2025, Vol. 55
2. 中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100
近年来，随着水污染和水体富营养化问题的加剧，污水处理的重点已从以往单纯去除有机物，转变为同步去除碳与含氮化合物的综合模式[1-2]。含氮化合物主要通过生物处理技术去除，因此，生物脱氮工艺是当今污水处理领域的研究热点之一[3]。传统的生物脱氮工艺一般包括硝化和反硝化两个阶段，通常需要两个独立反应器提供不同氧化还原条件，来满足生物脱氮过程中的好氧硝化和缺氧反硝化过程。然而，传统活性污泥法工艺往往占地面积大，投资成本高[4]，相比之下，SBR够在单一反应器内实现从好氧到缺氧的条件转换，从而完成硝化和反硝化过程，具有占地面积小、运行灵活的优势，可以弥补传统生物脱氮工艺的不足，现已在国内外获得广泛应用[5-6]。在SBR脱氮过程中，氨(NH4+-N)在好氧条件下被氧化成亚硝酸盐(NO2--N)，进一步被氧化成硝酸盐(NO3--N)，NO3--N在缺氧条件下被逐步还原成氮气。在脱氮过程中，溶解氧、pH值和温度等参数变化均会影响SBR的脱氮性能，而稳定的脱氮性能是SBR在实际应用至关重要的前提条件[7]。
传统的SBR工艺的曝气阶段通常采用连续曝气的方式，改变好氧/缺氧交替次数可以调整SBR的曝气方式转变为间断曝气，以提高SBR工艺的处理性能[8]。好氧/缺氧交替次数是指SBR单个运行周期内，通过控制曝气方式而实现好氧与缺氧条件相互切换的次数。交替次数的变化会改变SBR中溶解氧(DO)浓度，由于硝化菌和反硝化菌对DO的要求不同，完全硝化通常在溶氧高于5 mg/L时发生，而反硝化过程的溶解氧浓度需要低于0.5 mg/L。因此，SBR中不适宜的DO浓度对硝化和反硝化过程都会造成负面影响[9]。好氧/缺氧交替次数的变化还会影响有机物在硝化过程中的消耗和SBR中NH4+-N的转化过程，从而影响后续的反硝化效率[10]。此外，提高好氧/缺氧交替次数能够通过抑制亚硝酸盐氧化菌的活性，进而实现SBR的短程硝化。短程硝化过程只需要将NH4+-N氧化成NO2--N，随后便可与厌氧氨氧化构建组合工艺强化脱氮效果[11]。因此，好氧/缺氧交替次数的变化对SBR中氮转化过程有着极为关键且多维度的影响。然而，目前尚无研究表明好氧/缺氧交替次数的提高对SBR的脱氮性能以及微生物群落演替和氮转化功能基因的影响。
因此，本研究考察了好氧/缺氧交替次数由1增加至4对SBR活性污泥系统污染物去除性能和脱氮相关酶活性的影响，利用宏基因组测序技术分析了不同好氧/缺氧交替次数下活性污泥中氮转化相关的微生物和功能基因的丰度变化，明确SBR氮转化过程，研究结果可为SBR工艺在含氮废水处理中的运行参数优化提供理论支持。
1 实验材料与方法 1.1 接种污泥及水质SBR的接种污泥来自山东省青岛市某市政污水处理厂，混合液悬浮固形物(MLSS)为4 000 mg/L；反应器进水根据生活污水人工配制，组分如下：512.8 mg/L乙酸钠(CH3COONa)，152.84 mg/L氯化铵(NH4Cl)，8.78 mg/L磷酸二氢钾(KH2PO4)和1 mL/L微量元素溶液；微量元素组成为H3BO3(1.0 g/L)，CuSO4·5H2O(1.0 g/L)，AlCl3·6H2O(1.8 g/L)，NiCl2·6H2O(1.8 g/L)，MnSO4·H2O(1.0 g/L)，CoCl2·6H2O(1.0 g/L)和ZnSO4·7H2O(1.0 g/L)。在整个运行阶段进水COD和NH4+-N的浓度分别为(397.1±1.8)和(39.1±1.0) mg/L。
1.2 实验装置及运行条件在本实验中，采用有机玻璃制成的实验室规模的SBR(见图 1)，其高度为55 cm，内径为14 cm，有效容积7.7 L，体积交换比为50%。运行时间由时间控制器控制，每天运行3个周期，每周期运行8 h。在好氧/缺氧交替次数为1时的每个运行周期包括5 min进水、4.5 h曝气，停止曝气3 h，20 min沉降和5 min出水。溶解氧在好氧阶段大于2.0 mg/L，在缺氧阶段小于0.5 mg/L。保持曝气强度、总曝气时间不变的前提下，调整单次曝气的时长使交替次数为2时的SBR运行顺序为进水5 min，曝气135 min，停止曝气90 min后再曝气135 min。交替次数为3时的SBR运行顺序为进水5 min，曝气90 min，停止曝气60 min后再次曝气90 min，暂停60 min后最后曝气90 min。同理，好氧/缺氧交替次数为4时的SBR运行顺序如表 1所示。
