2026, Vol. 56
2. 青岛海洋科学与技术中心，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237
长牡蛎(Crassostrea gigas)又称太平洋牡蛎，具有生长速度快、营养价值高等优点，是中国北方沿海地区养殖的主要海产经济贝类。福建牡蛎(C. angulata)也称葡萄牙牡蛎，是中国福建、广东、广西等南方沿海地区的重要养殖种类，具有耐热性强的优点。近年来，福建牡蛎的养殖规模逐年扩大，2022年福建牡蛎年产213万t，占中国牡蛎总产量的34%[1-2]。然而，由于二倍体牡蛎夏季产卵后软体部消瘦[3-4]，导致其无法实现全年稳定供应。
三倍体制种是一种重要的水产动物遗传改良手段，生产获得的三倍体牡蛎具有生长速度快、抗逆性强和夏季可供应市场等优点，能有效解决二倍体牡蛎养殖存在的问题[5-6]。同时，由于福建牡蛎和长牡蛎是近缘物种，二者之间不存在生殖隔离，具备开展杂交的可能性[7]。杂交育种作为一种重要的遗传改良技术，通过结合亲本双方的优良特征，能够引入不同基因组的优良性状，提高后代的遗传变异性和适应性，实现对后代性状的改良，如生长速度、存活率、抗逆性和产量等[8-9]。因此, 通过杂交育种和多倍体育种相结合获得的异源三倍体有望同时具备杂种优势和三倍体优势。
生产三倍体牡蛎的方式有两种：一种是通过使用诱导剂如细胞松弛素B(Cytochalasin B, CB)、咖啡因、6-DMAP等诱导二倍体受精卵获得，但是这种方式存在诱导率不稳定、幼虫死亡率高和操作繁琐等问题，在大规模生产中难以应用[10-12]。第二种是通过雌性二倍体和雄性四倍体杂交获得100%三倍体，通过这种方式获得的三倍体倍率稳定且操作简单，是目前规模化生产三倍体牡蛎的主流方法[13]。同样，三倍体牡蛎由于无法产生正常配子，难以延续下一代，无法直接对其进行选育。因此，培育性状优良的四倍体对于获得生长速度快、育性差、肥满度高的三倍体至关重要。根据卵子来源的不同，获得四倍体的方式分为两种，第一种是通过抑制二倍体受精卵第一极体的释放诱导四倍体[14-15]，第二种是使用三倍体的卵子与二倍体的精子结合，通过抑制受精卵第一极体的释放获得四倍体[16]。相比第一种方式，第二种方式因获得的子代成活率高，所以成为诱导四倍体的主要方式。Jiang等[17]用第二种方式对二倍体长牡蛎和福建牡蛎以及两种异源三倍体进行人工诱导，培育出四种异源四倍体，并对其生长、存活和性腺发育进行了评估，最终选择出两种性状优良的四倍体群体，并得到了两种生长速度快、肥满度高的新型异源三倍体[18]。
四倍体牡蛎是获得100%三倍体的基础，其继代选育对三倍体牡蛎规模化生产至关重要。然而，在进行诱导培育四倍体时，原始亲本数量少且有限，以此为基础进行长期的选育会导致其群体遗传多样性降低[16, 19]。为防止遗传多样性下降、近交衰退等问题，需要继续诱导异源四倍体，扩大基础群体数量。因此，本研究通过CB和低渗两种方式诱导异源四倍体，分析了不同诱导因素对卵裂率、孵化率及倍率的影响，以及两种诱导方法对幼虫的生长和存活的影响，旨在提高异源四倍体的诱导效果，为异源多倍体牡蛎制种提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用材料包括长牡蛎“海大1号”二倍体GG，以及异源三倍体牡蛎GGA(四倍体C. gigas ♀×二倍体C. angulata ♂)和AAG(四倍体C. angulata ♀×二倍体C. gigas ♂)，实验材料均取自山东黄岛养殖海区。实验前将种贝转移至烟台莱州育苗场进行暂养和促熟，促熟期间每日投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和扁藻(Platymonas subcordiformis)，按1∶1比例投喂，投喂量依据亲贝摄食情况及残饵量确定。性腺发育成熟后开始实验。实验开始前，参考Chen等[20]方法使用流式细胞仪对亲贝进行倍性检测，确保实验组雄贝为二倍体(见图 1A)，雌贝为三倍体(见图 1C和D)，并挑选性腺发育良好的个体进行实验。
