌目下属的Marmoricola和类诺卡氏菌属(各1株)。除这些属外，还有Stutzerimonas、小短杆菌属、乔治菌属(Georgenia)、短杆菌属、海洋杆菌属、Geodermatophilus、Streptomyces、Serinibacter、色盐杆菌属、马赛菌属、Methylohalomonas和维诺格拉斯基氏菌属各1株。另有3株细菌分属3个潜在新属。
3 讨论在门水平上，本研究获得的可培养细菌分属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门，与林钰等[28]在马里亚纳海沟5 381~6 300 m水深的沉积物中分离出的主要门类一致，也与马里亚纳海沟南端4 500 m水深的沉积物中的微生物主要群落相同[30]，但与Liu等[31]通过高通量测序在马里亚纳海沟沉积物中发现的主要门类具有较大差别。Liu等[31]在马里亚纳海沟深部沉积物的主要微生物类群为绿弯菌门(Chloroflexi)，其次为放线菌门、浮霉菌门(Planctomycetota)、Patescibacteria和变形菌门，这种差别或许源于研究手段的差异，本研究中分离出的细菌为可培养的微生物类群，而高通量测序采用的沉积物中的DNA含有来源于未被培养的微生物类群、死亡类群或胞外的DNA。在纲水平上，此次分离得到的微生物主要来自芽孢杆菌纲、放线菌纲、α-变形菌纲和γ-变形菌纲，与以往在马里亚纳海沟沉积物中被分离出的异养细菌的优势菌群一致[28]，但在本研究中，芽孢杆菌纲是马里亚纳海沟沉积物中的最优势类群，而非以往研究中的γ-变形菌纲[25, 32-34]。造成这一现象的原因可能有两个方面。一方面，这可能与海沟沉积物不同层次的环境特征有关。林钰等[28]的研究发现，马里亚纳海沟沉积物中，γ-变形菌纲在沉积物表层的相对丰度远高于深层，芽孢杆菌纲和放线菌纲则呈现相反趋势; Liu等[31]对马里亚纳海沟沉积物中微生物多样性的研究同样呈现该趋势。表层沉积物具有更高的含氧量，且有机物浓度更高，使得专性或兼性好氧的γ-变形菌纲的细菌更具竞争优势，而放线菌纲和芽孢杆菌纲的细菌大多为兼性厌氧并具有高GC含量的革兰氏阳性菌，对极端环境具有较强的耐受性，因此在含氧量和有机物浓度较低的海沟深层沉积物中具有更强的竞争力。另一方面，与以往研究中对马里亚纳海沟沉积物异养细菌的分离培养相比，本研究采用了R2A寡营养培养基作为分离培养基之一。该培养基中的可溶性淀粉可吸附细菌代谢过程中的有毒副产物，减少这些物质对微生物的抑制作用; 该培养基中的丙酮酸钠则具有抗氧化作用，有助于受损微生物的功能的修复; 此外，本研究还增加了添加各类复苏因子的富集培养过程，这些复苏因子使原本在极端环境下产生芽孢或者进入VBNC的芽孢杆菌纲和放线菌纲的细菌得以复苏，造成培养结果的差异。
本研究采用IMB培养基及添加了各种复苏因子的IMB培养基对样品进行富集培养，分离出大量适于寡营养环境的芽孢杆菌和放线菌。IMB培养基是在MB培养基的基础上进行改良的寡营养培养基，可以更好地模拟海洋的寡营养环境[35]。在常规的富营养培养基中，部分生长速度较快的微生物会在培养初期大量增殖，进而抑制了一些生长速度较慢的稀有微生物，使许多稀有的未培养微生物在富营养环境中难以被分离[36]。此外，高浓度的营养物质对一些寡营养微生物具有毒性作用[37]。IMB培养基将MB培养基中的主要营养物质酵母提取物和蛋白胨进行稀释，并进行一段时间的富集培养，使得低丰度或难以培养的菌株得到增殖的机会，最终被分离出来，从而提高了可培养海洋细菌的多样性。此外，IMB培养基中添加的丙酮酸钠和乙酸钠可降低培养过程中优势细菌种类代谢产生的过氧化物、自由基和一些拮抗物质的毒害作用，并诱导细菌从VBNC复苏[20]。本研究发现，采用IMB培养基富集培养3 d的样品中可培养微生物类群同直接涂布和富集7 d的样品差异较大，这说明是否富集培养以及富集培养时间的不同能影响分离出的海洋细菌的种类。
除利用IMB培养基直接富集培养外，本研究还分别采用添加了DMSP和藤黄微球菌培养液上清作为复苏因子的IMB-DMSP培养基和IMB-Rpf培养基进行富集培养。DMSP是一种重要的海洋渗透调节剂，DMSP可提高深海微生物对深海高静水压力的耐受性[14]。通过在IMB培养基中添加DMSP，可以更好地模拟海洋环境的自然条件，从而提高深海微生物在实验室的可培养性[38]。本研究中，芽孢杆菌纲是IMB-DMSP培养基富集培养获得的主要微生物类群，说明DMSP可能激活了芽孢杆菌的特定代谢途径，使其占据了优势地位。藤黄微球菌培养液上清中的Rpf蛋白具有肽聚糖水解酶活性，可对细菌细胞壁进行溶解，使休眠状态的细菌再次生长[16-18]。目前已有研究表明，Rpf因子可促进水体和土壤中一些高GC含量的革兰氏阳性菌的复苏生长，增加可培养细菌的多样性[16]。此外，由于Rpf蛋白对放线菌也具有很好的复苏效果，可明显提高放线菌的分离效率[39-40]，这与从本研究中发现的IMB-Rpf培养基中优势类群为放线菌纲的结果相符。本研究还发现，在添加了复苏因子的富集培养基中获得的潜在新种率显著高于未添加复苏因子的富集培养基和直接分离培养方式，表明复苏因子对于激活处于休眠状态的微生物至关重要，能够提高深海微生物的可培养性，使研究者能够分离出更多的微生物新类群。
本研究分离到的517株异养细菌中，有51株细菌(分属于41种)为潜在新分类单元，占本次实验中分离出的总菌株数的10.21%。值得注意的是，这51株潜在新分类单元绝大多数分离自富集培养后的样品，说明添加了复苏因子的富集培养方式有效提高了可培养微生物的多样性。本研究中分离出的4株拟杆菌门细菌均为潜在新分类单元，其中有2株菌株属于鞘脂杆菌纲，该纲细菌以往未在马里亚纳海沟沉积物中被分离出[28]。这2株细菌均分离自深层泥样，由此可推断，这2株细菌可能与挑战者深渊深部沉积物的特殊生境有关。
4 结语本研究通过多种培养策略，从马里亚纳海沟深部沉积物中分离出了大量的、高度多样的异养细菌，且包含潜在新分类单元。研究结果揭示了该极端深海环境中微生物群落的高度多样性，为后续科学研究提供了大量的菌株资源，对于深海微生物菌种资源库的扩充具有重要意义。此外，多种富集和分离条件为深海极端环境下微生物的分离和培养提供了新的思路。
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