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图 1 SBR装置示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the SBR |
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表 1 不同好氧/缺氧交替次数下的运行条件 Table 1 Operating conditions under different aerobic/hypoxia alternation number |
COD、氨氮(NH4+-N)、硝酸盐氮(NO3--N)、亚硝酸盐氮(NO2--N)、混合液悬浮固体浓度(MLSS)和混合液挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)均采用标准方法测定[12]。分别在第25、38、53和67天对反应器一个运行周期(8 h)内的COD、NH4+-N、NO3--N和NO2--N浓度指标进行监测，将完成进水时作为起始监测点，每隔半小时重复测定以上指标，直至该运行周期结束，以此考察在不同好氧/缺氧交替次数下SBR反应器中DO、COD、NH4+-N、NO3--N和NO2--N在运行周期内随运行时间的浓度变化。在反应器运行的第25、38、53和67天时，从SBR中收集40 mL均匀状态下的活性污泥样品用于后续氮转化速率和酶活性分析。活性污泥样品在以7 000 g离心力高速离心后去除上清液，并将剩余的污泥与350 mL合成废水在锥形烧瓶和血清小瓶中混合。比耗氧速率(SOUR)、比氨氧化速率(SAOR)、比亚硝酸盐氧化速率(SNOR)、比硝酸盐还原率(SNRR)和比亚硝酸盐还原率(SNIRR)根据前人的研究进行测定[13]。经0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)洗涤酶活性待测的活性污泥样品后，将污泥样品进行超声(20 kHz，4 ℃，5 min)和高速离心(12 000g，10 min)，从上清液中获得提取物用于测定氮转化相关酶活性。与氮转化有关酶包括氨单加氧酶(AMO)、亚硝酸盐氧化还原酶(NOR)、硝酸盐还原酶(NR)和亚硝酸盐还原酶(NIR)的活性测定方法参考文献[14]。
在第25、38、53和67天，采集SBR活性污泥样品(分别命名为Z1、Z2、Z3和Z4)，使用PowerSoil DNA分离试剂盒(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)提取样品DNA。DNA提取后共生成34.2 GB的原始数据。然后使用Readfq对原始数据进行预处理，获取用于后续分析的有效数据。随后，Illumina PE150进行宏基因组测序。使用MEGAHIT软件(V1.0.4-beta)组装分析有效数据。在分类预测方面，使用DIAMOND软件将基因与京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行对比和功能注释[15-16]。为了进一步评估基因的功能和转化途径，通过检索KEGG orthology(KO)编号，鉴定氮转化途径功能基因。不同交替次数下的SOUR、氮转化速率和氮转化酶活性实验测量均重复三次。使用SPSS-26.0与好氧/缺氧交替次数为1时的上述实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，显著性水平p < 0.05，数据结果表示为平均值±标准差。
2 结果与讨论 2.1 好氧/缺氧交替次数变化对SBR有机物去除和脱氮性能的影响不同好氧/缺氧交替次数下SBR的COD和含氮化合物的去除性能如图 2所示。当进水COD浓度为(397.1±1.8) mg/L时，好氧/缺氧交替次数从1次增加到4次，COD去除率保持在(94.9±1.1)%，COD的去除率受好氧/缺氧交替次数的增加影响较小(见图 2(a))。当进水NH4+-N浓度为(39.1±1.0) mg/L时，好氧/厌氧交替次数从1增加到4，NH4+-N去除率分别为(98.9±0.7)%、(99.4±0.4)%、(99.0±0.4)%和(98.4±0.7)%，这说明好氧/缺氧交替次数的变化对SBR和NH4+-N的去除作用并无明显影响(见图 2(b))。同时，在好氧/缺氧交替次数为1、2、3和4时，SBR平均出水中NO3--N和NO2--N浓度分别为4.4和0.0 mg/L、5.0和0.0 mg/L、4.7和0.8 mg/L、4.3和1.3 mg/L(见图 2(c))。由图 1可知，好氧/缺氧交替次数的增加，SBR中NO2--N逐渐积累，说明好氧/缺氧交替次数的增加对SBR的NO2--N转化能力产生了抑制作用。