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( A. 二倍体长牡蛎雄性；B. 二倍体长牡蛎雌性; C. 异源三倍体GGA；D. 异源三倍体AAG；E. CB诱导异源四倍体GGAG组; F.低渗诱导异源四倍体GGAG组；G. CB诱导异源四倍体AAGG组；H. 低渗诱导异源四倍体AAGG组。A. Malediploid C. gigas; B. Femalediploid C. gigas; C. Allotriploid GGA; D. Allotriploid AAG; E. CB-induced allotetraploid GGAG; F. Hypotonic treatment-induced allotetraploid GGAG; G. CB-induced allotetraploid AAGG; H. Hypotonic treatment-induced allotetraploid AAGG. ) 图 1 流式细胞仪检测牡蛎亲贝及幼虫倍性 Fig. 1 Ploidycomposition of the parents and larvae of the oysters by flow cytometer |
人工解剖并通过显微镜鉴别雌雄，舍弃雌雄同体个体。实验组筛选出卵圆形且卵质均匀的三倍体(GGA和AAG)雌性个体各10只，挑选精子活力旺盛的二倍体GG雄性个体20只。对照组为10只二倍体长牡蛎“海大1号”雌性个体。所有组别的亲贝均分开放置，以防意外污染。对照组则以二倍体长牡蛎“海大1号”作为对照，分开放置，避免意外污染。人工取卵后，用500目(孔径约25 μm)筛绢网洗卵，并使用新鲜的海水浸泡促熟30 min，待90%以上的卵子熟化完成时，另行人工采集精子并在新鲜海水中活化2~3 min，随后用于受精。控制实验水温为25 ℃，盐度为30。
1.3 实验设计实验组将两种异源三倍体(GGA和AAG)的雌性个体分别与二倍体长牡蛎“海大1号”(GG)雄性个体受精。通过不同浓度的CB和不同盐度(低渗)两种方式抑制第一极体排放，从而诱导四倍体，并确定这两种方法的最佳处理浓度和时间。之后，在最佳条件下重复诱导实验以验证效果。对照组使用二倍体长牡蛎“海大1号”，不做任何处理。实验重复3次。
本实验优化3个主要影响因素：诱导剂种类、处理强度和处理时长。实验设置不同因素水平，记录每组的卵裂率、孵化率和倍率，并参考诱导效率指数确定最佳诱导条件。
1.3.1 CB诱导四倍体(1) 将每个实验组的受精卵平均分成4份，当三倍体受精卵刚出现第一极体(PB1)时，使用4个不同浓度(0.2、0.4、0.6和0.8 mg/L)的CB处理15 min，再使用500目筛绢网洗卵以去除多余精子，随后浸入含0.1%二甲基亚砜(DMSO)的海水中以清洗残留的CB，之后再次用筛绢网洗卵，移至60 L塑料桶中进行孵化。24 h后收集各处理组部分D形幼虫进行倍性检测，通过比较确定最佳处理浓度。(2)将每个实验组的受精卵平均分成4份，当三倍体受精卵刚出现第一极体(PB1)时，使用0.4 mg/L的CB分别处理10、15、20和25 min，随后进行洗卵和浸泡，并转移至60 L塑料桶中进行孵化。24 h后收集各处理组部分D形幼虫进行倍性检测，通过比较确定最佳处理时间。(3)采用上述最佳处理浓度和最佳处理时间进行处理，随后进行洗卵和浸泡，并转移至60 L塑料桶中进行孵化。
1.3.2 低渗诱导四倍体(1) 将每个实验组的受精卵平均分成4份，当三倍体受精卵刚出现第一极体(PB1)时，使用4个不同盐度(6、8、10和12)的海水处理15 min，再使用500目筛绢网洗卵，洗去其中多余精子，随后移至60 L塑料桶中进行孵化。24 h后收集各处理组部分D形幼虫进行倍性检测，通过比较确定最佳处理浓度。(2)将每个实验组的受精卵平均分成4份，当三倍体受精卵刚出现第一极体(PB1)时，使用8的盐度分别处理10、15、20和25 min，随后进行洗卵，并转移至60 L塑料桶中进行孵化。24 h后收集各处理组部分D形幼虫进行倍性检测，通过比较确定最佳处理时间。(3)采用上述最佳处理浓度和最佳处理时间进行处理，随后进行洗卵，并转移至60 L塑料桶中进行孵化。
