2026, Vol. 56
先天免疫(Innate immunity)，又称固有免疫，是机体出生起便具备的非特异性防御功能[1]。除皮肤和黏膜处的屏障、黏液、溶菌酶和胃酸等物质外，补体系统、吞噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞也都属于先天免疫系统[2]。二十世纪八十年代以来，随着Janeway[3]提出了“模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)”的假设，真正的“先天免疫革命”拉开了帷幕，这些受体蛋白能够识别“病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)”，进而向机体发出感染存在的信号。其中，Toll样受体(Toll-like Receptor，TLR)最先被发现，随后NOD样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)、C型凝集素受体(C-type lectin receptor，CLR)、RIG-Ⅰ样受体(Retinoic acid-inducible gene-I-like receptors，RLR)、AIM2样受体(AIM2-like receptor，ALR)以及环状GMP-AMP合成酶(Cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)等陆续被鉴定出来。不同的模式识别受体激发生物体内不同的信号途径，最终通过效应分子达到消灭病原体的目的，这充分体现了天然免疫分子机制的复杂性。
天然免疫作为机体抵抗病原体入侵的第一道防线，在抗病毒感染过程中发挥着至关重要的作用。随着进化历程的推进，从无脊椎动物到脊椎动物，天然免疫机制不断地发展与完善。文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum)在生物进化中处于无脊椎动物向脊椎动物进化的关键节点，为探究抗病毒天然免疫系统的起源与进化提供了珍贵的研究素材。从关注文昌鱼的凝血物质[4]，到发现文昌鱼体腔中可对颗粒性抗原做出反应的游离细胞[5]，关于文昌鱼免疫系统的探索从未止步。文昌鱼基因组分析显示，其基因组涵盖多个TLR、NLs以及清道夫受体(Scavenger receptor, SR); 同时，一些免疫相关基因家族在文昌鱼基因组中是扩张的，例如：C型凝集素、涵盖富亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat domain，LRR)和IGcam结构域的基因; 补体C1q-like、纤维凝胶蛋白Ficolin-like、含有补体相关结构域的基因; 肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF)、起始凋亡蛋白酶(Initiator caspases)和含有死亡折叠结构域的基因等[6]。尤为值得一提的是，文昌鱼具备复杂的肿瘤坏死因子系统与补体系统，这在其他无脊椎动物中并未发现[6]。这些研究成果[1-6]极大地丰富了相关研究者对这一古老而又关键的免疫调控体系的认知。本文系统概括了文昌鱼抗病毒天然免疫中的模式识别受体、信号通路、效应分子及其他相关机制的研究进展，并将其与脊椎动物抗病毒天然免疫进行对比，旨在展现文昌鱼抗病毒天然免疫调控网络的复杂性与独特性，为深入理解脊椎动物抗病毒免疫的进化历程提供参考依据。
1 文昌鱼抗病毒天然免疫模式识别受体模式识别受体(PRRs)是一类主要表达于固有免疫细胞表面的可识别一种或多种病原相关分子模式(PAMPs)的识别分子。PRRs对PAMPs的识别激活了细胞内信号通路，最终诱导炎症细胞因子、趋化因子和干扰素(Interferon，IFN)的产生以及共刺激分子的上调[7]。目前，已有多种可能的模式识别受体在文昌鱼中被鉴定出来，比如革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria-binding proteins, GNBPs)[8]、肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)[9]、具有双重功能的模式识别受体亲和素avidin[10]、低密度脂蛋白受体相关蛋白(Low-density lipoprotein receptor-related protein, LRP)[11]、可以识别内源性损伤分子模式(Endogenous damage-associated molecular patterns, DAMPs)中细胞外ATP(Extracellular ATP, eATP)的p2x7受体[12]、dsRNA传感器DDX23[13]以及典型的Toll样受体[14]和RIG-Ⅰ样受体[15]等，其中，DDX23、Toll样受体和RIG-Ⅰ样受体均是文昌鱼抗病毒天然免疫的模式识别受体。图 1展示了这3种模式识别受体及其介导的信号通路。