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((a)COD；(b)NH4+-N; (c)NO2--N和NO3--N.) 图 2 不同好氧/缺氧交替次数下进水和出水中COD及氮化合物浓度的变化 Fig. 2 Variations of COD and nitrogen compound concentration in the influent and effluent under different aerobic/hypoxia alternation number |
SBR以不同好氧/缺氧交替次数运行时，其运行周期内COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和DO的浓度变化情况如图 3所示。当好氧/缺氧交替次数为1时，SBR内COD在90 min内被迅速消耗，曝气90 min后，DO升至4.0 mg/L左右。在有机物被快速消耗的过程中，NH4+-N浓度也在持续下降。SBR内DO升至4.0 mg/L左右时，NH4+-N浓度的下降至最小值，这直观反映了DO浓度对NH4+-N转化的重要性。同时，NO3--N浓度随NH4+-N浓度的降低而增加，当NH4+-N浓度降至最低时，NO3--N浓度达到最大值。停止曝气后，反应器DO迅速降至0.5 mg/L以下，这给SBR提供了缺氧环境。在整个运行周期内，NO2--N几乎未出现积累，表明了此交替次数下的SBR具有更好地NO2--N氧化还原能力。当好氧/缺氧交替次数为2时，各污染物与DO浓度随时间变化趋势在140 min内与交替次数为1时相似。第一次曝气结束后，NO3--N浓度开始下降，NO2--N开始出现积累。第二次曝气开始后，DO迅速升至4.0 mg/L，NH4+-N浓度下降速度加快，低浓度的COD可能是导致DO浓度快速增加的原因。再次停止曝气后，DO浓度在30 min内未能降至0.5 mg/L，这可能会影响反硝化的还原过程。交替次数为3时，第一次曝气期间DO浓度最大值为2.9 mg/L。在第二次曝气期间，DO浓度迅速升高至3.6 mg/L，NO2--N开始出现积累。第二次曝气结束后，NO2--N浓度迅速升至4.7 mg/L，NO3--N浓度同时下降。第三次曝气期间，NO2--N未能全部氧化为NO3--N，由此推测SBR的NO2--N氧化能力有所下降。当交替次数为4时，在SBR好氧和缺氧阶段均出现了NO2--N积累现象，尤其在第四次曝气初始运行(360 min)时，NO2--N积累浓度达到最大值2.7 mg/L。好氧/缺氧交替次数的增加降低了曝气的持续时间，使曝气期间DO浓度基本在3.0 mg/L左右，这可能不利于NO2--N的进一步氧化。同时，好氧/缺氧交替次数的增加使DO浓度未能及时降低至0.5 mg/L以下，影响反硝化环境，抑制了NO2--N的还原，造成出水中NO2--N积累。
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图 3 不同好氧/缺氧交替次数下SBR运行周期内的COD及氮化合物的浓度变化 Fig. 3 Variations in COD and nitrogen compound concentration during the operation cycle of SBR under different aerobic/hypoxia alternation numbers |
为进一步分析好氧/缺氧交替次数对SBR氧气利用情况和氮转化速率的影响，分别考察了反应器在不同好氧/缺氧交替次数下耗氧速率与NH4+-N、NO2--N和NO3--N转化速率，包括SOUR、SAOR、SNOR、SNRR和SNIRR，如图 4所示。与好氧/缺氧交替次数为1时相比，好氧/缺氧交替数为2、3和4时的SOUR分别增加了17.0%、33.1%和52.3%(见图 4(a))。SOUR是评价微生物降解有机物的重要指标[17-18]，SOUR随交替次数的变化而逐渐增加，这表明活性污泥中微生物加速了对DO的消耗，可能导致SBR的DO浓度不满足硝化过程的需求。SOUR的增加也表明好氧/缺氧交替次数的提升加快了好氧微生物对有机物的消耗，这可能会减少反硝化过程所需要的有机物，导致SBR反硝化能力下降[19]。