2026, Vol. 56
2. 海南省海洋与渔业科学院 海南省热带海水养殖技术重点实验室, 海南 海口 571126
绿尾唇鱼(Cheilinus chlorourus)隶属于鲈形目(Perciformes)隆头鱼科(Labridae)唇鱼属(Cheilinus)[1-2]，广泛分布于印度洋-太平洋暖水域，栖息于礁砂混合的珊瑚礁海域中。绿尾唇鱼肉质细腻绵软，味道鲜美，深受民众喜爱。
胃腺是重要的消化器官。在有胃鱼类中，胃位于食道后方，通过远端的括约肌(即瓣膜)与肠道分离，调节食物向肠道的运输[3]。在消化过程中，胃暂时储存食物并分泌胃酸和胃蛋白酶。胃蛋白酶隶属于天冬氨酸蛋白酶家族，胃主细胞分泌的胃蛋白酶原经过胃液中的盐酸等因子激活后具有水解蛋白活性，在脊椎动物胃消化过程中起作用[4]。与胃蛋白酶类似，β位点淀粉样前体蛋白裂解酶2(Beta-secretase 2，BACE2)是一种跨膜天冬氨酸蛋白酶，以非活性酶原形式分泌，在酸性条件下催化激活[5]。BACE2与胃蛋白酶同属天冬氨酸蛋白酶家族的A1家族[6]，在人胰岛β细胞中表达水平较高，参与人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的水解加工[7]。因此，推测BACE2可能在绿尾唇鱼中参与蛋白质水解，在消化过程中起着重要作用。
本文主要研究无胃且不编码胃蛋白酶原基因的绿尾唇鱼。绿尾唇鱼是一种肉食性鱼类，食道直接与肠道相连，胃腺已经退化，没有幽门盲囊，属于典型的无胃鱼[8]。与典型的植食性无胃鱼类不同，绿尾唇鱼是一种肉食性鱼类，其消化道相对较短。由于其特殊的消化系统结构，绿尾唇鱼在消化蛋白质方面可能具有独特的机制。目前，国内外对绿尾唇鱼的研究集中在生物学特征和进化地位等方面[9-10]，其消化生理学研究相对空白。因此，针对其蛋白质消化相关的酶类，不仅有助于理解其消化生理，还对未来饲料开发和优化具有重要的实际应用意义。
1 材料与方法 1.1 实验用鱼和实验样品的采集实验用鱼购自海南省海洋与渔业科学院，选择发育良好、规格相似的5尾成年雌性绿尾唇鱼(体长(19.24±0.85) cm，体质量(295.56±62.62) g)，在暂养池中暂养2 d，暂养池内径长4.5 m，内径宽3 m，水深1 m，水温维持在(28±1) ℃，每天进行换水和投喂石斑鱼配合饲料。取样前一天停止投喂，使用甲烷磺酸三卡因(MS-222)麻醉，解剖采集肠、脾、脑、肾脏、性腺、肝、肌肉组织，使用4%多聚甲醛固定切片样品，RNA样品放入液氮快速冷冻后放入-80 ℃冰箱保存备用，各组织均为5个生物学重复(n=5)。
1.2 绿尾唇鱼bace2基因的克隆使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)从绿尾唇鱼肠组织中提取总RNA，使用BD-1000核酸分析仪(五洲东方，北京)检测RNA浓度和质量，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，使用PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)试剂盒将所得RNA反转录为cDNA用于实时定量PCR，使用SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit(with gDNA Eraser)试剂盒(思科捷，山东)将RNA反转录为cDNA用于基因克隆，并于-20 ℃中保存。
NCBI数据库中未收录绿尾唇鱼基因组数据，因此通过亲缘关系较近的波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)基因组数据(ASM1832078v1)得到bace2基因序列，使用Primer 5软件设计bace2上下游基因特异性引物(F: CGGTGCTGGCGTCTTTA; R: GGTTCTGCACGCTGT-CG)。以绿尾唇鱼肠组织cDNA为模板，使用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)高保真酶(诺唯赞，中国)进行PCR扩增。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，使用TIANgel Midi Purification Kit(天根，中国)试剂盒进行琼脂糖凝胶回收，送至生工生物公司测序。PCR反应体系：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，ddH2O 17μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 4 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃下变性15 s，56 ℃下退火15 s，72 ℃下延伸2 min，共35个循环。
使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit试剂盒(诺维赞，南京)将PCR纯化产物连接至实验室改造的pcDNA3.1线性载体(以pcDNA3.1为骨架，将其改造为pcDNA3.1-C端-绿色荧光蛋白mNG(NCBI号：AGG56535.1)标签载体)，转入感受态细胞DH5α中过夜培养。使用2×Taq PCR MasterMix Ⅱ(天根，中国)试剂盒进行菌液PCR。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，菌液1 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环。挑选阳性克隆送至生工生物公司测序。