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( ①—③为3种抗病毒天然免疫模式识别受体。“？”表示本研究推测的尚未验证过的步骤或参与该步骤的分子。①—③ are recognition receptors for three types of antiviral innate immune modes. "?" indicates the unproven step in the study′s hypothesis or the molecules involved in that step. ) 图 1 文昌鱼中抗病毒天然免疫模式识别受体及其介导的信号通路 Fig. 1 Antiviral innate immune pattern recognition receptors and their mediated signaling pathways in amphioxus |
Toll样受体(TLR)最早在果蝇中被发现并命名，其在识别病毒病原体相关分子模式后启动天然免疫信号转导[16]。哺乳动物中，在树突状细胞(Dendritic cell，DC)、淋巴细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞中表达的TLR家族作为PRRs，在诱导先天免疫反应以及随后的适应性免疫反应[17]中起着关键作用。TLR是Ⅰ型膜蛋白，其特征是包含一个由富亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat, LRR)组成的负责识别PAMPs的胞外域，以及一个与IL-1受体细胞质区域同源的下游信号传递所必需的TIR结构域。当TLRs识别PAMPs后，TLRs会募集同样含TIR结构域的适配器，如MyD88、TRIF、TIRAP/MAL或TRAM，从而启动下游的信号转导，激活NF-κB、IRF或MAPK，进而调节趋化因子或Ⅰ型IFN等细胞因子的表达，最终保护宿主免受感染[18]。TLR有两种结构类型：脊椎动物样TLR(V-TLR)和原生动物样TLR(P-TLR)。与V-TLR相比，P-TLR在LRR胞外域部分的N端有一个额外的LRRCT-LRRNT的基序[19]。到目前为止，在脊椎动物中发现了27个TLR(TLR1—16、18—28)，可分为6个亚家族(TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11亚家族)。其中，在人和小鼠中分别鉴定出10个和12个功能性TLR。每个TLR在PAMP识别和免疫反应中都有独特的功能。将哺乳动物与鱼类的TLR家族组成进行对比(见表 1)发现，相较于哺乳动物，鱼类中的TLR亚家族成员得到了不同程度的扩增。
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表 1 哺乳动物与鱼类TLR家族组成对比 Table 1 Comparison of TLR family composition between mammalian and fish |
文昌鱼基因组中至少含有48个TLR基因，其中包含36个V-TLR和12个P-TLR[6]。其中，文昌鱼中30个TLR成员得到了转录验证[14]。TLR蛋白的下游适配器MyD88也在文昌鱼中具有丰富的类别。这些发现意味着脊椎动物的祖先可能拥有更复杂和强大的TLR系统。值得关注的是日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum，曾用名青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense))中的bbtTLR1是在进化上较为特殊的一种V-TLR。其胞外区含有1个LRRNT、22个LRR和1个LRRCT基序，在细胞质区含有1个TIR结构域。其中，LRR3和LRR4之间、LRR10和LRR11之间存在两个长插入片段，而脊椎动物TLR(如人TLR4)及无脊椎动物Toll(如海鞘Toll-3)中则无类似插入。这些插入区域可能扩展了bbtTLR1对抗原的识别谱。在HEK293T细胞中共转染bbtTLR1和bbtMyD88，可增强NF-κB的激活，说明文昌鱼中的V-TLR可能会通过TLR-MyD88-NF-κB这一信号途径发挥抗病毒免疫作用[20]。