与好氧/缺氧交替数为1时相比，SAOR在交替次数为2、3和4时与分别增加了8.1%、22.5%和30.8%(见图 4(b))。SAOR是衡量氨氧化菌活性和NH4+-N转化效率的重要指标，SAOR的变化表明交替次数增加可能增强了活性污泥中氨氧化菌的活性，促进了SBR对NH4+-N转化。然而，SBR好氧/缺氧交替次数的增加降低了SNOR，与交替次数为1时相比，在交替次数为2、3和4时的SNOR分别下降了35.3%，47.2%和55.6%。交替次数的增加明显抑制了NO2--N的氧化过程，硝化阶段NO2--N的逐渐积累证明了这一观点(见图 3(d))。
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(((a)比耗氧速率，表示每小时每克MLVSS消耗的溶解氧量；(b)比氨氧化速率和比亚硝酸盐氧化速率，它们分别表示每小时每克MLVSS氧化NH4+-N和NO2--N的量；(c)比硝酸盐还原速率和比亚硝酸盐还原速率，它们分别表示每小时每克MLVSS还原NO3--N和NO2--N的量。“*”表示与好氧/缺氧交替次数为1时相比具有显著性差异(p < 0.05), 误差线表示三次实验测量值的标准差(n=3)。(a) SOUR, which represents the dissolved oxygen consumption per gram of MLVSS per hour; (b) SAOR and SNOR, which respectively represent the amount of NH4+-N and NO2--N oxidized per gram of MLVSS per hour; (c) SNRR and SNIRR, which respectively represent the amount of NO3--N and NO2--N reduced per gram of MLVSS per hour.The "*" indicates a statistically significant difference compared to 1 aerobic/anoxic cycle (p < 0.05); Error bars show standard deviation (n=3).) 图 4 不同好氧/缺氧交替次数下耗氧速率和氮转化速率的变化 Fig. 4 Variations of SOUR and nitrogen transformation rates under different aerobic/hypoxia alternation number |
如图 4(c)所示，与好氧/缺氧交替数为1时的NO3--N和NO2--N还原速率相比，好氧/缺氧交替数为2、3、4时SNRR和SNIRR分别降低了26.6%和17.5%，34.9%和35.4%，39.6%和40.4%。SBR好氧/缺氧交替次数由1增加至4的过程可能降低了硝酸盐还原菌活性，削弱了SBR对NO3--N的还原能力，从而阻碍了SBR的反硝化进程。SNIRR的降低解释了NO2--N在缺氧阶段逐渐积累的原因，好氧/缺氧交替次数的增加削弱了SBR的NO2--N还原能力，降低了亚硝酸盐还原菌在缺氧段的还原活性。在对运行周期DO浓度变化的分析中，好氧/缺氧交替次数的增加导致缺氧段的DO浓度升高，这可能是影响SBR缺氧段NO3--N和NO2--N还原的原因(见图 3(d))。
2.3 好氧/缺氧交替次数变化对氮转化相关酶活性的影响在SBR氮转化的过程中，活性污泥中的与氮转化相关酶的活性直接影响氮转化速率。因此，本研究考察了好氧/缺氧交替次数的增加对SBR活性污泥中氮转化酶活性的影响，包括AMO、NOR、NR和NIR活性。如图 5(a)所示，好氧/缺氧交替次数由1增加到4增加了AMO活性。与好氧/缺氧交替次数为1时相比，交替次数为2、3和4时的AMO活性分别提高了10.6%、18.3%和28.3%。AMO可以催化氨氧化为羟胺(NH2OH)，是氨氧化过程中关键步骤，AMO活性的变化反映了好氧/缺氧交替次数由1增加到4加强了SBR的NH4+-N的氧化能力，这解释了SAOR增加的原因。好氧/缺氧交替次数的增加降低了NOR活性，NOR活性在交替次数为2、3和4时，与交替次数为1时相比分别下降了12.7%、40.4%和57.4%。NOR以NO2--N为特异性底物，将其氧化为NO3--N，其活性的降低减少对NO2--N的利用，NO2--N在曝气阶段的利用率降低，无法完全转化为NO3--N，这解释了硝化阶段NO2--N出现的积累(见图 3(d))。