1.3 绿尾唇鱼bace2基因的序列分析从NCBI数据库中下载不同物种的bace2基因序列和氨基酸序列，使用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测bace2所编码的氨基酸序列；使用DNAman 9对氨基酸序列进行对比分析；使用MEGA 11.0构建系统进化树。使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在线预测其理化性质；使用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)预测其亲(疏)水性；使用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)预测其信号肽序列；使用TMHMM 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测其跨膜结构域；使用NetPhos 3.1(https://servi-ces.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)预测其磷酸化位点；使用NetNGlyc 1.0()预测其N-糖基化位点；使用YinOYang 1.2(https://services.healthtech.dtu.dk/services/YinOYang-1.2/)预测其O-糖基化位点；使用PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)预测其亚细胞定位；使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html)预测其二级结构；使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)预测其三级构型。
1.4 绿尾唇鱼bace2基因的组织分布使用Primer 5软件设计bace2基因上下游特异性引物(F: TGCAGTGAACGGGGAAATCA; R: AGG-GCGTAGGATATCACCCA)，以β-actin(F: GATGTCACGCACGATTTCC; R: TGCTGTCCCTGTATG-CCTCT)作为内参基因，以反转录合成的cDNA为模板，进行qPCR分析。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(诺唯赞，中国)对绿尾唇鱼全组织进行相对表达量的检测。qPCR通过SteponeTM Real-Time PCR仪(ABI)进行，每个反应设置三次技术重复。qPCR反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，ddH2O 2.6 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 2 μL。qPCR反应程序为：预变性95 ℃，30 s；变性95 ℃，10 s；退火60 ℃，30 s，进行40个循环。采用2-ΔΔCt法对试验数据进行分析。
1.5 bace2 mRNA的原位杂交定位使用DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)(Roche，瑞士)根据bace2基因序列合成地高辛(DIG)标记的正反义RNA探针，并在上游引物5’端添加保护碱基和SP6聚合酶启动子(ATTTAGGTGACACTATAGAAGCG)，在下游引物5’端添加保护碱基和T7聚合酶启动子(TAATACGACTCACTATAGGGAGACA)，合成的探针长度约500 bp。原位杂交探针引物见表 1。
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表 1 原位杂交探针引物 Table 1 primers for in situ hybridization |
取绿尾唇鱼肠组织，使用4%的多聚甲醛固定后进行石蜡包埋并切片，将切片固定至载玻片，37 ℃干燥。使用二甲苯浸泡载玻片两次，每次10 min；使用100%、95%、85%、70%的梯度浓度乙醇溶液依次浸泡3 min；在摇床上使用1×PBS冲洗5 min；使用0.1 mol/L HCl冲洗8 min，灭活内源碱性磷酸酶，使用1×PBS摇床冲洗5 min；使用蛋白酶K(10 μg/mL)在37 ℃烘箱中处理5 min；使用1×PBS洗涤5 min去除蛋白酶K；使用含有0.25%醋酸酐的三乙醇胺(TEA)溶液摇床处理10 min，使用2×SSC洗涤10 min。
载玻片上滴加200 μL杂交缓冲液，55 ℃预杂交1 h；将含有RNA探针的杂交缓冲液置于95 ℃中变性5 min后置于冰中冷却，滴加在载玻片覆盖组织，55 ℃杂交过夜。第二天使用5×、2×、1×和0.2×的梯度浓度SSC和MABT缓冲液依次洗涤载玻片；使用封闭缓冲液(Roche，瑞士)进行封闭处理；使用碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体(Roche Diagnostics)检测地高辛，使用NBT/BCIP储备液(Roche，瑞士)在黑暗条件下进行显色，完成后在荧光显微镜(Echo Revolve，美国)下观察记录。