对欧洲文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum)BlTLR的研究表明，其归类于TLR11亚家族，定位于质膜。值得注意的是，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和双链RNA类似物聚肌胞苷酸poly(I∶C)的刺激均不能诱导BlTLR的表达发生变化，而且在HEK293T细胞系中稳定表达BlTLR也不能激活NF-κB的转录; 但由BlTLR胞外域和人TLR2的TIR结构域融合成的嵌合蛋白却可以识别poly(I∶C)，并启动下游NF-κB信号，这说明BlTLR胞外LRR具有识别poly(I∶C)的潜力，但其天然TIR结构域无法有效招募信号接头蛋白(如MyD88)，需依赖人源TIR完成信号传导[14]。已报道TLR11亚家族中的TLR3和TLR22也可以识别poly(I∶C)，但只有TLR22定位为于质膜。因此，BlTLR极有可能是具有TLR22功能的新型受体，可能与TLR22有共同的祖先[14]。
1.2 文昌鱼RIG-Ⅰ样受体LGP2视黄酸(又名维A酸)诱导基因Ⅰ(Retinoic acid inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)样受体(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)家族作为细胞质中重要的PRRs，能够识别病毒双链RNA，是抗病毒天然免疫非常重要的组成部分。该家族有3个成员：LGP2、RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相关蛋白5(Melanoma differentiation associated protein 5，MDA5)。这些受体都有一个含有RNA解旋酶结构域的DExD/H结构，且共享一个参与RNA识别的C端结构域(C-terminal domain，CTD)。另外，RIG-Ⅰ和MDA5在其N端还有一个串联半胱天冬酶募集结构域(Caspase activation and recruitment domain，CARD)。当被激活时，串联CARD通过与线粒体抗病毒信号(Mitochondrial antiviral-signaling)蛋白MAVS或IPS-Ⅰ相互作用，诱导下游信号转导，导致NF-κB和IRF-3被活化，驱动Ⅰ型IFN和促炎细胞因子的基因表达[21]。而对于LGP2来说，其缺乏串联CARD，被认为在信号触发方面存在缺陷。小鼠敲除实验表明LGP2上调免疫反应，LGP2增强MAV5对病毒的识别[22-23]。
文昌鱼中也存在RLR蛋白家族，但目前仅有研究[15]验证过文昌鱼LGP2蛋白与脊椎动物LGP2蛋白之间存在保守性，而文昌鱼RIG-Ⅰ和MDA5是否只有序列信息尚待实验验证。具体而言，日本文昌鱼BjLGP2蛋白分布在细胞质中，具有人LGP2的典型结构域，可以对poly(I∶C)产生免疫应答反应，并且重组BjLGP2可以与poly(I∶C)结合; 将BjLGP2在牙鲆鳃(Flounder gill，FG)细胞中瞬转表达后，可以上调FG细胞中IFN、Mx以及RLR信号转导相关基因MAVS、NF-κB和IRF3的表达[15]。另外，BjLGP2能够抑制dsDNA病毒淋巴囊肿病病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)在FG细胞中的复制，并能抑制石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)在石斑鱼脾脏(Grouper spleen，GS)细胞中的转录。同时，MAVS样蛋白的下游元件，包括TANK结合激酶1基因(TBK1)、IKKi、IRF3和IRF7的同源基因都被发现存在于文昌鱼中[15]。因此，文昌鱼LGP2极有可能通过类似于脊椎动物的RLR信号通路发挥抗病毒作用。这是首次在无脊椎动物(文昌鱼)中发现的LGP2蛋白，其与脊椎动物的LGP2蛋白不仅在结构上保守，并且具有相似的抗病毒作用。这为深入理解生物进化过程中抗病毒免疫反应的演变提供了关键线索。