1.4 幼虫培育将最佳诱导条件下获得的幼虫于60 L塑料桶中进行培育。培育过程中每天换水1次，换水量为总体积的1/2，持续微充气，水温24~25 ℃，盐度28~30。幼虫前期的饵料以球等鞭金藻为主，后期按照1∶1的比例适量添加扁藻，每天投喂3次，投喂量依据幼虫摄食情况和残饵量确定。
1.5 数据分析对实验组和对照组的多个指标进行测量，包括卵裂率、孵化率、四倍体率、幼虫存活率和壳高，并计算诱导效率指数。卵裂率为受精后8 h内卵裂的受精卵数量与总卵数的百分比；孵化率为24 h时D形幼虫数与受精卵的百分比，采集最佳诱导条件下孵化后2、4、6、8和10 d的幼虫样品，测量幼虫期的存活率等各项指标。幼虫存活率为存活幼虫的数量与孵化后幼虫数量的百分比，幼虫四倍体率为四倍体幼虫占诱导群体的百分比，通过流式细胞仪测定，诱导效率指数为幼虫四倍体率与孵化率的乘积，壳高为衡量幼虫期的生长指标，通过卢戈氏液固定，用Image Pro Plus 6.0软件测量。
实验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 27.0软件对生长和存活等数据进行单因素方差分析及邓肯(Duncan)多重比较法分析，显著性水平设为0.05。
2 结果 2.1 CB诱导异源四倍体效果比较 2.1.1 不同CB浓度对两种异源四倍体率的影响异源四倍体GGAG组的幼虫卵裂率和孵化率随着CB浓度的增加呈逐渐降低的趋势，而四倍体率呈先升高后降低的趋势。当CB浓度为0.6 mg/L时，诱导效率指数(0.215±0.020)显著高于其他处理组(P < 0.05, 见图 2A)，诱导组四倍体率为(37.80±2.24)%。异源四倍体AAGG的卵裂率和孵化率随着CB浓度的增加呈逐渐降低的趋势，而四倍体率随着CB浓度的增加呈先升高后降低的趋势。当CB浓度为0.6 mg/L时，诱导效率指数最大，为0.219±0.018(见图 2E)，诱导组四倍体率为(42.27±0.85)%。
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( A. 不同CB浓度诱导GGAG组；B. CB处理不同时间组诱导GGAG组；C. 不同低渗梯度诱导GGAG组；D. 低渗处理不同时间诱导GGAG组；E. 不同CB浓度诱导AAGG组；F. CB处理不同时间组诱导AAGG组；G. 不同低渗梯度诱导AAGG组；H. 低渗处理不同时间诱导AAGG组。GG：对照组。同一指标具有相同字母表示组间差异不显著(P>0.05), 具有不同字母表示组间存在显著差异(P < 0.05)，下同。A. The group of GGAG under different CB concentrations; B. The group of GGAG under different CB induction times; C. The group of GGAG under different hypotonic treatment gradients; D. The group of GGAG under different hypotonic treatment induction times; E. The group of AAGG under different CB concentrations; F. The group of AAGG under different CB induction times; G. The group of AAGG under different hypotonic treatment gradients; H. The group