1.6 BACE2蛋白的亚细胞定位将1.2步骤中测序正确的菌液扩培，使用无内毒素质粒小提试剂盒(TIANGEN，北京)提取目标质粒，该质粒用于细胞转染。使用10%胎牛血清(爱必信，上海)、1% 青霉素-链霉素双抗母液(100×)(金克隆，北京)、89% DMEM培养基(白鲨，安徽)配制完全培养基。取液氮保存的HEK 293T细胞系，于37 ℃水浴解冻，120g离心4 min，弃去上清，重悬，接种于培养瓶，37 ℃ 5% CO2培养细胞。待细胞完全铺满培养瓶后进行传代，培养至第三代且生长状态良好时用于转染。将细胞消化、离心，用完全培养基重悬后接种至35 mm玻底共聚焦培养皿(白鲨，安徽)中。待细胞密度为60%~70%时，使用转染试剂Lipo8000TM(碧云天，上海)转染HEK 293T细胞，48 h后观察拍照[11-14]。
1.7 数据处理分析所有数据均以平均值±标准误差(Mean±S.E.M.)表示。数据分析采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，然后进行Duncan多重比较，P＜0.05表示差异具有统计学显著性，使用GraphPad Prism 9.0软件绘图。
2 结果与分析 2.1 绿尾唇鱼bace2基因序列特征及系统进化树绿尾唇鱼bace2开放阅读框(Open reading frame, ORF)长度为1 530 bp，编码509个氨基酸(见图 1)。氨基酸序列多重比对显示，绿尾唇鱼BACE2氨基酸序列与波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)、鳜(Siniperca chuatsi)和欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)同源性较高，一致性分别为93.21%、83.58%和83.02%，绿尾唇鱼BACE2与其他硬骨鱼的同源性高于哺乳类和两栖类(见图 2)。
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( 橙色方框内的字母表示预测的信号肽序列，蓝色方框内的字母表示预测的跨膜序列，紫色方框内的字母表示预测的6个O-糖基化位点，绿色方框内的字母表示3个N-糖基化位点。The letters in the orange box indicates the predicted signal peptide, the letters in the blue box indicates the predicted transmembrane sequence, the letter in the purple box indicates the predicted O-glycosylation sites, and the letter in the green box indicates the predicted N-glycosylation sites. ) 图 1 绿尾唇鱼bace2基因核苷酸序列及所编码氨基酸序列 Fig. 1 The nucleotide and amino acid sequence of bace2 gene in Cheilinus chlorurus |
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( Homo sapiens：智人，NP_036237；Mus musculus：小鼠，NP_062390.3；Xenopus tropicalis：非洲爪蟾，NP_001135590.1；Danio rerio：斑马鱼，XP_056329513.1；Lates calcarifer：尖吻鲈，XP_018517620.1；Cheilinus undulatus：波纹唇鱼，XP_041668876.1；Siniperca chuatsi：鳜，XP_044058743.1。黑色背景表示相似性为100%，粉色背景表示相似性>75%，蓝色背景表示相似性>50%。Homo sapiens: Human, NP_036237; Mus musculus: Mouse, NP_062390.3; Xenopus tropicalis: African clawed frog, NP_001135590.1; Danio rerio: Zebrafish, XP_056329513.1; Lates calcarifer: Silver sea perch, XP_018517620.1; Cheilinus undulatus: Giant wrasse, XP_041668876.1; Siniperca chuatsi: Aucha perch, XP_044058743.1. The black background indicates that the consistency is 100%, the pink background indicates that the consistency is greater thanor equal to 75%, the blue background indicates that the consistency is greater than or equal to 50%. ) 图 2 绿尾唇鱼与其他物种的BACE2蛋白氨基酸序列比较 Fig. 2 Comparison of deduced amino acid sequences of BACE2 protein in Cheilinus chlorurus with other species |