1.3 文昌鱼dsRNA传感器DDX23DEAD/H-box蛋白是DExH/D-box解旋酶中最大的蛋白家族，参与RNA转录、mRNA前体的选择性剪接和RNA易位等[24]。DEAD-box解旋酶23(DEAD-box helicase 23, DDX23)又称为Prp28p，最初从酿酒酵母中分离出来[25]。近年来关于其抗病毒功能的研究越来越多，如过表达DDX23可减少被感染细胞中口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)的复制，敲低DDX23可显著降低受水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)感染的细胞中IFN刺激基因的表达[26]。DDX23也被确定为一种能够感知dsRNA的新型PRR。当受到VSV的刺激时，人的DDX23能够与TRIF或MAVS结合，激活IFN诱导的抗病毒免疫反应[13]。
文昌鱼拥有一个庞大的解旋酶家族[6, 27]。有研究[13]基于文昌鱼肠道细胞的蛋白质组学分析发现了作为dsRNA传感器的解旋酶家族的DHX9、DHX15和DDX23。白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)中鉴定出的BbeDHX9、BbeDHX15和BbeDDX23均与人同源蛋白有着高度的序列和结构域保守性。进一步研究发现，人与文昌鱼的DHX15和DDX23都会优先识别低分子量的poly(I∶C)[13]，这表明DDX23是一种进化上保守的dsRNA传感器。
2 文昌鱼可能的抗病毒天然免疫信号途径脊椎动物有多种抗病毒免疫通路，但在文昌鱼中相关的研究却并不深入，至今为止，仍没有研究明确文昌鱼的抗病毒免疫信号通路。仅在对白氏文昌鱼的poly(I∶C)刺激后的转录组测序分析中发现，其差异基因(Differentially expressed genes, DEGs)通过KEGG在线工具(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集到NF-κB通路和MAPK通路[28]，因此本研究怀疑其在文昌鱼抗病毒免疫中发挥着一定的作用。基于此，本研究结合现有的文昌鱼免疫通路研究成果，如NF-κB通路、MAPK通路以及经典的JAK-STAT通路，去扩展文昌鱼可能的抗病毒免疫信号通路，以期为文昌鱼抗病毒免疫通路的研究提供参考依据。
2.1 文昌鱼NF-κB信号通路哺乳动物NF-κB转录因子家族包括5个成员：NF-κB1 (p105/p50)、NF-κB2 (p100/p52)、p65 (RELA)、RELB (V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B)和c-REL。它们N端都含有保守的Rel同源结构域(Rel homology domain，RHD)，通过该结构域可形成同源或异源二聚体，并与抑制性蛋白ⅠκB结合，以非活性形式存在细胞质中，其中p65/p50是最常见的二聚化形式。当受到刺激诱导时，ⅠκB蛋白降解过程是通过ⅠκB激酶(Inhibitor of kappa B kinase，IKK)复合物的磷酸化开始的，该复合物由两种催化活性激酶IKKα和IKKβ以及调节亚基IKKγ/NEMO组成。磷酸化的ⅠκB蛋白被靶向泛素化，并经蛋白酶体降解，释放NF-κB二聚体，进而作为转录因子激活靶基因的转录[29]。
文昌鱼中已发现并鉴定了RELB的直系同源物AmphiREL[30]，以及bbtRel、bbtp105和bbtⅠκB[31]。系统发育分析表明，bbtp105和bbtRel分别是脊椎动物NF-κB Ⅰ类和Ⅱ类亚群的祖先，bbtRel与哺乳动物κB反应元件相互作用，在激活时进入细胞核。与其他NF-κBⅠ类成员类似，bbtp105可以被分解为成熟形式p58。另外，bbtⅠκB和未加工的bbtp105可以抑制bbtRel的转录活性，而bbtp58与bbtRel形成同二聚体或异二聚体，进而形成成熟的NF-κB复合物。当用NF-κB的特异性抑制剂Helanalin处理文昌鱼后，文昌鱼受到细菌免疫攻击，其存活率、bbtⅠκB和TNF-α样基因的表达都会降低[31]，这一现象表明NF-κB信号通路在脊索动物先天免疫应答中发挥核心调控作用，其功能保守性可追溯至脊椎动物与无脊椎动物分化前的共同祖先。脊椎动物中复杂的NF-κB信号系统可能起源于文昌鱼中的NF-kB-IkB相关分子，这些基因在脊椎动物的进化过程中逐渐扩展和分化[31]。