of AAGG with different hypotonic treatment induction times. GG: Control group. The same indicators with the same letters indicate that the difference between the groups is no significant (P>0.05), and different letters indicate that there is a significant difference between the groups (P < 0.05), the same applies below. ) 图 2 不同处理条件下的两种牡蛎异源四倍体的诱导效果比较 Fig. 2 Comparison of induction effects of two allotetraploids oysters under different treatment conditions |
异源四倍体GGAG组幼虫的卵裂率、孵化率随着CB处理时间的延长呈逐渐降低的趋势，但GGAG的四倍体率呈先升高后降低的趋势。当CB处理时间为15 min时，诱导效率指数(0.210±0.013)显著高于其他处理组(P < 0.05, 见图 2B)，诱导组四倍体率为(33.63±1.63)%。在CB诱导异源四倍体AAGG组中，随着处理时间的延长，AAGG的卵裂率、孵化率出现降低的趋势，但四倍体率呈先升高后降低的趋势。当CB处理时间为20 min时，诱导效率指数最大，为0.171±0.015(见图 2F)，诱导组四倍体率为(37.04±1.61)%。
2.2 低渗诱导异源四倍体效果比较 2.2.1 不同低渗条件对两种异源四倍体率的影响异源四倍体GGAG组幼虫卵裂率和孵化率呈现出随着盐度的增加而升高的趋势，但GGAG四倍体率却呈先升高后降低的趋势。在盐度为8时，诱导效率指数最大，为0.138±0.011(见图 2C)，诱导组四倍体率为(28.84±1.53)%。在低渗处理诱导异源四倍体AAGG组中，诱导组幼虫卵裂率和孵化率随着盐度的增加而升高，AAGG的四倍体率却呈先升高后降低的趋势。当处理的盐度为10时，诱导效率指数(0.165±0.010)显著高于其他处理组(P < 0.05, 见图 2G)，诱导组四倍体率为(29.44±1.08)%。
2.2.2 低渗处理不同的诱导持续时间对两种异源四倍体率的影响在低渗诱导异源四倍体GGAG组中，GGAG幼虫的卵裂率、孵化率随着低渗处理时间的延长呈逐渐降低的趋势，但四倍体率随着低渗时间的延长呈先升高后降低的趋势。当低渗处理时间为15 min时，诱导效率指数(0.191±0.014)显著高于其他处理组(P < 0.05, 见图 2D)，诱导组四倍体率为(28.19±1.61)%。在低渗诱导异源四倍体AAGG组中，随着低渗处理时间的延长，AAGG的卵裂率、孵化率出现降低的趋势，但四倍体率随着低渗时间的延长呈先升高后降低的趋势。当处理时间为15 min时，诱导效率指数达到最大值，为0.184±0.007(见图 2H)，诱导组四倍体率为(27.03±1.69)%。
2.3 两种诱导方法对两种异源四倍体幼虫生长的影响第2天时，GGAG组的CB处理组和低渗处理组的幼虫壳高显著高于对照组(P < 0.05, 见图 3)。第4天时，CB处理组幼虫壳高显著高于低渗处理组和对照组(P < 0.05, 见图 3)，但低渗处理组和对照组之间没有显著差异(P>0.05)。第6天时，CB处理组和对照组的幼虫壳高均显著大于低渗处理组(P < 0.05, 见图 3)，但CB处理组与对照组之间的幼虫壳高无显著差异(P>0.05, 见图 3)。8 d后，对照组幼虫壳高显著大于CB处理组和低渗处理组(P < 0.05, 见图 3)。到10日龄时，CB诱导组幼虫壳高为(139.62±7.54)μm，低渗处理组为(125.63±5.69)μm，对照组幼虫为(150.47±8.88)μm。