为了进一步分析BACE2的进化关系，本研究构建了系统进化树。该进化树主要分为两支，哺乳类和两栖类占一支，鱼类一支，而鱼类的BACE2又分为两支。绿尾唇鱼BACE2与鳜、尖吻鲈(Lates calcarifer)、大黄鱼(Larimichthys crocea)等聚为一支，具有较高的同源性，这一聚类结果符合绿尾唇鱼的分类学地位(见图 3)。
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( 横向枝干长度表示两个物种在进化上的累积遗传差异；节点数为自展值，表示进化树分支的可信度；各物种的氨基酸序列来源位于图片物种的括号中。The horizontal branch length represents the accumulated genetic differences between species during evolution; the number at each node indicates the bootstrap value, reflecting the confidence level of the evolutionary tree branches; the amino acid sequences of each species are indicated in parentheses following the species names in the figure. ) 图 3 基于17种脊椎动物BACE2氨基酸序列的Neighbor-Joining进化树 Fig. 3 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on 17 BACE2 protein sequences of vertebrates |
绿尾唇鱼BACE2蛋白化学式为C2488H3886N642O738S21，分子质量为55.27 kDa，等电点为5.10；脂肪系数为99.37。该蛋白在哺乳动物体外网织红细胞的半衰期为30 h。绿尾唇鱼bace2基因编码509个氨基酸，其中带负电荷氨基酸残基44个，带正电荷氨基酸残基33个；氨基酸的组成中亮氨酸(Leu)含量最高，占比为11.4%(见表 2)，不稳定系数为35.22，表明该蛋白性质稳定。
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表 2 绿尾唇鱼BACE2蛋白氨基酸的组成 Table 2 Amino acid composition of BACE2 protein in Cheilinus chlorourus |
ProtScale在线工具预测显示，绿尾唇鱼BACE2蛋白平均亲水指数为0.238，属于亲水性蛋白，在第477位谷氨酸处疏水性最强(3.384)，在第498位组氨酸处亲水性最强(-1.768)(见图 4(A))。TMHMM 2.0 Server在线软件预测显示，绿尾唇鱼BACE2蛋白具有2个跨膜结构(见图 4(B))，这与亲(疏)水性预测一致，BACE2为跨膜蛋白，主要功能区域在膜外。SignalP 5.0在线软件预测结果显示，绿尾唇鱼BACE2多肽前端预测信号肽含有23个氨基酸(见图 1)，信号肽的作用为引导前体蛋白进入内质网。
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( 在图(A)中，分值为正表示疏水区域，分值为负表示亲水区域。In panel (A), a positive score means a hydrophobic region, and a negative score means a hydrophilic region. ) 图 4 绿尾唇鱼BACE2蛋白亲(疏)水性预测(A)和跨膜结构预测(B) Fig. 4 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction(A) and transmembrane domain prediction(B) of BACE2 protein in Cheilinus chlorourus |
NetPhos 3.1在线软件预测结果显示，绿尾唇鱼BACE2蛋白中丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点分别为35、15和6个(见图 5(A))。NetNGlyc 1.0在线软件预测结果显示，绿尾唇鱼BACE2蛋白存在3个潜在的N-糖基化位点，分别位于第37、164、361位氨基酸处(见图 5(B))；YinOYang 1.2在线软件预测结果显示，绿尾唇鱼BACE2蛋白存在6个潜在的O-糖基化位点，分别位于第4、203、204、363、394和444位氨基酸处(见图 5(C))。SOPMA在线软件预测结果显示，绿尾唇鱼BACE2蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占16.70%、27.11%、51.47%和4.72%(见图 5(D))。SWISS-MODEL在线软件预测表明，绿尾唇鱼BACE2蛋白三级结构大部分为无规则卷曲且具有明显的α-螺旋结构(见图 5(E))，三级结构与二级结构预测结果相符。PSORT Ⅱ在线软件预测结果显示，绿尾唇鱼BACE2蛋白主要分布在质膜(47.80%)、内质网(26.10%)和液泡(8.70%)中，线粒体和高尔基等细胞器中也有分布。