泛素化调节NF-κB的活化是一种经典策略。在哺乳动物中，A20(又称TNFAIP3)可与泛素化的蛋白质底物结合，并通过多种生化机制抑制TNF受体1(TNFR1)、CD40、TLR、NOD样受体和IL-1受体下游的NF-κB信号传导[32]。此外，还存在NF-κB的A20结合抑制剂(A20-binding inhibitor of NF-κB, ABIN)的基因家族，该家族由ABIN-1、ABIN-2和ABIN-3三个成员组成[33]。这三个成员均有一个保守的泛素结合结构域(Ubiquitin binding domain，UBD)，是NF-κB信号传导的负调控因子[34]。文昌鱼中也存在bbtABIN-1、bbtABIN2和bbtA20，它们都含有几个保守的κB结合位点，其中bbtABIN2可能与bbtTRAF6竞争结合K63连接的泛素链，而bbtABIN-1可将bbtA20连接到bbt NF-κB必需调节剂(bbtNEMO)上，从而触发bbtNEMO发生K48连接型泛素化修饰，最终导致bbtNEMO降解。与人类A20类似，bbtA20是一种双酶，可以去除K63连接的多泛素链，并在受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1b(bbtRIP1b)上构建K48连接的多聚泛素链，从而起到调控NF-κB信号通路的作用[35]。
还有一些小泛素样修饰剂(Small ubiquitin-like modifier, SUMO)在文昌鱼NF-κB的调控中也发挥着重要的作用。文昌鱼中保留有完整但简化的SUMOlation基因系统，包括两种SUMO蛋白(一种SUMO1谱系，一种SUMO2/3谱系)、一种SUMO E1激活酶SAE1/SAE2复合体、一种E2结合酶UBC9、一种E3连接酶PIAS和几种SUMO特异性蛋白酶(SUMO-specific proteases，SENPs)[36]。而在人类中，有4种SUMO蛋白(SUMO1—4)以及4种PIAS，它们深度参与了许多生物过程的调节，包括DNA损伤修复、蛋白质靶向和降解以及信号转导等。比如，人SUMO2可以抑制NF-κB Rel，SUMO1则通过修饰RelA来促进NF-κB信号通路的激活[36]; PIAS1阻断RelA的DNA结合活性，而PIAS3与RelA相互作用，通过促进NF-κB的SUMO化修饰来抑制NF-κB的活性[37-39]。文昌鱼中的SUMO1和SUMO2均能与NF-κB Rel结合，并以剂量依赖的方式抑制NF-κB信号通路; PIAS不仅可以通过促进Rel-SUMOylation来有效阻断Rel蛋白的活性[36]，还可以通过结合NF-κB Rel的C末端来阻断DNA结合活性，同时通过与上游信号TICAM样适配器和MyD88结合来抑制NF-κB通路的激活[40]。另外，文昌鱼的PIAS、SUMO1和UBC9(SUMO E2连接酶)均能抑制TRAF6的泛素化，从而抑制NF-κB被活化[41]。由此可见，文昌鱼中的SUMOlation基因系统在结构和作用方式上都与脊椎动物相似。综上所述，文昌鱼NF-κB信号传导及其调控的分子机制具有保守性，因此很有必要对NF-κB信号通路在文昌鱼抗病毒免疫中发挥的作用进行探索。
2.2 文昌鱼中MAPK信号通路丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)作为细胞内激酶，能对细胞外刺激作出反应，进而调节多种基本的细胞过程，如炎症、细胞生长、迁移、存活和细胞分化等。在哺乳动物细胞中，MAPK分为三个主要的亚家族，分别是细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinases，ERKs)、c-JUN氨基末端激酶(c-JUN amino-terminal kinases，c-JNKs)和p38 MAP激酶。MAPK信号通路呈现典型的三级信号传递过程：首先MAP3K作为关键激活剂激活MAP2K;然后MAP2K激活MAPKs; 最后MAPKs促进某些下游信号分子的表达，以执行各种生物学功能[42]。MAPK信号通路在抗病毒免疫中扮演着复杂且多面的角色，其作用机制在不同物种和病毒类型中存在显著差异[43-44]，比如：感染非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)会上调宿主MAPK通路，而脱氧胆酸(Deoxycholic acid, DCA)通过下调MAPK信号通路来抑制非洲猪瘟病毒复制[45]; 在斑马鱼中，BMP4通过丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路增强抗病毒先天免疫[46]。