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(“*”表示与好氧/缺氧交替次数为1时相比具有显著性差异(p < 0.05), 误差线表示三次实验测量值的标准差(n=3)。The "*" indicates a statistically significant difference compared to 1 aerobic/anoxic cycle (p < 0.05); Error bars show standard deviation (n=3).) 图 5 不同好氧/缺氧交替次数下氮转化酶活性的变化 Fig. 5 Variations of nitrogen transformation enzymatic activities under different aerobic/hypoxia alternation number |
如图 5(b)所示，好氧/缺氧交替次数由1增加到4，NR和NIR活性出现了不同程度的下降，对应相应的SNRR与SNIRR的降低(见图 4(c))。与好氧/缺氧交替次数为1时相比，交替次数为2、3和4时，NR和NIR活性分别降低了8.4%和8.1%，23.7%和36.2%，30.9%和48.7%。NR和NIR被认为是参与反硝化过程中的必需酶，分别催化NO3--N和NO2--N的还原[20]。NIR活性的降低反映了缺氧阶段NO2--N还原能力的下降，减少了微生物对NO2--N底物的利用，从而降低了SNIRR，致使NO2--N缺氧阶段的积累，加剧了SBR出水中NO2--N浓度的增加。好氧/缺氧交替次数增加也抑制了NR活性，削弱了缺氧段SBR对NO3--N的还原，降低了SNRR，这可能与缺氧段DO浓度的增加有关。
2.4 好氧/缺氧交替次数变化对微生物群落的影响为了探究好氧/缺氧交替次数变化对SBR中微生物群落的影响，进行了宏基因组测序分析。好氧/缺氧交替次数分别为1、2、3和4时，测序结果命名为Z1、Z2、Z3和Z4。图 6(a)显示了微生物群落在门水平上的动态演替Proteobacteria为优势微生物群，其相对丰度从第25天的50.10%上升到第67天的53.97%。先前的研究证明，变形菌门中含有大量负责氮转化的细菌[21]。Proteobacteria中包含氨氧化细菌，Proteobacteria的相对丰度的增加可能与氨氧化细菌的丰度变化有关[22-23]。Chloroflexi和Bacteroidota在SBR废水的处理系统中很常见，据报道它们具有降解有机物和反硝化能力[24-25]。好氧/缺氧交替次数由1增加至4使Chloroflexi和Bacteroidota的相对丰度分别从8.64%和6.58%下降到5.93%和2.94%。Chloroflexi和Bacteroidota的相对丰度的下降可能会减弱SBR反硝化能力。
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((a)门水平, (b)属水平, (c)氮转化功能菌。(a) Phyla level; (b) Genus level; (c) Nitrogen-transforming bacteria.) 图 6 不同好氧/缺氧交替次数下微生物群落的动态变化 Fig. 6 Dynamic changes of microbial communities under the different aerobic/hypoxia alternation number |
在好氧缺氧交替次数由1增加到4的过程中，前50个优势微生物属的群落演替特征如图 6(b)所示。在好氧/缺氧交替次数变化前，优势菌属为Thiothrix(5.09%)、Candidatus Competibacter(4.35%)、Candidatus Contendobacter(3.55%)、Hyphomicrobium (1.68%)、Candidatus Promineofilum(0.77%)，其次为Bradyrhizobium(0.76%)、Defluviimonas (0.53%)、Candidatus Viadribacter(0.39%)和Defluviicoccus(0.35%)。氨氧化菌(AOB)Nitrosomonas的相对丰度在SBR好氧/缺氧交替次数为1和4时分别为0.08%和0.13%。