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( D: Helix：a-螺旋；Sheet：延伸链；Tum：B-转角；Coil：无规则卷曲。D: Helix: Alpha helix; Sheet: Extended chain; Tum: Beta turn; Coil: Random coil. ) 图 5 绿尾唇鱼BACE2蛋白磷酸化位点(A), N-糖基化(B), O-糖基化位点(C), 二级结构(D)和三级结构(E)预测 Fig. 5 Prediction of phosohorylation site (A), N-glycosylation sites (B), O-glycosylationsites (C), secondary structure prediction (D) and tertiary structure prediction (E) of BACE2 protein in Cheilinus chlorourus |
采用实时荧光定量PCR技术检测了bace2基因在绿尾唇鱼肠道、肾、脾、脑、肌肉、肝及性腺中的相对表达量。结果显示，bace2基因在肠道中的相对表达量最高，在脾脏中的相对表达量最低，肠道的bace2基因相对表达量显著高于其他组织(P < 0.05)，是脾脏的32倍；肝脏的bace2基因相对表达量显著高于肌肉、肾和脾脏(P < 0.05)；性腺的bace2基因相对表达量与肝脏相近；脑的bace2基因相对表达量约为脾脏的15倍，显著高于脾脏和肾(P < 0.05)；肌肉的bace2基因相对表达量约为脾脏的10倍，肾和脾脏的bace2基因相对表达量较低。
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( 标有不同字母者表示组间有显著性差异(P < 0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。The means with different letters are significantly different inthe groups at the 0.05 probability level, and the means with thesame letter are not significant differences. ) 图 6 bace2基因在绿尾唇鱼各组织中的表达分布 Fig. 6 Expression distribution of the bace2 gene in various tissues of Cheilinus chlorourus |
为了确定bace2在肠道中的表达分布，通过原位杂交检测bace2的mRNA在绿尾唇鱼肠组织中的表达分布。结果表明，在反义探针处理的切片(见图 7(A)、7(B)、7(C))中，bace2在小肠绒毛和隐窝区域呈现明显的阳性信号。相较之下，正义探针处理的切片(见图 7(D)、7(E)、7(F))未检测到明显的杂交信号。
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( 图中蓝色为bace2的杂交信号。Blue for hybridization signals of bace2. ) 图 7 bace2在小肠绒毛中的阳性信号(A)、(B)、(C)，bace2在小肠绒毛中的阴性信号(D)、(E)、(F)和小肠绒毛的HE染色(G)、(H)、(I) Fig. 7 Positive signal of bace2 in intestinal villus (A)、(B)、(C) negative signal of bace2 in intestinal villus (D)、(E)、(F) and HE staining of intestinal villus (G)、(H)、(I) |
在HEK 293T细胞系中转入空载质粒(mNG)和表达bace2基因的质粒(BACE2-mNG)，培养48 h后使用共聚焦显微镜拍照。亚细胞定位结果表明，转入mNG质粒的细胞绿色荧光信号主要集中于细胞质中，未观察到与特定细胞器或膜结构共定位；转入BACE2-mNG质粒的绿色荧光信号主要聚集在细胞膜上(见图 8)。与转入mNG的细胞相比，转入BACE2-mNG质粒的绿色荧光信号有显著的定位变化。
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( (DAPI(蓝色)显示细胞核，FITC(绿色)代表BACE2 mRNA信号，合并图像显示DAPI与FITC信号的重叠分布。红色箭头表示BACE2蛋白在细胞膜上定位。DAPI (blue) indicates nuclei, and FITC (green) represents BACE2 mRNA signal, merge image shows the overlap of DAPI and FITC signals. The red arrows indicate the localization of BACE2 protein on the cell membrane. ) 图 8 BACE2蛋白在HEK 293T中的亚细胞定位 Fig. 8 Subcellular localization of the BACE2 protein in HEK 293T cells |