目前，在文昌鱼MAPKs中，p38以及MAP3K家族中的ERK2和TAK1已被鉴定，并发现它们与文昌鱼免疫反应密切相关[47-49]。p38 MAPK激活可诱导各种促炎细胞因子的表达，如白细胞介素1(Interleukin 1，IL-1)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)，并启动先天免疫反应[42]。ERK2可被多种刺激和环境应激激活，进而参与调控细胞死亡、免疫反应以及其他多种生理过程[42, 50]。文昌鱼中的P38、ERK2和转化生长因子激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)的序列及结构均与脊椎动物高度保守，系统进化分析也表明它们都是脊椎动物的祖先基因，且均可以对LPS产生免疫应答[47-48]，但对于文昌鱼MAPK信号通路在抗病毒天然免疫机制的探究仍需进一步完善。TAK1是MAP3K家族的重要成员，最初在TGF-β信号通路中被发现[42]。TAK1作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种重要的信号分子，参与各种生理过程，包括先天性和适应性免疫反应[51]。TAK1作为NF-κB和MAPK信号传导的关键激活剂，可以磷酸化下游的ⅠκB激酶(IKK)复合物、ERK、JNK和p38 MAPK，从而激活NF-κB和MAPK信号通路，参与免疫反应[50]。文昌鱼中的AmphiTAK1含有脊索动物中保守的STKc_TAK1结构域、TAB1和TAB2/3结合结构域，能够对LPS产生免疫应答，并且可以与AmphiTAB1相互作用[49]。由此可见，文昌鱼中似乎也存在MAPK信号通路，且在进化中占据着祖先地位。哺乳动物MAPK信号通路在抗病毒免疫中具有复杂且重要的功能，而文昌鱼的MAPK信号通路中的免疫分子结构类似于哺乳动物，且与NF-κB信号通路相关联; poly(I∶C)刺激后的文昌鱼转录组测序富集到了MAPK和NF-κB信号通路。鉴于此，文昌鱼MAPK通路是否在抗病毒免疫反应中发挥着一定的作用是一个值得探索的方向。
2.3 文昌鱼JAK-STAT信号通路Janus激酶-信号转导子和转录激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)通路在多种生物过程中起着重要作用，包括免疫反应、细胞增殖、分化、迁移、凋亡和细胞存活。JAK-STAT信号通路最初是在IFN的研究[52]中被发现的，是抗病毒免疫常见的信号通路，目前其生物化学机制已得到广泛研究。该信号通路的传导始于细胞因子或生长因子与其相应跨膜受体的细胞外结合，随后同受体结合的JAKs在空间上接近，并通过促使构象变化将其激酶结构域与抑制性结构域隔开，从而促进受体结合的JAKs的激活。然后活化的JAKs磷酸化潜在的STAT单体，导致STAT二聚化和核转位，并与DNA结合，进而调控效应蛋白的基因表达[53]。
在文昌鱼中，虽然没有关于JAK的研究，但对STAT进行了鉴定和分析。在哺乳动物中，STAT家族有7个成员，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。大多数STAT蛋白具有相似的功能结构域，包括N端结构域、卷曲螺旋结构域、DNA结合结构域和SH2结构域。N-末端结构域负责二聚体-二聚体之间的相互作用; 螺旋结构域是蛋白质相互作用不可或缺的，这是STAT家族成员所特有的; SH2结构域是最保守的基序，它能促进受体亚基的特异性对接，并通过SH2磷酸酪氨酸相互作用形成活性STAT二聚体[54]。
在文昌鱼中，STAT成员AmphiSTATa和AmphiSTATb已被鉴定。结构分析发现，它们都具有与STAT5相同特征的螺旋结构域; 通过分析进化树发现，AmphiSTATb同STAT5、6聚类，这暗示STAT家族中的STAT5可能是更古老的成员。另外AmphiSTATa和AmphiSTATb都可以对LPS产生免疫应答，在HEK293细胞中分布于细胞质和细胞核中，且两者可以相互作用形成同源二聚体或异源二聚体[55]。由此可以看出，AmphiSTATs与脊椎动物中的STATs发挥着相似的功能，都可能作为转录因子在抗菌免疫中发挥作用(见图 2)。因此，JAK-STAT信号通路在文昌鱼抗病毒免疫方面是否发挥功能同样值得深究。
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( “？”表示本研究推测的尚未验证过的步骤或参与该步骤的分子。"?" indicates the unproven step in the study′s hypothesis or the molecules involved in that step. ) 图 2 文昌鱼中JAK-STAT信号途径介导的抗病毒天然免疫假设图 Fig. 2 Antiviral innate immunity mediated by the JAK-STAT signaling pathway in amphioxus |