好氧/缺氧交替次数的增加刺激了Nitrosomonas的生长，从而加快了NH4+-N的氧化。Nitrospira的相对丰度在SBR好氧/缺氧交替次数为1和4时分别为0.19%和0.07%。Nitrospira是典型的亚硝酸盐氧化菌(NOB)，可以在将NO2--N氧化为NO3--N。好氧/缺氧交替次数的增加降低了Nitrospira的相对丰度，抑制了Nitrospira的活性，阻碍NO2--N的氧化，导致NO2--N在硝化阶段积累[26]。在SBR的好氧/缺氧交替次数为1和4时，反硝化菌Hyphomicrobium和Defluviicoccus的相对丰度分别为1.68%、0.53%和0.81%、0.29%。好氧/缺氧交替次数由1增加到4，降低了Hyphomicrobium和Defluviicoccus的相对丰度，抑制了Hyphomicrobium和Defluviicoccus的生长生殖，这可能会降低SBR对NO3--N和NO2--N的还原能力[27-29]。有研究表明，Rubrivivax相对丰度与NO3--N浓度呈显著负相关，Rubrivivax有益于NO3--N的转化[30]。在好氧/缺氧交替次数由1增加到4，Rubrivivax相对丰度从0.20%连续下降至0.12%，这种变化趋势与Hyphomicrobium和Defluviicoccus相似，会进一步削弱对NO3--N的还原。
为进一步深入探究好氧/缺氧交替次数对SBR活性污泥中的氮转化菌的影响，本研究分析了氮转化相关菌属在不同好氧/缺氧交替次数下的相关丰度变化。如图 6(c)所示，宏基因检测到的AOB有Nitrosomonas、Nitrosococcus和Nitrosospira。除Nitrosomonas之外，好氧/缺氧交替次数的增加也促进了Nitrosospira的增长，而Nitrosococcus的相对丰度受交替次数变化的影响较小。样本检测出的NOB有Nitrospira、Nitrobacter和Nitrococcus。好氧/缺氧交替次数的增加抑制了上述NOB的生长[31]。根据先前的研究，同样好氧/缺氧交替次数的增加时，AOB和NOB会表现出明显的差异[32-33]。受到DO浓度变化的影响后，AOB的恢复速度比NOB快得多。因此，交替次数的增加会普遍抑制NOB的活性和生长，这解释了SBR中NO2--N氧化性能下降的原因[34-35]。Hyphomicrobium、Rhodobacter和Paracoccus等反硝化菌的相对丰度在交替次数的连续变化中普遍降低，Pseudomonas和Dechloromonas的相对丰度没有出现明显的变化。不同的反硝化菌对好氧/缺氧交替次数连续变化的适应性不同，但Hyphomicrobium等优势反硝化菌丰度的降低加剧了NO2--N的积累。
2.5 好氧/缺氧交替次数变化对氮代谢通路的影响为了进一步探究好氧/缺氧交替次数的增加对SBR氮转化酶的相关丰度的影响，根据氮代谢的KEGG通路图(map00910)，本研究比较了不同好氧/缺氧交替次数下的氮转化酶的相对丰度。如图 7(a)所示，硝化-反硝化脱氮过程主要包括：NH4+-N在氨单加氧酶(EC: 1.14.99.39)的催化下氧化为NH2OH，通过羟胺脱氢酶(EC: 1.7.2.6)进一步氧化生成NO2--N，在亚硝酸盐氧化酶(EC 1.7.99.-)催化下氧化为NO3--N。随后NO3--N在硝酸盐还原酶, 包括膜结合硝酸盐还原酶(EC 1.7.99.-)和周质硝酸盐还原酶(EC 1.9.6.1)、亚硝酸盐还原酶(EC 1.7.2.1)、NO还原酶(EC 1.7.2.5)和N2O还原酶(EC 1.7.2.4)的作用下逐步还原为NO2--N、一氧化氮(NO)和氧化亚氮(N2O)，最终生成为氮气[36]。由图 7(d)所示，在好氧/缺氧交替次数由1增加到4时，参与氨氧化过程的氨单加氧酶和羟胺脱氢酶的相对丰度没有发生明显变化。NOR的相对丰度在SBR好氧/缺氧交替次数为1和4时分别为0.11%和0.07%。好氧/缺氧交替次数的增加抑制了NOB的生长，抑制了编码NOR相关基因的表达，降低了NOR丰度，减少了硝化过程中对底物NO2--N的利用，导致NO2--N逐渐积累。好氧/缺氧交替次数增加降低了膜结合硝酸盐还原酶和周质硝酸盐还原酶的丰度，这会削弱SBR对NO3--N的还原作用。NIR的相对丰度在SBR好氧/缺氧交替次数为1和4时分别为0.02%和0.01%，好氧/缺氧交替次数的增加阻碍了NO2--N的还原。NIR丰度的降低加剧了NO2--N在出水中的积累。同时，在SBR好氧/缺氧交替次数为4时的NO还原酶和N2O还原酶相对丰度均出现了不同程度的下降，好氧/缺氧交替次数的增加也阻碍了NO和N2O的还原，这可能会导致NO和NO2在反应器中积累。