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( A.GGAG组壳高；B.GGAG组存活率。CB: CB处理组；HT: 低渗处理组；GG: 对照组。A. The shell height of GGAG; B. The survival of GGAG. CB: CB group; HT: Hypotonic treatment group; GG: Control group. ) 图 3 两种诱导方法对异源四倍体GGAG幼虫生长和存活的影响 Fig. 3 Effects of two inductive methods on larvae growth and survival of allotetraploid oyster GGAG |
第2天时，AAGG组CB处理组和低渗处理组幼虫的壳高显著高于对照组(P < 0.05, 见图 4)。第4天时，CB处理组幼虫壳高显著高于对照组(P < 0.05, 见图 4)，但CB处理组与低渗处理组、低渗处理组与对照组之间无显著差异(P>0.05, 见图 4)。6 d后，对照组的幼虫壳高显著大于CB处理组和低渗处理组(P < 0.05, 见图 4)，CB处理组的幼虫壳高显著大于低渗处理组。到10日龄时，CB诱导组的幼虫壳高为(133.32±9.67)μm，低渗处理组的幼虫壳高为(119.48±9.96)μm。
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( A.AAGG组壳高；B.AAGG组存活率。CB：CB处理组；HT：低渗组；GG：对照组。A. The shell height of AAGG; B. The survival of AAGG. CB: CB group; HT: Hypotonic treatment group; GG: Control group. ) 图 4 两种诱导方法对异源四倍体AAGG幼虫生长和存活的影响 Fig. 4 Effects of two inductive methods on larvae growth and survival of allotetraploid oyster AAGG |
在2~10日龄时，GGAG的幼虫存活率为对照组>CB处理组>低渗处理组，各组间差异显著(P < 0.05, 见图 3)。在6~8日龄时，GGAG的CB处理组和低渗处理组幼虫发生了大规模死亡且各组之间的差异显著(P < 0.05, 见图 3)。培养至10日龄时，GGAG的幼虫存活率如下：CB处理组为(25.63±1.49)%，低渗处理组为(14.26±1.83)%，对照组为(55.98±1.57)%。
在2~4日龄时，幼虫存活率为对照组>CB处理组>低渗处理组，各组间差异显著(P < 0.05, 见图 4)。到6日龄时，CB处理组和低渗处理组幼虫出现大规模死亡现象，但CB处理组与对照组的存活率差异不显著(P>0.05，见图 4)，而低渗处理组与其他两组的存活率差异显著(P < 0.05, 见图 4)。在8~10日龄时，幼虫存活率为对照组>CB处理组>低渗处理组，各组间差异显著(P < 0.05, 见图 4)。培养至10日龄时，AAGG的幼虫存活率如下：CB处理组为(25.85±2.40)%，低渗处理组为(14.40±3.80)%，对照组为(55.98±1.57)%。
3 讨论 3.1 CB和低渗诱导四倍体的原理和效果CB能特异性作用于微丝，通过抑制收缩环的收缩功能，影响分裂沟的形成，阻止细胞继续分裂，从而诱发多倍体的形成[21]。然而，CB在诱导多倍体的同时，对受精卵产生了毒害作用，幼虫孵化率和存活率较低。本研究显示：当CB浓度过低时，不能有效抑制受精卵第一极体(PB1)的排放，导致诱导率较低；当CB的浓度过高时，由于其毒性，受精卵难以正常发育，导致幼虫卵裂率和孵化率降低、死亡率升高和四倍体率下降。