黏病毒抗性蛋白(Myxovirus resistance protein，Mx)广泛存在于几乎所有的脊椎动物中，通常由Ⅰ型和Ⅲ型IFN诱导产生，主要对RNA病毒具有活性。Mx蛋白是包含动力蛋白在内的大型超家族GTPase蛋白成员，其主要结构特征包括N端的三联体GTP结合结构域、类似动力蛋白家族的结构特征序列和C端的亮氨酸拉链基序[56]。在人、小鼠、牛和比目鱼等物种中，通常可以观察到2个Mx成员的存在。然而，在鸡、蛙和河豚中，仅鉴定出了1个Mx基因。更引人关注的是，在虹鳟中发现了3个Mx成员，而在斑马鱼中，竟然存在7个Mx基因以及一个Mx假基因[57-58]，文昌鱼中则发现了2个Mx基因。文昌鱼中的Mx基因在鳃、皮肤、肝盲囊和肠道中都高度表达，且在poly(I∶C)的刺激下显著上调[59]。由此可见，文昌鱼中的Mx蛋白可以对poly(I∶C)的刺激产生免疫应答，暗示其可能参与抗病毒免疫反应，但这一推测还需要进一步的验证。
3.2 文昌鱼抗病毒蛋白Viperin蝰蛇毒素(Viperin)是自由基S-腺苷甲硫氨酸(Radical S-adenosyl-L-methionine，SAM)超家族酶的成员，是由干扰素刺激基因(Interferon-stimulated gene, ISG)编码产生的一种能限制广谱病毒复制的产物。它抑制了一系列病毒的复制，包括双链DNA病毒、正义和反义单链RNA病毒以及人类和其他物种中的逆转录病毒。文献[60]指出，Viperin的自由基SAM活性是抑制翻译所必需的，Viperin触发核糖体碰撞(Ribosome collision)并激活MAPK ZAK通路，进而激活整合应激反应通路的GCN2(General control nonderepressible 2)臂，最终抑制细胞和病毒RNA的翻译。有研究[61]通过对日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)中的viperin基因(Bjvip)进行克隆发现：Bjvip与大多数哺乳动物的序列高度相似，N端序列表现出多样性，而中间和C端序列较保守; Bjvip主要在文昌鱼的肝盲囊、肌肉、鳃和后肠中高表达，且poly(I∶C)刺激可诱导其表达。且为验证文昌鱼BjVip是否与脊椎动物的蝰蛇病毒一样具有抗病毒免疫功能，该研究通过细胞转染实验在FG细胞中过表达BjVip蛋白，从而发现BjVip可以抑制细胞内LCDV病毒的复制。该研究还发现，将BjVip重组蛋白与WSSV病毒孵育后注射入南美白对虾体内，显著降低了其肌肉和肝胰腺组织的WSSV病毒载量，这表明BjVip蛋白在南美白对虾体内也具有抗WSSV病毒的作用。这些研究结果暗示文昌鱼的Viperin抗病毒免疫功能具有保守性。
4 文昌鱼抗病毒天然免疫的其他可能机制 4.1 文昌鱼中环状RNA(circRNA)与抗病毒免疫circRNA属于内源性非编码RNA，是一类缺乏5’帽结构和3’poly(A)尾部的非编码RNA，在真核生物中通过共价键形成闭环结构。与线性RNA相比，circRNA不易被核糖核酸酶降解，半衰期更长。circRNA被认为是有效的miRNA海绵，它能够通过竞争的方式，让那些原本被miRNAs抑制的靶mRNA得以释放并重新表达。另外，circRNA还直接参与选择性剪接和基因表达的调控[62]，并参与调节冠状病毒、人类疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒和巨细胞病毒等许多病毒的复制[63]。circRNA包括外显子circRNA、内含子circRNA以及外显子-内含子circRNA三种类型。
在白氏文昌鱼中已鉴定出1 859个circRNAs[64]。与斑马鱼相比，文昌鱼中鉴定出的circRNAs数量相对较少，而三种类型的circRNA相对丰度的改变是其进化的关键特征。对文昌鱼circRNAs上的miRNA靶位点分析表明，332个circRNAs可能发挥miRNA海绵的作用。例如，很多circRNA可同bbe-miR-129b-5p和bbe-miR-2066-3p结合[64]，而这2种miRNA都可对poly(I∶C)刺激产生免疫反应[65]。结合文昌鱼关键抗病毒免疫途径，通过生信分析，目前已鉴定出12个可能参与这些途径的circRNAs。进一步通过qRT-PCR实验分析了poly(I∶C)刺激后候选circRNA的表达动态，结果显示：在检测的12个circRNA中，circBbt-102和circBbt-209呈现显著上调，circBbt-356和circBbt-478显著下调，而其余8个circRNA的表达未表现出显著波动[64]。这一差异表达模式提示，这4个响应poly(I∶C)的circRNA可能参与文昌鱼的抗病毒免疫调控网络，但是文昌鱼circRNA在抗病毒免疫反应的具体调控机制还需要进一步的探究。