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((a)硝化-反硝化途径, (b)硝酸盐异化还原, (c)硝酸盐同化还原；(d)氮转化相关酶相对丰度。(a) The nitrification and denitrification pathway; (b) Dissimilatory nitrate reduction; (c) Assimilatory nitrate reduction; (d) The relative abundance of enzymes related to nitrogen transformation.) 图 7 不同好氧/缺氧交替次数下氮代谢途径中酶的相对丰度 Fig. 7 The relative abundance of enzymes of the nitrogen metabolic pathway under the different aerobic/hypoxia alternation number |
根据图 7(b)所示，参与硝酸盐异化还原(DNRA)途径的相关酶包括：将NO3--N还原为NO2--N的硝酸盐还原酶(EC 1.7.99.-、EC 1.7.5.1和EC 1.9.6.1)，将NO2--N进一步还原为NH4+-N的亚硝酸盐还原酶(EC 1.7.2.2和EC 1.7.1.15)。由图 7(d)所示，好氧/缺氧交替次数由1增加至4，EC 1.7.5.1的相对丰度由0.07%增加至0.11%，这与其他类型的硝酸盐还原酶(EC 1.7.99.-和EC 1.9.6.1)表现不同。EC 1.7.5.1丰度的增加促进了DNRA的NO3--N还原，增大了DNRA对NO3--N还原的贡献。好氧/缺氧交替次数的增加降低了EC 1.7.2.2的丰度，阻碍了DNRA中NO2--N还原，加剧了NO2--N的积累。不仅如此，好氧/缺氧交替次数的增加显著降低了硝酸盐同化还原反应(ANR)中的EC 1.7.7.2丰度，减少了活性污泥微生物对NO3--N的同化。通过对DNRA和ANR过程氮转化酶丰度的分析，明确了好氧/缺氧交替次数的增加同样也会影响NO3--N还原成NH4+-N[37]。
2.6 好氧/缺氧交替次数变化对氮代谢功能基因的影响好氧/缺氧交替次数变化对SBR活性污泥的氮转化相关酶的活性和相对丰度均产生了不同程度的影响，为了探究这种影响产生的原因，本研究分析氮代谢途径的功能基因在不同交替次数下的相对丰度变化(见图 8)。首先，参与硝化过程的功能基因包括amoA/B/C、hao和nxrA/B，它们分别编码氨单加氧酶、羟胺脱氢酶和亚硝酸盐氧化还原酶[38]。反硝化过程的功能基因包括编码膜结合硝酸盐还原酶(narG、narH和narI)、周质硝酸盐还原酶(napA和napB)、含铜亚硝酸盐还原酶(nirK)、细胞色素cd1亚硝酸盐还原酶(nirS)、一氧化氮还原酶(norB和norC)和一氧化二氮还原酶(nosZ)的基因[39]。如图 8(a)所示，负责AMO合成的基因amoA、amoB和amoC在SBR运行至第38、53和67天的相对丰度略高于第25天，这保障了AMO的合成和NH4+-N的氧化。相对于好氧/缺氧交替次数为1时，基因nxrA和nxrB的相对丰度在SBR好氧/缺氧交替次数为4时的相对下降率分别为27.32%和19.23%(见图 8(b))。nxrA/B的下降会阻碍NOR的合成，降低NOR活性，抑制NO2--N的氧化过程，导致NO2--N积累[40]。与好氧/缺氧交替次数为1时相比，编码膜结合硝酸还原酶的基因narG、narH和narI的相对丰度在交替次数为4时相对下降率分别为27.32%、19.23%和2.04%。好氧/缺氧交替次数的增加也降低了编码周质硝酸还原酶的基因napA、napB和napC的相对丰度，与好氧/缺氧交替次数为1时相比，交替次数为4时napA、napB和napC丰度的相对下降率分别为6.36%、9.25%和30.67%。nar系列与nap系列基因丰度的普遍下降会阻碍NR的合成，抑制NO3--N的还原过程。NO2--N还原为NO是反硝化过程中的关键步骤，此过程涉及由nirK基因编码的含铜亚硝酸盐还原酶和由nirS基因编码的细胞色素cd1亚硝酸盐还原酶[41]。与好氧/缺氧交替次数为1时相比，在交替次数为4时的nirK和nirS丰度相对下降率分别为18.88%和27.86%，这会阻碍NIR的合成，加剧NO2--N的积累。