低渗诱导多倍体的原理尚未明确，可能是通过人工改变渗透压使受精卵受氧化胁迫导致糖代谢紊乱或渗透调节受阻，影响受精卵纺锤体中微丝和微管的形成，进而影响极体的形成产生多倍体[22]。低渗诱导的优点是价格低廉、操作简单，但存在幼虫孵化率和成活率低的问题。本研究显示，低渗诱导的两种四倍体幼虫存活率均较低，这可能是由于盐度过低对受精产生了不可逆的伤害，孔静等[23]发现受精卵在低渗条件下，吸水膨胀，受精率下降。
3.2 影响四倍体率的因素诱导剂的类型、处理浓度、诱导持续时间、诱导时机以及环境等因素会影响多倍体的诱导效果[4, 24-25]。本研究显示，随着诱导剂强度的提高，卵裂率和孵化率逐渐减小，但四倍体率出现先升高后降低的趋势，程庚等[26]使用低渗诱导长牡蛎“海大2号”三倍体时，发现随着盐度提高，卵裂率和孵化率会逐渐上升，但三倍体率会逐渐下降。诱导剂作用时间对于诱导效果也有很大影响。本研究显示，随着诱导时间的延长，两种方法的卵裂率和孵化率逐渐下降，但四倍体率先升高后降低，在本研究条件下，处理15 min左右时诱导效果最佳。诱导剂加入的时机也是影响诱导效果的重要因子，于瑞海等[27]在长牡蛎受精卵出现了50%第一极体时，用CB持续处理15 min，最终得到子代的三倍体率为91.5%。此外，在进行多倍体诱导时，保持卵子发育的同步性和受精时精卵比例也是提高四倍体诱导率的重要因素[28]。
3.3 两种诱导方法对两种异源四倍体幼虫生长和存活的影响GGAG诱导组前6 d壳高要显著大于对照组，后4 d小于对照组，其中CB处理组壳高显著大于低渗处理组，这可能是因为三倍体的卵的直径比二倍体卵的直径大10%，细胞体积更大，导致在幼虫发育前期，四倍体诱导组的壳高大于二倍体对照组[29]。在幼虫发育后期，四倍体幼虫出现基因表达不平衡，而基因表达不平衡反过来影响到四倍体幼虫的发育，表现出发育迟缓等现象，导致对照组壳高大于诱导组[14]。Meng等[30]用低渗诱导虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)时，发现低渗处理的虾夷扇贝幼虫存在生长“劣势”。同时，周建民等[31]利用CB和低渗诱导长牡蛎“海大3号”四倍体时，也发现低渗处理组幼虫生长速度慢于CB处理组的现象。AAGG幼虫生长表现与GGAG类似，但GGAG在10 d内的生长速度显著快于AAGG，这可能存在母体效应，母体效应通常出现在杂交过程中，母体效应可以解释早期发育阶段的大部分变异，而卵子来源是影响幼虫早期发育阶段的生长性状的第二大因素，染色体的来源和组合的不同导致了后代生长快慢的差异[17, 32-33]。因此，本研究中，GGAG组的卵子来源于母本GGA，其中母本的两条染色体由长牡蛎提供，而AAGG组卵子来源于母本AAG，母本的两条染色体来自于福建牡蛎，这种染色体来源和组合的差异可能导致GGAG组在幼虫期的生长速度快于AAGG组。
对于两种异源四倍体幼虫，均表现出CB处理组和低渗处理组的幼虫存活率均低于对照组。可能的原因有以下两点：(1)诱导过程中受精卵发育具有不同步性，在诱导过程中产生了非整倍体，随着非整倍体的死亡，导致幼虫死亡率上升[34-36]。(2)CB具有高毒性，能让受精卵产生畸形或死亡，而低渗会使部分受精卵吸水胀破，对幼虫的正常生理活动造成不可逆的影响。
4 结语本研究探讨了CB和低渗两种处理方法诱导异源四倍体的效果，阐明了两种方式下获得两种异源四倍体最佳诱导条件。依据四倍体率和诱导效率指数综合来看：对于异源四倍体GGAG，采用0.6 mg/L CB，持续诱导15 min效果最佳；采用盐度8，持续诱导15 min效果最佳。对于异源四倍体AAGG，采用0.6 mg/L CB，持续诱导20 min效果最佳；采用盐度10，持续诱导15 min效果最佳。本研究结果将为异源四倍体牡蛎的人工诱导提供参考。
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2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China