4.2 文昌鱼白细胞介素IL与抗病毒免疫白细胞介素(Interleukin，IL)是细胞因子的一大类群，在脊椎动物中拥有庞大的家族成员，并且其功能多样，在调节免疫反应、炎症和造血方面起着至关重要的作用[66]。在文昌鱼中仅发现了IL-17[67]，这使本研究团队关注到其在脊索动物IL种类及功能演化中的重要性。IL-17在脊椎动物免疫中主要起协调作用[68]，在病毒感染的细胞中，它具有保护和致病双重作用，已被认为是一种具有潜在治疗价值的分子，可用于治疗多种感染性疾病、自身免疫性疾病和癌症[69]。
文昌鱼IL-17与脊椎动物IL-17在基因结构和氨基酸序列上存在一定的相似性，这表明IL-17在生物进化过程中可能具有重要的生物学意义，其功能在不同物种中得到了一定程度的保留和演化。尽管存在相似性，但文昌鱼IL-17可能在文昌鱼的特定生理过程和免疫防御机制中发挥独特的作用，推测其可能在文昌鱼抗病毒免疫中起重要作用，但这一切都需要进一步的实验验证。目前已在文昌鱼的多种组织和多种类型细胞中检测到IL-17的表达，如鳃、肠和脊索等，这提示其可能在多个生理过程中发挥作用。在poly(I∶C)刺激后的文昌鱼鳃部组织的转录组测序中，IL-17表达显著上调[28]，说明其对poly(I∶C)的刺激可以产生免疫应答。但目前尚未开展进一步的功能和机制研究。探索文昌鱼IL-17在抗病毒免疫中的功能机制不仅有助于理解脊索动物IL结构种类及功能的演化，还可以为解决IL-17在不同病毒感染中的致病和保护作用提供参考依据。
4.3 文昌鱼中是否存在抗病毒天然免疫的明星分子IFNIFN是在病毒感染或其他IFN诱导剂刺激下由细胞产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能的细胞因子。关于文昌鱼中是否存在类似脊椎动物的IFN一直是科研领域的研究热点。虽然目前尚未有确凿证据表明文昌鱼具有典型的IFN分子，但在其抗病毒免疫过程中发现了一些具有IFN样功能的分子、IFN调控分子、IFN信号通路以及IFN介导产生的效应蛋白。比如：在文昌鱼中发现了与IFN同为细胞因子家族的部分成员(TNF[70]、IL-17和巨噬细胞MIF[71]的同源物等)，但它们在文昌鱼中的具体功能研究尚不完善; 此外，还发现了IFN调节因子(IFN regulatory factor, IRF)。文昌鱼中有9个IRF成员，且实验验证了文昌鱼中IRFs的功能机制与脊椎动物相似。它们可以结合IFN刺激的反应元件(Interferon-stimulated response element，ISRE)，对poly(I∶C)刺激产生免疫应答; 可以被bbtTBK1磷酸化，然后转移到细胞核中进行靶基因转录; 部分IRFs还可以作为转录抑制因子，发挥竞争抑制作用。另外，bbtIRF2、bbtIRF8和bbtRel分别被鉴定为bbtIRF1、bbtIRF7和bbtIRF3的靶基因，这表明文昌鱼的IRF和NF-kB之间存在动态反馈调节[72]。除此之外，文昌鱼中还发现了参与JAK-STAT信号通路的部分成员[54]以及IFN诱导的抗病毒蛋白Mx[58]和Viperin[60]等。这暗示着文昌鱼可能存在一种独特的、尚未完全明确的IFN相关抗病毒机制(见图 2)，有待进一步深入研究。
5 总结和展望文昌鱼凭借其独特的生物特性，在生物进化起源的探索历程中占据着至关重要的地位。与脊椎动物基因组进行对比发现，文昌鱼基因组中存在一些处于冗余状态或趋于简化的免疫基因，这些基因无一不在暗示，文昌鱼对于剖析脊椎动物免疫基因结构及其功能的演化源头具有不可忽视的关键价值。然而，目前针对文昌鱼的研究手段存在一定的局限性，大量抗病毒免疫的分子作用细节并未得到深入挖掘。当前研究大多仅停留在对免疫分子的初步筛选与鉴定阶段，缺乏体内实验的深入研究。并且本文提出的信号通路参与抗病毒的假设是基于系统发育与表达模式关联性得出的，并非直接功能验证结果，未来还需借助文昌鱼病毒侵染模型或基因敲降实验等手段对该假设进一步验证。此外，在病毒感染模型方面，文昌鱼抗病毒免疫研究目前仅依赖poly (I∶C)这一模型。综合以上因素，目前针对文昌鱼抗病毒免疫的内在机制，相关研究仍知之甚少。
不过，值得庆幸的是，现阶段在文昌鱼体内已经成功发现了诸多与脊椎动物天然免疫紧密相关的信号通路，甚至还捕捉到了适应性免疫相关信号的蛛丝马迹。这些已获取的信息，正助力逐步明晰脊索动物天然免疫的起源脉络及其与适应性免疫之间的内在联系。因而，理应给予文昌鱼抗病毒天然免疫研究更多的关注，积极拓展适用于文昌鱼的研究手段。如培养文昌鱼原代细胞以实现体外功能探究实验，将基因编辑技术应用到文昌鱼中，全力探寻文昌鱼易感的各类病毒模型，从而更加深入、细致地钻研文昌鱼抗病毒免疫的分子机制。
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