与好氧/缺氧交替次数为1时相比，在交替次数为4时，负责编码合成NO还原酶和N2O还原酶的基因norB、norC和nosZ的丰度的相对下降率分别为22.44%、9.40%和21.55%，交替次数的增加抑制NO和N2O的还原过程。另外，如图 8(c)所示，当好氧/缺氧交替次数由1增至4时，氮同化功能基因(glnA、gltB/D)的相对丰度保持稳定，glnA相对丰度在0.10%~0.11%范围内，gltB/D相对丰度约0.07%。glnA、gltB/D基因分别编码谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)，若氮同化作用主导NH4+-N的转化，则glnA与gltB/D的丰度应同步增加以维持代谢，然而其丰度未随好氧/缺氧交替次数的增加而明显变化，表明活性污泥中微生物群落未通过增强氮同化作用以增强对NH4+-N的转化能力。同时，glnA与gltB/D的相对丰度(< 0.12%)远低于参与硝化反硝化途径的功能基因，反映活性污泥微生物更倾向于通过硝化反硝化途径完成脱氮，因此氮同化途径不作为NH4+-N的去除的主要途径。
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((a)氨氧化功能基因, (b)反硝化功能基因, (c)氮同化功能基因, (d)参与DNRA亚硝酸盐还原的基因。(a) Ammonia-oxidizing functional genes; (b) Denitrification functional genes; (c) Nitrogen assimilation functional genes; (d) Genes involved in the nitrate reduction of DNRA.) 图 8 不同好氧/缺氧交替次数下氮转化功能基因的相对丰度 Fig. 8 The relative abundance of functional genes for nitrogen transformation under the different aerobic/hypoxia alternation number |
为进一步明确造成缺氧阶段NO2--N逐渐积累的原因，本研究分析了在不同好氧/缺氧交替次数下，硝酸盐异化还原反应中编码亚硝酸盐还原酶的功能基因的相对丰度变化，包括nirB、nirD、nrfA和nrfH。由图 8(d)所示，好氧/缺氧交替次数由1增加至3降低了nrfA和nrfH的相对丰度，好氧/缺氧交替次数由3增加至4一定程度上恢复了nrfA和nrfH的丰度。在交替次数为4时，NO2--N在缺氧阶段的高浓度积累可能刺激了DNRA过程的NO2--N还原，通过增加nrfA和nrfH的丰度以促进NIR的生成，EC 1.7.2.2在好氧/缺氧交替次数为4时丰度的恢复则印证了这一观点。nrfA和nrfH丰度的恢复促进了SBR缺氧阶段中NO2--N的转化，缓解了NO2--N的积累。同时，好氧/缺氧交替次数由1增加至3同样降低了编码亚硝酸盐还原酶EC 1.7.1.15的nirB丰度，这加剧了NO2--N的积累。好氧/缺氧交替次数由3增加至4，nirB和nirD相对丰度的增加则进一步印证了在好氧/缺氧交替次数为4时，DNRA的亚硝酸盐还原过程一定程度上缓解了NO2--N累积。
3 结语本研究系统考察了好氧/缺氧交替次数的增加对SBR的有机物和氮转化性能的影响，当好氧/缺氧交替次数由1增加到4时，SBR出水中中NO2--N逐渐积累。交替次数的增加降低了SNOR、SNRR和SNIRR，相应NO2--N转化酶(NOR和NIR)和NO3--N还原酶NR的活性也随之降低。宏基因组测序结果显示，好氧/缺氧交替数的增加显著影响微生物的多样性和氮转化菌丰度，显著降低了参与NO2--N和NO3--N转化的亚硝酸盐氧化菌Nitrospira和反硝化菌Hyphomicrobium和Defluviicoccus的丰度。同时，交替次数的增加降低了亚硝酸盐氧化还原过程的亚硝酸盐氧化还原酶(如EC 1.7.99.-和EC 1.7.2.1)的丰度和编码亚硝酸盐氧化还原酶的功能基因(如nxrAB、nirK和nirS)的丰度，NR和相关基因也受到了交替次数变化的影响, 好氧/缺氧交替次数的增加显著削弱了SBR的NO2--N氧化还原能力。
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