胃是颌口动物的消化器官之一，通过分泌胃酸和胃蛋白酶原行使消化功能。胃酸由胃质子泵分泌，胃质子泵是一种α-β异二聚体结构的H+/K+-ATP酶，分别由ATP4A和ATP4B基因编码α亚基和β亚基[15]。而胃蛋白酶原是胃消化功能的基础，在酸性条件下被激活，通过水解特定的肽键将蛋白质消化成为更小的肽段或氨基酸[16-17]，提高生物体对蛋白质的利用效率，例如胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原F、前胃素和凝乳酶原等[4]。研究表明，胃首次出现在4.5亿年前的有颌类脊椎动物中[3]，但胃在颌口动物中并不普遍存在。根据鱼类是否具有胃结构可以将其分为有胃鱼和无胃鱼，目前已知的无胃鱼有鲤形目、鳉形目、鲀形目和隆头鱼目等。硬骨鱼在进化过程中出现了相互独立的多次胃结构丢失，比较基因组学分析发现胃结构丢失伴随着与胃酸及胃蛋白酶相关的基因丢失或失活[16]。
目前针对BACE2功能的研究较少。在哺乳动物的研究中，BACE1和BACE2同属于天冬氨酸蛋白酶家族成员，氨基酸序列相似性达64%，是密切的同源物[18-20]。BACE2的功能研究主要集中在阿尔茨海默病(AD)[18]和2型糖尿病(T2D)[7]的发病机制。BACE2普遍表达于外周分泌组织中，如胰岛、胃和甲状腺等，其在胰腺β细胞中的相对表达量最高[5]，在β细胞水解加工Tmem27蛋白[21]。此外，BACE2还作为β-分泌酶，通过裂解β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)产生β-淀粉样蛋白(Aβ)发挥作用。
3.1 绿尾唇鱼bace2基因的序列特征及进化分析绿尾唇鱼作为典型的无胃鱼，其胃部结构(包括胃腺)退化，食道直接与肠道相连，BACE2是否在其消化系统中发挥作用尚不明确。本研究采用基因克隆的方法得到了绿尾唇鱼bace2基因的cDNA序列并预测了氨基酸序列，进化树分析表明绿尾唇鱼BACE2与来自鲈形目鱼类BACE2的相似程度较高，多重序列对比进一步揭示绿尾唇鱼BACE2蛋白与近缘物种波纹唇鱼的同源性最高。BACE2具有信号肽序列，是一种跨膜蛋白，第30至第462号氨基酸均在膜外，占据全部氨基酸序列的73%以上，二级结构以无规则卷曲为主。研究表明，BACE2的催化结构域位于膜外，其膜外区域的蛋白酶结构域具有催化活性，负责切割底物[22-23]，去除BACE2的膜外区域会显著削弱其对底物的切割能力，而删除细胞质部分则不影响，这表明膜外区域是BACE2与底物相互作用的基础[4]。因此，推测绿尾唇鱼BACE2蛋白具有天冬氨酸型内肽酶活性，作用于肽键，在细胞外行使消化功能，主要在蛋白水解过程中发挥作用。
3.2 bace2基因的表达特征BACE2是BACE蛋白酶家族的一员，在哺乳动物中具有裂解蛋白质的功能，通过对胰岛素前体或其他特定底物的加工，在代谢、神经功能中发挥重要作用[21, 23]。qPCR结果显示，bace2基因在绿尾唇鱼肠道中的表达量显著高于其他组织。肠是绿尾唇鱼进行食物分解、营养吸收和代谢调控的关键部位，这一表达模式可能与BACE2发挥的作用相关，作为一种蛋白酶，BACE2可能作用于蛋白，促进食物蛋白质的分解。
通过bace2 mRNA原位杂交对绿尾唇鱼肠组织进行检测，结果表明，bace2基因在小肠绒毛和隐窝中大量表达。小肠绒毛表面覆盖柱状上皮细胞，扩大了吸收面积，通过钠-葡萄糖协同转运体等机制主动吸收葡萄糖、氨基酸等营养物质[24]。小肠隐窝中的细胞直接或间接参与消化功能，隐窝底部的分泌细胞可以分泌氯化物和碳酸氢盐，维持肠的酸碱平衡[24]，隐窝底部具有大量干细胞，可以不断分裂并分化为多种功能细胞，其分化产生的腺体细胞可以直接分泌消化酶；杯状细胞可以分泌黏液保护肠壁免受损伤和润滑食物[25]；内分泌细胞可以分泌激素，如胆囊收缩素、促胰液素等，这些激素可以调节胰腺和胆囊的分泌，间接促进食物的消化[26]。原位杂交结果表明，绿尾唇鱼BACE2蛋白可能由小肠绒毛和小肠隐窝细胞合成，在蛋白质的消化过程中发挥重要作用。
亚细胞定位显示，BACE2蛋白主要定位在细胞膜，这与其生物信息学预测的结构特性一致。在哺乳动物中，BACE2属于β-分泌酶家族，作为跨膜蛋白表达于细胞膜上，适于与胞外基质中的底物蛋白相互作用[27-28]。结合其相对定量及原位杂交定位结果，推测BACE2可能参与肠道的消化功能，通过裂解特定蛋白质以进行消化或维持肠道环境稳态，肠道上皮细胞膜上的一些酶类和转运蛋白也具有类似作用[29]，BACE2在细胞膜上的分布表明其可能与膜表面底物蛋白如黏附蛋白、肠道相关酶前体的裂解加工相关。
本研究预测了BACE2的理化性质，验证了bace2基因在绿尾唇鱼肠道组织中的位置和在细胞中的定位，推测BACE2蛋白在绿尾唇鱼肠道中发挥蛋白质水解功能。
4 结论(1) 绿尾唇鱼bace2基因开放阅读框长度为1 530 bp，编码509个氨基酸，在不同物种中较为保守，BACE2蛋白是一种跨膜蛋白，主要功能域位于膜外。
(2) 绿尾唇鱼bace2基因在肠道中的相对表达量最高，且在小肠绒毛和隐窝区域广泛表达，其表达主要定位于细胞膜，推测BACE2蛋白在肠道中发挥蛋白质水解功能，参与食物蛋白质的水解过程。
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